一种用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明属于无机纳米材料和生物传感器领域，公开了一种用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层及其制备方法与应用。本发明通过喷涂法在不同基底上制备具有特定的埃洛石纳米结构，并固定上目标细胞特异性识别分子，或者直接利用粗糙的纳米结构，利用细胞表面结构与基底粗糙纳米结构之间增强的三维拓扑相互作用，纳米粗糙结构比光滑表面可以固定更多的目标细胞的识别分子，以及基于纳米粗糙表面的结构能降低血液中流体的流动速度从而增加与细胞的相互作用机会，从而提高埃洛石纳米结构的细胞捕获效率，对多数肿瘤细胞的3h的捕获率超过80％。该方法操作简单、能耗低、制备效率高，而且整个基底的制备过程无有毒有害物质产生，对环境无污染。
【专利说明】
一种用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层及其制备方法与应用
技术领域
[0001]本发明属于无机纳米材料和生物传感器领域，特别涉及一种用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]癌症是目前世界上威胁人类健康及生命的重大疾病之一。癌症难治愈、致死率高的最主要原因是存在癌转移，超过90%癌症病人的死亡跟肿瘤细胞的转移直接相关。在癌转移过程中，原发上皮肿瘤的癌细胞会脱落并入侵进入循环血液系统。随着血液循环在其他组织和器官位置生长成新的肿瘤组织(转移灶)，这种存在于循环血液中的癌细胞被称为循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells ,CTCs)。检测循环血液中的CTCs的存在及数目变化，是一种非破坏性、非侵入式和有效的癌转移监控、癌症预后判断手段，对癌症的体外诊断、个性化治疗和病理学研究等都具有很重要的意义。特别是近年来发现，CTCs在癌症早期实体肿瘤未形成前就已经在血液中存在，因此准确地检测血液中CTCs可以作为早期癌症筛查、监测癌症进展以及患者对治疗的应答情况的可靠手段，为患者赢得较多的存活机会。但是在肿瘤患者的外周血中CTCs的数量很少，很难通过特定的手段将其从血液中分离出。
[0003]纳米技术迅速发展为肿瘤的早期诊断带来曙光。纳米材料偶联上特殊的抗体能够特异性地与肿瘤细胞结合，进而从血液中特异性地分离出肿瘤细胞，这种方法可以作为癌症诊断和转移监监控的可靠手段。由于肿瘤细胞的尺寸和表面结构不同于外周血中的血液细胞，因此某些粗糙的纳米表面结构的表面即使不偶联抗体，也能通过纳米陷阱的方式捕获肿瘤细胞，进而更加简便快捷地进行癌症诊断。
[0004]埃洛石纳米管是自然界中形成的一维纳米材料，具有独特而完美的纳米级管状结构，其化学式为Al2Si2O5(OH)4.H2O,是一种无机硅铝酸盐矿物。埃洛石管内径尺寸范围是10?30nm，外径尺寸为40?70nm，而长度为0.2?2μηι。与其他一维纳米材料相比，埃洛石于构筑生物检测表面构筑的优势是:①埃洛石具有适合制备细胞捕获分离表面的尺寸和结构，其直径约为50nm，长径比约为20;并且埃洛石的亲水性好，能在生理溶液和血液中稳定分散和存在;②埃洛石表面具有硅铝羟基等活性基团可进行多种功能化修饰;③埃洛石的细胞亲和性好，具有很好的细胞相容性与细胞粘附性;④埃洛石价廉易得，方便进行推广应用，可以解决价格昂贵、原料来源限制、批次稳定性差等问题，成本优势明显。但是至今没有合适的技术方法能够快速制备埃洛石粗糙表面，以用于肿瘤细胞的特异捕获。
【发明内容】
[0005]为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层的制备方法。本发明利用喷涂法将埃洛石制备成粗糙表面，不仅可以有效的克服常见的直接溶液挥发干燥法制备埃洛石粗糙表面成型困难的缺点，也能克服用溶液涂覆塑料管造成涂层不均匀和附着力差的缺点，还能克服传统的纳米表面制备方法无法实现大面积制备的缺点，是一种新型的可用于肿瘤细胞捕获的埃洛石纳米粗糙表面的制造方法。喷涂法能够获得大面积的埃洛石表面，制备过程方便快捷，涂层与基底的附着力尚，涂层均勾，可重现性尚。
[0006]本发明另一目的在于提供上述方法制备的用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层。
[0007]本发明再一目的在于提供上述用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层在捕获肿瘤细胞和癌症早期诊断领域的应用。
[0008]本发明的目的通过下述方案实现:
[0009]—种用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层的制备方法，包括以下步骤:
[0010](I)制备埃洛石分散液:按质量份数计，取埃洛石0.0I?40份，去离子水O?99.9份，有机溶剂O?99.9份，硅烷0.001?5份，表面活性剂0.001?I份，混合，经机械搅拌或超声分散即得埃洛石分散液；
[0011](2)将步骤(I)制备得到的埃洛石分散液喷涂到预热的基材上，然后充分干燥，干燥后的涂层即为用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层；
[0012]或者，
[0013]重复步骤(I)和(2)，然后将步骤(2)中干燥后的涂层与肿瘤细胞的特异性识别抗体进行偶联，即得到抗体修饰的用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层。
[0014]步骤(I)中所述的有机溶剂可为乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氧六环、二氯甲烷或氯仿中的一种或多种的混合物。
[0015]步骤(I)中所述的硅烷可为γ -氨基丙基三乙氧基硅烷、γ -环氧基丙基三乙氧基硅烷、γ-巯丙基三甲氧基硅烷、γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷中的至少一种。
[0016]步骤(I)中所述的表面活性剂为聚苯乙烯磺酸钠、六偏磷酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、焦磷酸钠、柠檬酸钠中的至少一种。
[0017]步骤(I)中所述的去离子水和有机溶剂的用量不能同时为O。
[0018]步骤(I)中所述的超声分散的条件为在60?1000W功率下超声5?60min。
[0019]步骤(I)中所述的机械搅拌是指在50?1500rpm的速度下搅拌3?120min。
[0020]步骤(2)中所述的基材为载玻片、石英片、硅片、聚苯乙烯透明塑料片或金属片，所述的预热的温度为35?100°C。
[0021 ] 步骤(2)中所述的干燥是指在30?100°C下干燥0.5?600min。
[0022]所述的肿瘤细胞的特异性识别抗体可为上皮细胞粘附分子抗体ant1-EpCAM或人表皮生长因子ant1-HER2。
[0023]所述的偶联具体包括以下步骤:将干燥后的涂层在I?20yg/mL的抗体PBS溶液中浸泡3?30min，然后取出用磷酸盐缓冲液冲洗2-3次。
[0024]—种由上述方法制备得到的用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层。
[0025]上述的用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层具有捕获肿瘤细胞效率高、灵敏度高等特点，可用于在捕获肿瘤细胞和癌症早期诊断领域的应用。
[0026]所述的肿瘤细胞包括人乳腺癌细胞(MCF-7)、人前列腺癌细胞(PC-3)、人肝癌细胞(HePG2)、人结肠腺癌细胞(SW480)、人肺小细胞腺癌细胞(A549)、人卵巢癌细胞(H0-8910)、人脑胶质瘤细胞(U87)和人骨肉瘤细胞(SW1353)。
[0027]本发明的机理为:
[0028]通过在不同基底上制备具有特定的埃洛石纳米结构，并固定上目标细胞特异性识别分子(如上皮细胞粘附分子抗体，ant1-EpCAM)，或者直接利用粗糙的纳米结构，利用细胞表面结构与基底粗糙纳米结构之间增强的三维拓扑相互作用，纳米粗糙结构比光滑表面可以固定更多的目标细胞的识别分子，以及基于纳米粗糙表面的结构能降低血液中流体的流动速度从而增加与细胞的相互作用机会，是本发明制备的纳米结构能够提高细胞捕获效率的主要原因。
[0029]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果:
[0030]1、本发明提出一种喷涂法快速制备埃洛石纳米涂层的方法，造价低廉、操作简单、能耗低、制备效率高，整个基底的制备过程无有毒有害物质产生，对环境无污染，制备的涂层能用于循环肿瘤细胞的富集和检测。
[0031]2、本发明采用埃洛石纳米管来源广泛，价格便宜，无毒无害，环境友好，血液和细胞相容性好，易于在极性溶剂体系中分散和组装成阵列结构，方便地构建微纳米粗糙表面，从而可以固定更多的目标细胞的识别分子，以及降低血液中流体的流动速度从而增加与细胞的相互作用机会，使表面对肿瘤细胞具有高的捕获效率。
[0032]3、本发明制备的埃洛石涂层的稳定性好，与基底的附着力强，埃洛石表面的活性基团能够方便地进行疏水化处理和偶联肿瘤细胞的特异性识别抗体，从而特异性地从血液中捕获肿瘤细胞。
[0033]4、制备的涂层具有捕获肿瘤细胞效率高(3h的捕获率超过85%)、灵敏度高等特点，可用于癌症病人的临床诊断和转移监控。同时被该涂层捕获的肿瘤细胞活性高，可继续消化下来培养，可进行实时监测，对于肿瘤细胞的后续分析具有重要意义。
【附图说明】
[0034]图1为本发明实施例1中制备的抗体修饰的埃洛石涂层的表面原子力显微镜图。
[0035]图2为本发明实施例2中制备的在硅片上的埃洛石涂层和普通玻璃基底对人前列腺癌细胞PC-3的捕获效果比较图。
[0036]图3为本发明实施例3中制备的埃洛石涂层对各种细胞的捕获效果统计图；
【具体实施方式】
[0037]下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0038]实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。实施例中所用癌细胞、正常细胞也均可从市场常规购得。实施例中所述的份数均指质量份数。
[0039]实施例1
[0040]配制埃洛石的分散液，其中埃洛石2份，去离子水20份，乙醇80份，γ-氨丙基三乙氧基硅烷I份，表面活性剂聚苯乙烯磺酸钠0.5份，将上述组分经室温机械搅拌(400r/min，搅拌30min)混合均匀，用喷枪喷涂到经100°C预热的玻璃片上；将涂层在60°C充分挥发干燥，之后将埃洛石涂层浸泡到5yg/mL Ant1-EpCAM(购于Sigma-Aldrich公司)抗体的PBS溶液中，1min后取出用磷酸盐缓冲液冲洗3次，即得抗体修饰的埃洛石涂层。
[0041]附图1为实施例1制备得到的抗体修饰的埃洛石涂层的表面原子力显微镜图。从图1中可以看出涂层的表面均匀，厚度均一，均方粗糙度为52.6nm，适合用于细胞的捕获。
[0042]将所得的抗体修饰的埃洛石涂层进行人乳腺癌细胞捕获，将抗体修饰的埃洛石表面置于细胞培养板中，将计量好数目的人乳腺癌细胞加入到细胞培养液(DMEM培养基，10%的胎牛血清)中，之后将加入了一定数量的癌细胞的细胞培养液加到埃洛石表面，在37°C静置培养3h。之后用PBS溶液冲洗至少三次，用荧光染料DAPI对细胞进行染色，用荧光显微镜拍照观察细胞的数量。发现3h埃洛石涂层对MCF-7细胞的捕获效率达90%。
[0043]实施例2
[0044]配制埃洛石的分散液，其中埃洛石5份，去离子水10份，乙醇90份，γ-环氧基丙基三乙氧基硅烷2份，表面活性剂六偏磷酸钠0.8份，将上述组分在室温下经机械搅拌(400r/min，搅拌30min)混合均勾，用喷枪喷涂到经80 °C预热的娃片上;将涂层在60°C充分挥发干燥，之后将埃洛石涂层浸泡到10yg/mL anti_HER2(购于Sigma-Aldrich公司)抗体的PBS溶液中30min后，用磷酸盐缓冲液冲洗3次，即得抗体修饰的埃洛石涂层。
[0045]将所得的抗体修饰的埃洛石涂层进行人前列腺癌细胞捕获，将抗体修饰的埃洛石表面置于细胞培养板中，同时以空白的玻璃片作为空白对照。将计量好数目的人前列腺癌细胞加入到细胞培养液(DMEM培养基，10%的胎牛血清)中，之后将加入了一定数量的癌细胞的细胞培养液加到埃洛石表面，在37°C静置培养2h。之后用PBS溶液冲洗三次，用荧光染料DAPI对细胞进行染色，用荧光显微镜拍照观察细胞的数量。发现2h埃洛石涂层对PC-3细胞的捕获效率达85 %。
[0046]附图2为实施例2中所制备的抗体修饰的硅片上的埃洛石涂层和空白的玻璃片在不同的捕获时间对人前列腺癌细胞(PC3)的细胞荧光图。从图2中看出，在同样的捕获时间，埃洛石涂层比空白玻璃片表面显示出更高的细胞捕获效率。
[0047]实施例3
[0048]配制埃洛石的分散液，其中埃洛石10份，甲醇100份，γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷0.5份，表面活性剂焦磷酸钠1.5份，将上述组分在800W下超声30min混合均匀，用喷枪喷涂到经50°C预热的铝片上;将涂层在80°C充分挥发干燥，之后将埃洛石涂层浸泡到30yg/mL anti_HER2抗体的PBS溶液中20min后，用磷酸盐缓冲液冲洗3次，即得抗体修饰的埃洛石涂层。
[0049]将所得的抗体修饰的埃洛石涂层进行人肝癌细胞捕获，将抗体修饰的埃洛石表面置于细胞培养板中，将计量好数目的人肝癌细胞加入到细胞培养液(DMEM培养基，10%的胎牛血清)中，之后将加入了一定数量的癌细胞的细胞培养液加到埃洛石表面，在37°C静置培养3h。之后用PBS溶液冲洗至少三次，用荧光染料DAPI对细胞进行染色，用荧光显微镜拍照观察细胞的数量。发现3h埃洛石涂层对H印G细胞的捕获效率达93 %。
[0050]实施例4
[0051]配制埃洛石的分散液，其中埃洛石8份，丙酮100份，γ-巯丙基三甲氧基硅烷I份，表面活性剂柠檬酸钠0.8份，将上述组分在500W下超声Ih混合均匀，用喷枪喷涂到经90°C预热的云母片上;将涂层在40°C充分挥发干燥，之后将埃洛石涂层浸泡到2yg/mL Ant1-EpCAM抗体的PBS溶液中1min后，用磷酸盐缓冲液冲洗3次，即得抗体修饰的埃洛石涂层。
[0052]将所得的抗体修饰的埃洛石涂层进行人肺癌肿瘤细胞捕获，将抗体修饰的埃洛石表面置于细胞培养板中，将计量好数目的人肺癌细胞加入到细胞培养液(DMEM培养基，10%的胎牛血清)中，之后将加入了一定数量的癌细胞的细胞培养液加到埃洛石表面，在37°C静置培养lOmin。之后用PBS溶液冲洗三次，用荧光染料DAPI对细胞进行染色，用荧光显微镜拍照观察细胞的数量。发现1min埃洛石涂层对A549细胞的捕获效率达75%。
[0053]实施例5
[0054]配制埃洛石的分散液，其中埃洛石0.5份，二氯甲烷100份，γ-氨丙基三乙氧基硅烷3份，表面活性剂聚苯乙烯磺酸钠I份，将上述组分在500rpm转速下经机械搅拌60分钟后，用喷枪喷涂到经100°C预热的玻璃片上;将涂层在40°C充分挥发干燥，之后将埃洛石涂层浸泡到8yg/mL Ant1-EpCAM抗体的I3BS溶液中lOmin，然后用磷酸盐缓冲液冲洗3次，即得抗体修饰的埃洛石涂层。
[0055]将所得的抗体修饰的埃洛石涂层进行人卵巢癌细胞捕获，将抗体修饰的埃洛石表面置于细胞培养板中，将计量好数目的人卵巢癌细胞加入到细胞培养液(DMEM培养基，10%的胎牛血清)中，之后将加入了一定数量的癌细胞的细胞培养液加到埃洛石表面，在37°C静置培养5min。之后用PBS溶液冲洗三次，用荧光染料DAPI对细胞进行染色，用荧光显微镜拍照观察细胞的数量。发现5min埃洛石涂层对H0-8910细胞的捕获效率达78%。
[0056]实施例6
[0057]配制埃洛石的分散液，其中埃洛石20份，纯水30份，四氢呋喃60份，γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷2份，表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵0.6份，将上述组分在100rpm转速下经机械搅拌30分钟后混合均匀，用喷枪喷涂到经90 °C预热的玻璃片上;将涂层在80°C充分挥发干燥，得不经抗体偶联的埃洛石涂层。
[0058]将不经抗体偶联的埃洛石涂层直接进行人脑胶质瘤细胞(U87)捕获，将埃洛石表面置于细胞培养板中，将计量好数目的人脑胶质瘤细胞加入到细胞培养液(DMEM培养基，10%的胎牛血清)中，之后将加入了一定数量的癌细胞的细胞培养液加到埃洛石表面，在37°(:静置培养30min。之后用PBS溶液冲洗三次，用荧光染料DAPI对细胞进行染色，用荧光显微镜拍照观察细胞的数量。发现30min对U87细胞的捕获效率达85%。
[0059]实施例7
[0060]将实施例3制备的抗体修饰的埃洛石涂层对正常细胞前成骨细胞(MC3T3-E1)和人正常肝细胞(L02)以及人肝癌细胞(HEPG-2)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、小鼠脑神经瘤细胞(Neuro-2a)、肺癌细胞(A549)和小鼠黑色素瘤(B16F10)进行捕获，具体操作同实施例3，对各种细胞的捕获效率如图3所示，从图3中可以看出偶联抗体的埃洛石表面对正常细胞的捕获率远低于肿瘤细胞。说明其能够较好的区分正常细胞和肿瘤细胞，因此方便地进行癌症诊断。
[0061]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)制备埃洛石分散液:按质量份数计，取埃洛石0.0I?40份，去尚子水O?99.9份，有机溶剂O?99.9份，硅烷0.001?5份，表面活性剂0.001?I份，混合，经机械搅拌或超声分散即得埃洛石分散液； (2)将步骤(I)制备得到的埃洛石分散液喷涂到预热的基材上，然后充分干燥，干燥后的涂层即为用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层； 或者， 重复步骤(I)和(2)，然后将步骤(2)中干燥后的涂层与肿瘤细胞的特异性识别抗体进行偶联，即得到抗体修饰的用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层。2.根据权利要求1所述的用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层的制备方法，其特征在于: 步骤(I)中所述的有机溶剂为乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氧六环、二氯甲烷或氯仿中的一种或多种的混合物； 步骤(I)中所述的硅烷为γ-氨基丙基三乙氧基硅烷、γ-环氧基丙基三乙氧基硅烷、γ-巯丙基三甲氧基硅烷、γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷中的至少一种； 步骤(I)中所述的表面活性剂为聚苯乙烯磺酸钠、六偏磷酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、焦磷酸钠、柠檬酸钠中的至少一种。3.根据权利要求1所述的用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层的制备方法，其特征在于: 步骤(I)中所述的去离子水和有机溶剂的用量不能同时为O。4.根据权利要求1所述的用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层的制备方法，其特征在于: 步骤(I)中所述的超声分散的条件为在60?1000W功率下超声5?60min; 步骤(I)中所述的机械搅拌是指在50?1500rpm的速度下搅拌3?120min。5.根据权利要求1所述的用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层的制备方法，其特征在于: 步骤(2)中所述的基材为载玻片、石英片、硅片、聚苯乙烯透明塑料片或金属片，所述的预热的温度为35?100°C; 步骤(2)中所述的干燥是指在30?100 °C下干燥0.5?600min。6.根据权利要求1所述的用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层的制备方法，其特征在于: 所述的肿瘤细胞的特异性识别抗体为上皮细胞粘附分子抗体ant 1-EpCAM或人表皮生长因子ant1-HER2。7.根据权利要求1所述的用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层的制备方法，其特征在于: 所述的偶联具体包括以下步骤:将干燥后的涂层在I?20yg/mL的抗体PBS溶液中浸泡3?30min，然后取出用磷酸盐缓冲液冲洗2-3次。8.—种根据权利要求1?7任一项所述的方法制备的用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层。9.根据权利要求8所述的用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层在捕获肿瘤细胞和癌症早期诊断领域的应用。10.根据权利要求9所述的用于捕获肿瘤细胞的埃洛石涂层在捕获肿瘤细胞和癌症早期诊断领域的应用，其特征在于: 所述的肿瘤细胞包括人乳腺癌细胞、人前列腺癌细胞、人肝癌细胞、人结肠腺癌细胞、人肺小细胞腺癌细胞、人卵巢癌细胞、人脑胶质瘤细胞和人骨肉瘤细胞。
【文档编号】B05D1/28GK106000814SQ201610508849
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】刘明贤, 何瑞, 周长忍
【申请人】暨南大学