用于捕获循环细胞的装置的制作方法

专利名称：用于捕获循环细胞的装置的制作方法
用于捕获循环细胞的装置本申请要求2009年3月18日提交的美国临时申请no. 61/161248和2010年2月 5日提交的美国临时申请no. 61/301839的优先权，它们的全部内容通过引用并入本文。获得本文所述和请求保护之发明的工作是在美国国立卫生研究院的资助(资助号CA119347)下进行的。美国政府享有本发明的一些权利。
背景技术：
1.发明领域本发明涉及捕获稀少细胞的装置和方法。2.
背景技术：
癌症是发达国家的首要死亡原因之一，仅在美国每年就有超过500，000人死于癌症。在美国，每年有超过1百万人被诊断出癌症，并且据总体估计，每3个人中有超过1人会在有生之年患某种类型的癌症。大部分癌症患者并非死于其原发肿瘤。事实上，癌症患者多死于“转移”——恶性细胞从身体的一部分扩散至另一部分。如果原发肿瘤被足够早地检出，则其通常可通过手术、放射、化疗或这些治疗的某些组合来消除。与之相反，转移肿瘤难以被检出，并且随着转移的进展而愈加难以治疗。因此，需要开发用于检测早期癌转移的方法。脱离原发肿瘤部位的癌细胞被称为“循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC) "1O CTC代表了作为肿瘤组织来源之介入性活检的潜在替代物，以用于检测、表征和监测非血液系统癌症2_4。在过去十年中，CTC已成为检测早期癌转移、预测患者预后以及监测疾病进展和癌症治疗效果的新兴“生物标志物”5。然而，由于CTC在包含大量血细胞(IO9 个细胞/mL)的血液中的丰度极低(每毫升有几个至几百个细胞)，因此对CTC的分离在技术上存在难度4’6’7。先前从外周血中富集或分选CTC的方法包括流式细胞术、免疫磁珠、高通量光学成像系统和光纤阵列扫描。免疫磁珠纯化CTC是目前临床中应用最广泛的技术，并且已成功地从肺癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌和胰腺癌患者中鉴定出CTC3’4’8,。然而，该方法以非常低的纯度(O. 01 0. )1°和低产率(约20 60%的患者)3分离出少量的CTC(肺癌中，4士对个(平均值士标准差)/ml ；乳腺癌中，11 士 118个/ml ；前列腺癌中，10士33个/ ml ；结直肠癌和胰腺癌中，1 士2个/ml)3。与免疫磁珠技术的低灵敏度、选择性和产率相关的“生物噪声”水平限制了其在早期癌症检测和患者对治疗之响应的监测中的应用。目前， 免疫磁珠技术可用作反映大致情况的预后工具，从而将患者划分为高风险和低风险类型5。微流体芯片实验室装置为细胞分选和稀少细胞检测提供了唯一的机会。微流体技术已成功地用于微流体流式细胞术、基于尺寸的连续分离(continuous size-based s印aration)11和色谱分离12 ；然而这些方法不能处理大体积的样品(例如，几毫升全血)13。 还使用微流体技术从全血样品中捕获CTC8’9。但是，现有的CTC捕获系统需要复杂的流体处理系统来使血流通过装置。此外，这些系统采用对于细胞捕获来说并非最优的微结构来分离 CTC。
大部分上皮起源的肿瘤(上皮癌)细胞的表面覆盖有多种大小和构型的纳米尺度的微绒毛14。在腺体起源的良性上皮细胞中，微绒毛是有极性的(即局限在正常细胞的一面，通常是面向腺体或器官内腔的一面)并且具有一致且单一的构型。上皮癌细胞的微绒毛覆盖整个细胞表面，其大小和长度有所不同，并且有时形成非常长之微绒毛的簇。在一些肿瘤(尤其是癌性间皮瘤)中，长微绒毛的簇代表了恶性细胞。此外，细胞表面上还存在大小亦为纳米尺度的其它结构，包括板状伪足、丝状伪足和脂筏分子团。本发明的一些实施方案涉及利用细胞表面上存在的这些纳米尺度结构的新型细胞捕获装置。发明概述参考说明书、附图和实施例会明确其它目的和优点。根据本发明一些实施方案的细胞捕获装置具有包含纳米结构化表面区域的基底。 纳米结构化表面区域连接有多个结合剂，其能选择性地捕获细胞样品中的靶细胞。所述纳米结构化表面区域包含多个纳米结构。纳米结构具有纵向尺寸和横向尺寸，在一些实施方案中，纵向尺寸是横向尺寸的至少10倍。在本发明的一些实施方案中，所述装置是微流体装置。微流体装置具有连接流动层的基底，其形成微流体通道。所述基底具有纳米结构化表面区域，该表面区域的一部分与运行中流过微流体通道的流体相接触。所述纳米结构化表面区域包含多个纳米结构，每个纳米结构具有纵向尺寸和横向尺寸。纳米结构化表面区域连接有多个结合剂，其能选择性地捕获细胞样品中的靶细胞。本发明的一些实施方案还涉及从细胞样品中分离把细胞的方法。该方法包括提供具有至少一个靶细胞的细胞样品，并将所述细胞样品与多个纳米结构相接触。纳米结构连接有多个结合剂，其能选择性地捕获细胞样品中的靶细胞。本发明的另一些实施方案涉及使用本发明的方法和装置来诊断疾病、监测疾病进展和评价治疗效果。本发明的另一些实施方案还涉及包含本发明装置的试剂盒。


图1提供了根据本发明的一个实施方案如何使用纳米结构化基底提高细胞捕获效率的示意图。由于纳米结构化基底提高了与细胞表面组分的局部相互作用，因此，与平基底相比，更多的细胞表面组分附着到纳米结构化基底上。图2A-2C示意了根据本发明的一个实施方案的硅纳米线(SiNW)的制备。图2A显示通过Ag+和HF的化学蚀刻将SiNW阵列引入到硅晶片上。扫描电子显微镜(SEM)图像显示清晰可辨的SiNW，其直径为100 200nm，长度为约10 μ m。图2B是将生物素化的上皮细胞粘附分子抗体(抗-EpCam)移接到硅基底上的示意图。图2C显示通过湿化学蚀刻获得的不同SiNW长度之SiNW基底的SEM图像。图3A 3C比较了平硅基底与本发明一些实施方案中的SiNW基底。图3A显示捕获MCF7的SiNW基底和平硅基底的荧光显微图像和SEM图像。图显示捕获Daubi B细胞的SiNW基底和平硅基底的荧光显微图像和SEM图像。在图3A和图;3B中，SiNW基底显示出比平基底显著更高的细胞捕获效率。图3C示意，以相近的实验设置，在硅晶片上设计交替的SiNW和平基底用以比较细胞捕获效率的光蚀刻方法。图3D显示细胞捕获前经图案化之基底的SEM图像(上图)以及经图案化之基底上捕获的细胞的荧光图像(下图)。图4A和4B显示捕获时间和SiNW长度对本发明一些实施方案中SiNW基底之捕获效率的作用。图4A显示细胞捕获效率和捕获时间之间的相关性。图4B显示细胞捕获效率和0 20 μ m的不同SiNW长度之间的相关性。图5比较了三种不同基底的细胞捕获表现未经任何表面修饰的SiNW基底 (SiNW-No)、经链霉亲和素包被的SiNW基底(SiNW-SA)和用抗-EpCAM修饰的SiNW基底 (SiNW-SA-EpCAM)。图6A 6E显示本发明一个实施方案的微流体装置。图6A是微流体细胞捕获平台的照片。图6B是包括经捕获剂包被之SiNW基底和覆盖其上之微流体混沌混合器(chaotic mixer)的整合CTC捕获平台的示意图。图6C是混沌混合通道下SiNW模式的光学图像。图 6D是直径为100 200nm、长度为约10 μ m的清晰可辨的SiNW的侧视SEM图像。图6E显示细胞表面组分如何高效地附着到纳米结构化基底上，这可能是由于纳米结构化基底提高了与细胞表面组分的局部相互作用。图7A 7C显示本发明一个实施方案的微流体装置中流速对细胞捕获的作用。图 7A显示微流体装置中流速与捕获产率之间的相关性。图7B显示从微通道入口到出口(0 88cm)的捕获细胞分布。图7C是微流体装置的照片。图8显示，在本发明一个实施方案的微流体装置中，针对三种不同癌细胞系——乳腺癌(MCF7)、前列腺癌(PO)和膀胱癌(T-M)，每毫升PBS掺入100个细胞的捕获产率。图9显示，在本发明一个实施方案的微流体装置中，比较针对全血与经裂解血液样品中的多种靶细胞浓度的捕获效率。图表示掺入细胞数相对于所回收的细胞数。图IOA IOD显示，在本发明一个实施方案的微流体装置中，捕获时间和SiNW长度对捕获效率的作用。图IOA显示细胞捕获效率与捕获时间之间的相关性。图IOB显示细胞捕获效率与0 20 μ m之不同SiNW长度之间的相关性。图IOC显示，在不同比例的细胞混合物中捕获的靶Daudi B细胞的百分比。图IOD是利用SiNP基底捕获的Daudi B细胞的荧光图像。每幅图和误差线表示3次重复的平均值士标准差。图IlA IlC比较了本发明一些实施方案之装置与Cellsearch 技术的捕获能力。图IlA显示43个转移性前列腺癌患者样品得到的CTC数。图IlB显示在静态孵育条件下使用本发明一个实施方案的装置得到的患者样品之CTC数。图IlC显示使用本发明一个实施方案的微流体装置得到的患者样品之CTC数。发明详述本发明的一些实施方案涉及能从生物样品中快速且高效地分离出稀少细胞(例如CTC)的装置。该装置包含连接至纳米结构的结合剂。细胞捕获由靶细胞与结合剂之间的相互作用来介导。此外，纳米结构通过与细胞表面组分(如微绒毛、板状伪足、丝状伪足和脂筏分子团)相互作用来辅助细胞捕获。除了精确地识别和测量生物样品中的稀少细胞外，本发明一些实施方案的装置还可分离出稀少细胞用以后续处理。本发明的一些实施方案还涉及在研究和临床中使用所述装置，包括使用该装置来检测、诊断和监测疾病。在一些实施方案中，本发明的装置和方法能以单个步骤直接从全血中分选出稀少细胞。例如，本发明一些实施方案的装置和方法能够无需任何其它样品处理步骤(如稀释、 离心、红血细胞裂解、细胞固定或细胞标记)来使用抗凝全血(但不限于此)。这与基于免疫磁珠的系统不同，后者需要多个“批量”半自动制备步骤(离心、清洗和孵育)从而导致显著量的稀少细胞受到损失和/或破坏。此外，本发明一些实施方案的装置和方法能分离活的和固定的细胞，而基于磁珠的方法只可分离固定的非存活细胞。而且，与需要复杂流体处理系统的现有微流体CTC捕获装备不同，本发明一些实施方案的装置可通过在装置中静态孵育血液样品而获得高的细胞捕获效率。本发明一些实施方案的装置和方法的特点还在于它们使用纳米结构来捕获和分离生物样品中的循环细胞。先前的微流体CTC捕获装置使用微结构来与靶细胞相互作用。 这些微结构能与大部分细胞(大小通常为10 30 μ m)相互作用。然而，这些微结构不能与细胞表面上纳米尺度的多种组分(例如微绒毛)相互作用。本发明一些实施方案的纳米结构通过与这些纳米级细胞表面组分的相互作用来增强与靶细胞的结合。在一些实施方案中，本发明的装置和方法可以高灵敏度(例如，鉴定为具有CTC的肿瘤患者的百分比)、高特异性(例如，鉴定为不具有CTC的非肿瘤患者的百分比)和高纯度(定义为与该装置截获的其它细胞相比装置截获的稀少细胞的百分比)实现稀少细胞的捕获。与先前用于捕获CTC的装置和方法相比，所观察到的灵敏度、特异性和纯度水平是出人意料的(参见例如图10)。在一些实施方案中，可容易地对本发明的装置和方法进行改造(包括变换通量， 变换结合剂)以适于多种临床情形中的潜在应用，从而允许捕获任意类型的稀少循环细胞。此外，本发明一些实施方案的装置和方法不限于鉴定和分离循环肿瘤细胞。本发明一些实施方案的装置和方法适用于一定范围的细胞学研究领域中。本发明一些实施方案的“一步”可能性和多用性使这些实施方案可用于即时使用并快速整合入临床实践中。以下详细讨论本发明的一些实施方案。在所述的实施方案中，为明确起见使用特定术语。然而，这些实施方案不旨在限于所选用的特定术语。相关领域的普通技术人员会认识到可在不背离本发明的精神和范围下使用其它等效组分以及开发其它方法。本文引用的所有参考文献如同每个被单独并入地那样通过引用并入本文中。1.定义为了便于理解本发明，以下定义一些术语和短语。除非上下文中另外明确指出，否则本文中无数量词修饰的形式包括复数含义。因此，例如“结合剂”也涉及多于一种结合剂。术语“纳米结构”是指具有横向尺寸和纵向尺寸的结构，其中横向尺寸、纵向尺寸或者横向和纵向尺寸两者均小于1mm。纳米结构的形状不是关键的。例如，它可以是任何三维表面，如珠、颗粒、线、管、球等。术语“诊断”是指鉴定病理状态的存在情况或性质，包括鉴定具有发生特定疾病或病症之风险的患者。诊断方法有不同的灵敏度和特异性。诊断测定的“灵敏度”是测试为阳性之患病个体的百分比(“真阳性”百分比)。测定未检测出的患病个体为“假阴性”。未患病并且在测定中测试为阴性的对象称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”是1减去假阳性率，其中“假阳性”率定义为未患病但测试为阳性之患者的比例。尽管特定的诊断方法可能不会提供病症的确定性诊断，但是如果该方法提供辅助诊断的阳性指示就已足够。术语“检测”等可用于这样的上下文中检测生物标志物或者检测疾病或病症(例如当获得阳性测定结果时)。在后一情形中，认为“检测”和“诊断”是同义的。
术语“对象”、“患者”或“个体”通常是指人，但本发明的方法不限于人，并且应可用于其它哺乳动物(例如猫、犬等)。本文所用“样品”取其最广泛的含义。样品可包括体液(包括血液、血清、血浆、泪液、房水和玻璃液、脊髓液、尿液和唾液)；细胞或组织制备物的可溶级分，或细胞生长的介质。获得合适的生物样品的方法是本领域技术人员已知的。本文所用术语“结合剂”是指与纳米结构化表面区或该表面之一部分(例如塑料表面的衍生部分)连接并且可以与靶细胞进行特异性相互作用或连接的任何实体或物质 (例如分子)。“多个结合剂”可以指一种特定结合剂的多个或者指多于一种结合剂的多个。“抗体”是通过免疫球蛋白分子可变区中至少一个抗原识别位点识别并且特异结合靶标(例如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质等)的免疫球蛋白分子。本文所用的该术语取其最广泛的含义，并包括完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段(如 Fab、Fab，、F(ab，)2和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体(如由至少2种完整抗体产生的双特异性抗体)、杂合抗体、包含抗体部分的融合蛋白以及包含抗原识别位点的任何其它经修饰免疫球蛋白分子，前提是所述抗体显示期望的生物活性。抗体可以是免疫球蛋白五种主要类型的任意种IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)，根据它们的重链恒定区的性质分别称为α、δ、ε、Y禾口 μ。不同的免疫球蛋白类型具有不同并且公知的亚基结构和三维构型。抗体可以是“裸露的(naked)”或缀合至其它分子(如毒素、放射性同位素等)。术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于线形抗体；单链抗体分子；Fc或Fe’肽、Fab和Fab片段以及由抗体片段形成的多特异性抗体。“杂合抗体”是这样的免疫球蛋白分子，其中来自具有不同抗原决定区之抗体的重链和轻链对被组装在一起，从而可以识别两种不同的表位或两种不同的抗原并通过所得的四聚体结合。对于细胞而言，“分离”是指从其天然环境(如实体瘤中)取出分离的或隔离的细胞，并且其中至少约30%、50(%、75(%和90%不含天然状态下与其一起存在的、但缺少分离该细胞所依据之标志物的其它细胞。与靶细胞“特异性结合”或显示“特异性结合”或者“捕获”或“选择性捕获”靶细胞的分子(例如结合剂)是指与另一些物质相比，以更长的持续时间和/或更大的亲和力与靶细胞更频繁、更迅速地反应或连接的分子。因此，在特定的实验条件下，特定的分子与靶细胞的结合至少为背景的2倍，并且其基本上不与样品中存在的其它细胞和蛋白质以显
著量结合。本文所用的“转移”是指癌从初始部位向身体其它区域扩散或转移、同时在新的部位产生类似癌性病变的过程。“转移”的细胞是失去与邻近细胞的粘附接触并经血流或淋巴从患病初始部位迁移以侵袭邻近机体结构的细胞。2.装置本发明一个实施方案的装置在图1、2A和2B中示意显示。装置(100和200)包含具有纳米结构化表面区域(104和204)的基底(102和202)。多个结合剂(106和206)连接至所述基底的所述纳米结构化表面区域。纳米结构化表面区域包含多个纳米结构(如纳米结构108和纳米结构208)，其每个均具有纵向尺寸和横向尺寸。当将样品置于装置上时，生物细胞(110和210)被协作作用的结合剂和多个纳米结构选择性地捕获。所使用的结合剂将取决于被靶向的生物细胞类型。常规的结合剂适用于本发明的一些实施方案。结合剂的非限制性实例包括抗体、核酸、寡肽或多肽、细胞受体、配体、适配体、生物素、亲和素、配位复合物、合成的聚合物和碳水化合物。在本发明的一些实施方案中，使用常规方法将结合剂连接至纳米结构化表面区域。所采用的方法将取决于结合剂和用于构成装置的材料。连接方法的非限制性实例包括结合剂或与该试剂连接或化学结合 (例如通过自组装的单层或硅烷化学)的化合物的非特异性表面吸附。在一些实施方案中， 用链霉亲和素包被纳米化结构表面区域，并且结合剂被生物素化(其通过与链霉亲和素分子相互作用而辅助与纳米化表面区域的连接)。在本发明的一些实施方案中，纳米结构增加了基底的表面面积并且增加了给定细胞与结合剂接触的可能性。在这些实施方案中，纳米结构可以通过与细胞表面组分(如微绒毛、板状伪足、丝状伪足和脂筏分子团)相互作用而增强与靶细胞的结合。在一些实施方案中，纳米结构具有等于其横向尺寸的纵向尺寸，其中横向尺寸和纵向尺寸均小于Iymjp 为纳米尺度。在另一些实施方案中，纳米结构的纵向尺寸为其横向尺寸的至少10倍。在又一些实施方案中，纳米结构的纵向尺寸为其横向尺寸的至少20倍、50倍或100倍。在一些实施方案中，横向尺寸小于1 μ m。在另一些实施方案中，横向尺寸为1 500nm。在又一些实施方案中，横向尺寸为30 400nm。在又一些实施方案中，横向尺寸为50 250nm。在一些实施方案中，纵向尺寸为至少Iym长。在另一些实施方案中，纵向尺寸为1 50 μ m 长。在另一些实施方案中，纵向尺寸为1 25μπι长。在又一些实施方案中，纵向尺寸为 5 IOym长。在又一些实施方案中，纵向尺寸为至少6 μ m长。纳米结构的形状不是关键的。在本发明的一些实施方案中，纳米结构是球或珠。在另一些实施方案中，纳米结构是线、丝或管。在又一些实施方案中，多个纳米结构包含一个或多个纳米线、纳米纤维、纳米管、纳米柱、纳米球或纳米颗粒。装置的精确几何结构将由测定决定。装置可以包含或不包含允许光学或目视检查纳米结构表面的区域。在一些实施方案中，可以通过静态孵育血液样品来实现高的细胞捕获效率。图6B示意本发明微流体装置的一个实施方案(600)。该微流体装置(600)具有连接至基底(604)以形成微流体通道(606)的流动层(602)。在这种装置(600)中，基底 (604)之纳米化结构表面区域的一部分将与流经微流体通道的流体相接触。微流体装置包含至少一个流体输入微通道(608)。然而微流体装置不限于仅有一个输入微通道。在一些实施方案中，微流体装置可以包含两个或更多个输入通道以及两个或更多个流体连通的流体源。微流体装置还具有一个或多个排出流体的输出微通道(610)。可引入装置的流体的非限制性实例包括清洗缓冲液(例如用于除去非特异结合的细胞或未使用的试剂)、裂解试剂或标记试剂(例如细胞外或细胞内染料)。在一些实施方案中，将本发明的装置设计为具有允许接近全部或细胞可结合之区域的可移除覆盖物。 使用这些装置，可以将试剂(例如标记试剂或裂解试剂)施加到特定区域。还可以从这些装置中取出各细胞。在另一些实施方案中，装置具有多于一个的输入微通道和输出微通道以允许将多于一种的流体引入装置中(通常在不同的时间)。通过具有多个输入微通道和相应的输出微通道，可以将流体同时引入装置从而在特定区域处理所结合的细胞。这些区域的大小可以根据输入微通道和输出微通道的位置以及输入微通道和输出微通道的相对体积流速来调整。在本发明的一些实施方案中，输入微通道与泵(61 连接以控制进入微流体通道的样品和试剂的流动。常规的流体泵能在适用于本发明一些实施方案的装置中产生所需的剪切应力。泵的非限制性实例包括注射泵、蠕动泵和真空泵。在一些实施方案中，使用常规方法将泵与装置连接。可以将装置配置为在任何给定通道中具有基本恒定的剪切应力或者在给定通道中具有变化的剪切应力。本领域普通技术人员已知如何根据待处理之流体的体积和类型以及期望的流体流速来选择和配置用于本发明的泵。在一些实施方案中，本发明的装置包含混沌混合器。常规的混沌混合器适用于本发明的一些实施方案。在一些实施方案中，流动层具有带纹理的表面以在微流体通道中引起混沌流(chaotic flow)。该混沌流增加了生物细胞与基底之纳木结构化表面区域接触的可能性，从而增加了纳米结构化表面区域上的结合剂与样品中的靶生物细胞相互作用和结合的可能性。在一些实施方案中，所述带纹理的表面具有相对于流体流动主要方向取向以混合循环流体的多个结构。带纹理表面可以形成多种几何形状，包括例如矩形、圆形和抛物线形。可以将所述形状组合成周期或随机的排布。在一些实施方案中，所述形状可以包括多个形成鲱鱼骨图案的“Λ”形状。本文所用术语“鲱鱼骨图案”具有其通常含义短平行线的列(例如两列)，其中一列中的所有线条向一个方向倾斜，而相邻列的所有线条向另一方向倾斜。可以在带纹理表面上形成以便于流体混合的图案的其它细节在Mook等题为 "LAMINAR MIXING APPARATUS AND METHODS” 的美国专利申请公布 2004/(^62223 中描述。在一些实施方案中，本发明的装置使用常规技术制造。所使用的制造技术将取决于用于制造装置的材料。制造技术的非限制实例包括塑模、光蚀刻、电子束光刻、软光刻、电铸和机械加工。材料的非限制性实例包括玻璃、石英、聚合物(例如聚苯乙烯、硅酮如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯、尿烷、多糖、聚交酯(polylactide)和聚四氟乙烯(Teflon))、硅和其它半导体和金属(例如铝、钛和钢)。材料还可以为无机氧化物(例如锌氧化物、硅氧化物、钛氧化物和铝氧化物)。在本发明的一些实施方案中，微流体装置通过软光刻制成。例如，可以在具有所需图案的基底上施加聚二甲基硅氧烷(PDMS)层。该层可包被抗蚀剂(resist)，暴露于光图案并被蚀刻以产生形成流体通道的结构(例如，以预定的图案)。可以使用连续的包被、暴露和蚀刻步骤来产生更复杂的结构。3.使用方法在一些实施方案中，使用本发明的装置来从样品中分离稀少细胞。在一些实施方案中，稀少细胞是外周血中的循环肿瘤细胞。在另一些实施方案中，稀少细胞是外周血中的生物体(例如细菌、病毒、原生生物和真菌)。在又一些实施方案中，稀少细胞是在正常情况下不存在于血液中的非血细胞(例如，内皮细胞或胎儿细胞)，甚至是造血起源细胞(例如血小板、镰刀形红细胞和白细胞的亚型)。可以使用本发明一些实施方案的装置检测的癌包括前列腺癌、肺癌、腺癌、腺瘤、 肾上腺癌、基底细胞癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、支气管癌、宫颈发育不良、结肠癌、表皮样癌、尤因肉瘤(Ewing's sarcoma)、胆囊癌、胆囊结石肿瘤、巨细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、头癌、 增生、增生性角膜神经瘤、原位癌、肠节细胞神经瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤(Kaposi’ ssarcoma)、肾癌、喉癌、平滑肌瘤、肝癌、恶性类癌、恶性高钙血症、恶性黑素瘤、马方综合征样体征肿瘤(marfanoid habitus tumor)、髓样癌、转移性皮肤癌、粘膜神经瘤、蕈样肉芽肿病、颈癌、神经组织癌、神经母细胞瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、卵巢肿瘤、胰腺癌、甲状旁腺癌、 嗜铬细胞瘤、原发性脑肿瘤、直肠癌、肾细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、精原细胞瘤、 皮肤癌、小细胞肺肿瘤、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、甲状腺癌、局部皮肤病变、网状细胞肉瘤(veticulum cell sarcoma)或维尔姆斯瘤(Wilm’ s tumor)。在一些实施方案中，结合剂是抗上皮细胞粘附分子抗体(抗-EpCAM抗体)。由于EpCAM经常被肺、结直肠、乳房、 前列腺、头颈和肝起源的癌过表达，所以它提供了对从未分级分离之血液中捕获CTC的特异性，从而可以提供与肿瘤(甚至临床上被认为是局部的肿瘤)相关的临床和诊断信息。除了从样品中分离生物细胞的方法以外，本发明的一些实施方案还提供了可使用所分离细胞提供其它信息的方法。在一些实施方案中，使用本发明方法和装置分离的细胞可以用其它体外测定进一步测定。在一些实施方案中，对使用本发明方法和装置分离的细胞进行计数。可用于一些实施方案中的细胞计数的常规方法包括例如光学检测(例如目视检查、自动计数、基于显微镜的检测)、FACS和电学检测(如Coulter计数器)。细胞计数可用于诊断疾病、监测疾病进展以及监测或确定治疗效果。在一些实施方案中，通过流式细胞术或其它分析平台对使用本发明方法和装置分离的细胞进行免疫细胞化学分析。这些分析利于诊断并向临床医生提供重要信息。在一些实施方案中，可以裂解使用本发明之方法和装置分离的细胞，并且可以测量所述细胞或其部分的一种或多种特性。可以在裂解细胞中测量的生物学特性的非限制性实例包括mRNA表达、蛋白质表达和DNA定量。此外，在一些实施方案中，可以使用常规技术(例如FISH或PCR)对细胞DNA进行测序或鉴定某些序列特性(例如多态性和染色体异常)。在一些实施方案中，裂解细胞并仍使其结合于装置上。使用本发明一些实施方案的装置和方法获得的高纯度样品使得能够利用装置裂解细胞并获得有用的遗传信息。在一些实施方案中，不经裂解测定本发明方法分离的细胞。用于测定未裂解之细胞的方法的非限制实例包括使用细胞外或细胞内染色；观察不同培养基中的形态或生长特性；以及鉴定细胞表面上的生物标志物。在另一些实施方案中，培养所分离的细胞以获得富集的分离细胞群，而后用于后续的体外测定。在本发明的一些实施方案中，可以从分离细胞获得的信息包括特定基因组DNA、 cDNA或mRNA序列的鉴定或定量；细胞表面标志物(例如癌干细胞上的⑶133、⑶44、⑶M、 上皮特异性抗原(印ithelial-specific antigen，ESA)、Nanog和BMI1)的鉴定或定量；以及指示特定肿瘤类型或存在的蛋白质或其它细胞内含物的鉴定或定量。在一些实施方案中，可以分析CTC以确定组织起源、疾病的阶段或严重程度或者对特定治疗的敏感性。在一些实施方案中，使用本发明的方法和装置来评估在消除肿瘤的药物、放射或手术治疗后循环中的残留癌细胞。在另一些实施方案中，在数年内定期地使用本发明之方法和装置来评估患者循环中肿瘤细胞的存在和数目，以作为疾病发生、复发和/或进展的指示。本发明的一些实施方案还提供了用于实施本文所述方法的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含本发明的装置。在一些实施方案中，所述试剂盒包含与本发明装置一起使用的试剂。在又一些实施方案中，所述试剂盒包含从哺乳动物对象中获取样品(例如体液)以及使用试剂盒来诊断哺乳动物对象之癌症或者监测施用给患癌症之哺乳动物对象的治疗效果的说明。通过参照以下非限制性实施例可以进一步理解本发明的一些实施方案。很明显， 本领域普通技术人员在不背离本公开内容的精神的前提下可以对材料和方法进行诸多变动。
实施例应理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于举例说明，并且基于其，本领域普通技术人员会想到多种改变或变动，并且这些改变和变动涵盖在本申请的精神和范围内。实施例1SiNW基底的制备和表面修饰如下制备纳米结构化细胞捕获基底。首先，使用湿化学蚀刻法将直径约100 200nm的紧密捆扎的纳米线(SiNW)引入硅晶片(例如lcmX2cm)上。将硅基底的表面处理成亲水性。在室温下，将硅晶片分别在丙酮和乙醇中超声10分钟和5分钟，从而从杂质中去除有机润滑脂。然后，在沸腾的Piranha溶液(4 1 (体积/体积)H2SO4M2O2)和RCA 溶液(1 1 5(体积/体积/体积)ΝΗ3/Η202/Η20)中加热每个去润滑脂的硅基底1小时， 并用去离子(deionized，DI)水漂洗硅基底几次。通过湿蚀刻方法处理洁净的硅基底。用 Teflon瓶作为容器，在室温下使用由去离子水、HF和硝酸银组成的蚀刻混合物。HF和硝酸银的浓度分别为4.6M和0.2M。蚀刻时间根据所需的纳米线长度而有所不同。蚀刻后，在沸腾的王水(3 1(体积/体积)HCVHNO3)中浸没基底15分钟以去除银膜。最后，用去离子水漂洗基底，并在氮气中干燥，以用于表面修饰。可以通过采用不同的蚀刻时间来控制这些化学蚀刻的SiNW的长度。结果，我们能够获得SiNW长度为1 25 μ m的一系列SiNW 基底(图2C)。在制备SiNW基底后，采用NHS-马来酰亚胺化学(图2B)向SiNW表面上引入链霉亲和素。用(体积/体积)3-巯基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液在室温下修饰基底12小时，或者用4% (体积/体积)3-巯基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液在室温下修饰基底45分钟。然后用偶联剂N-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS，0.25mM)处理基底30分钟，使GMBS粘附到基底上。然后，用10 μ g/mL链霉亲和素在室温下处理基底30 分钟使其固定到GMBS上。用IXPBS冲洗基底以去除过量的链霉亲和素，将链霉亲和素包被的SiNW基底在PBS缓冲液(pH = 7. 2)的存在下在4°C储存多至6个月。在临用于细胞捕获实验前，将生物素化的抗-EpCAM(R&D)引入链霉亲和素包被的基底上。实施例2比较利用SiNW基底和平基底捕获之细胞的形态使用扫描电子显微镜(SEM)观察纳米尺度的细胞/基底相互作用。为了维持固定于基底之细胞的形态，通过戊二醛固定、四氧化锇处理和脱水来处理样品。简言之，在基底上孵育细胞M小时后，将细胞用缓冲于0. IM 二甲胂酸钠的1. 5 4%戊二醛固定G°C，1 小时)。然后用四氧化锇后固定(post-fix)细胞1小时，用丹宁酸作为媒染剂。经一系列醇浓度(30% ,50^^70%和90% )使样品脱水，用0. 5%乙酸双氧铀对样品染色，然后进一步脱水(96%、100<%和100(%的醇)。在六甲基二硅氮烷(HDMQ中进行最后一次脱水而后空气干燥。干燥后，用金喷覆样品，然后用加速电压为IOkeV的Hitachi S800场发射SEM检测。可用荧光显微镜观察细胞。通过以1000 1250、80 100和5 20个细胞/mL 的细胞浓度将DiD染色的MCF7乳腺癌细胞掺入兔血来制备对照样品。在IcmX 2cm的基底上添加25 μ L经生物素化的抗-EpCAM (10 μ g/mL,(在含有1 % (重量/体积)BSA和0. 09 % (重量/体积)叠氮化钠的PBS中)，并孵育30分钟。用PBS清洗基底。在基底上加入ImL 样品并孵育45分钟(37°C，5% C02)。用PBS清洗基底，并用4%多聚甲醛(PFA)的PBS溶液固定基底上捕获的细胞20分钟。为染色和观察所捕获的细胞，将0. 9mL的0. 2% Triton X-100的PBS溶液加至基底并孵育10分钟。然后向基底上加入DAPI溶液(1 XDAPI试剂的ImL去离子水溶液)并孵育5分钟。用PBS清洗基底，将基底反转到标准盖玻片上。用 Nikon TE2000荧光显微镜成像并计数细胞。采用颜色、亮度和形态特征(包括细胞大小、形状和细胞核大小)鉴定潜在的CTC并排除细胞碎片和非特异性细胞。显示双染色(红色 DiD+和蓝色DAPI+)并具有某些表型形态学特征的细胞被记为CTC，DAPI+细胞被记为非特异性细胞。如图3A右侧所示，与利用SiNW基底捕获的细胞相比，利用平Si基底捕获的细胞显示显著不同的形态。图3A中的插图是利用平Si基底(上图)和SiNW基底(下图)捕获之细胞的典型形态。在平基底上，有围绕细胞中央部分(通常包括细胞核和核周细胞器) 的板状伪足连成的薄层。这些结果表明，尽管细胞难于附着于平Si基底上，但是细胞一旦与平Si基底连接即开始伸展。与之不同的是，在SiNW基底上，细胞伸出的许多丝状伪足在三维(3D)空间中与纳米线连接，其使用它们的顶部或中部“抓住”纳米线。并且丝状伪足也如SiNW的横向尺寸一样是纳米尺度的(约100 150nm)。尽管SiNW是不动的，但细胞表面组分可以自行排布，使得细胞和基底之间更紧密地局部相互作用。因此，SiNW有利于细胞捕获，并且导致对与平Si基底和SiNW基底相连的细胞所观察到的不同形态。我们还用Daudi B细胞(即癌性B细胞)作为靶细胞以及包被有抗-⑶20的纳米结构捕获Daudi B细胞来确认了这些结果。这些结果在图:3B中显示并与使用MCF7乳腺癌细胞时观察到的结果一致。我们还比较了邻近放置的SiNW基底和平Si基底的结合效率。用光蚀刻与化学蚀刻方法组合在硅基底上施加图案(图3C左图)。我们使用和不用纳米线制备带图案的基底(图3D上部)。在与上述类似的表面修饰和细胞捕获过程后，在荧光显微镜下观察带图案的基底。在这些实验中，我们使用MCF7乳腺癌细胞和包被有抗-EpCAM的纳米结构。如图3D下部所示，与纳米线区域相比，在平区域上观察到显著较少的细胞。这些结果与以上获到的结果一致，并提供了基于纳米线的表面与平表面相比可表现出增强的细胞捕获效果的进一步证据。实施例3捕获时间对细胞捕获效率的影响为了确定实现最大细胞捕获所需的最短时间，我们检测了不同孵育时间下10 μ m SiNW和平Si基底(包被有抗-EpCAM)两者的细胞捕获表现。测试了 3种表达EpCAM的癌细胞(即MCF7、U87脑癌细胞和PC3前列腺癌细胞)。图4A总结了孵育时间与基底所固定之细胞数之间的关系。在SiNW基底存在时，无论检测何种类型的细胞，均在45分钟的孵育时间时达到最大细胞捕获。在45分钟的时间点，与平Si基底相比，IOym SiNW显示出10倍的更佳之细胞捕获效率。对于平Si基底，观察到连续增加的细胞数。然而，与利用SiNW 基底所观察到的相比，平Si基底的总细胞捕获数显著更低。我们通过利用三种不同的基底(无任何表面修饰的SiNW(SiNW-No)、具有链霉亲和素包被的SiNW基底(SiNW-SA)和用抗-EpCAM修饰的SiNW基底(SiNW-SA-EpCAM))进行类似的细胞捕获实验来评价此高捕获产率是否由于SiNW的非特异性相互作用所致。利用 SiNW-No和SiNW-SA基底捕获之细胞数少于利用SiNW基底捕获之细胞数的5% (图幻。因此，利用SiNW基底的高细胞捕获产率是由于SiNW和细胞表面组分之间的物理局部相互作用以及抗-EpCAM与细胞表面上之EpCAM之间的化学识别的协作作用所致。实施例4SiNW长度对细胞捕获效率的影响我们在细胞捕获实验中使用了 SiNW长度为4、6、8、10和20 μ m的一系列SiNW基底。在SiNW基底和平基底上静态孵育含有癌细胞系(即MCF7、U87脑癌细胞或PC3前列腺癌细胞)的样品。在两种基底上均包被抗-EpCAM，如图4B所示，增加的SiNW纵向尺寸使所捕获的细胞数增加。当SiNW的长度大于6μπι时实现最大细胞捕获效率。实施例5从掺杂的全血样品中静态捕获CTC我们测试了我们的装置进行静态细胞捕获的能力。通过以1000、100和5个细胞 /mL血液的细胞密度将表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的U87细胞掺入兔血来制备人工的含CTC之血液样品。在10 μ m EpCAM包被的SiNW基底上孵育所掺杂的样品45分钟。如表1所示，我们的方法具有高捕获产率(> 40%)、高特异性(>40%)和高灵敏度(> 90%)。这些结果表明，本发明的装置比现有领先技术(即具有非常低灵敏度(约20 60% )和非常低特异性(约0. )的免疫磁珠法)表现更佳。
权利要求
1.用于捕获生物细胞的装置，其包含包含纳米结构化表面区域的基底；和连接至所述基底之所述纳米结构化表面区域的多个结合剂，其中所述纳米结构化表面区域包含多个纳米结构，每个所述纳米结构具有纵向尺寸和横向尺寸，所述纵向尺寸至少10倍于所述横向尺寸，并且其中生物细胞被协作作用的所述结合剂和所述多个纳米结构选择性地捕获。
2.权利要求1的装置，其中所述基底是硅基底，并且所述多个纳米结构是硅纳米线或纳米纤维。
3.权利要求1的装置，其中所述基底是金属基底，并且所述多个纳米结构是金属纳米线或纳米纤维。
4.权利要求3的装置，其中所述金属基底包含钛、铝或钢中的至少一种。
5.权利要求1的装置，其中所述基底是无机氧化物基底，并且所述多个纳米结构是无机氧化物纳米线或纳米纤维。
6.权利要求5的装置，其中所述无机氧化物基底包含锌氧化物、硅氧化物、钛氧化物或铝氧化物中的至少一种。
7.权利要求1的装置，其中所述基底是聚合物基底，并且所述多个纳米结构是聚合物纳米线或纳米纤维。
8.权利要求7的装置，其中所述聚合物基底包含聚甲基丙烯酸甲酯、多糖或聚交酯中的至少一种。
9.权利要求2 8中任一项的装置，其中所述纳米线或纳米纤维与所述基底的主体部分形成整体。
10.权利要求2 9中任一项的装置，其中所述纳米线或纳米纤维沉积于所述基底上。
11.权利要求1 10中任一项的装置，其中所述纵向尺寸至少为6μπι长。
12.权利要求1 11中任一项的装置，其中所述横向尺寸大于30nm并且小于400nm。
13.权利要求1 12中任一项的装置，其中所述基底的所述纳米结构化表面区域包被有链霉亲和素，所述结合剂是生物素化的并且连接至所述包被有链霉亲和素之基底的所述纳米结构化表面区域。
14.权利要求1 13中任一项的装置，其中所述多个结合剂包含DNA、肽、适配体和抗体中的一种或多种。
15.权利要求1 13中任一项的装置，其中所述多个结合剂包含多个针对肿瘤细胞的过表达抗体。
16.权利要求1 13中任一项的装置，其中所述多个结合剂是多个抗上皮细胞粘附分子抗体(抗-EpCAM)。
17.权利要求1 13中任一项的装置，其中所述多个结合剂是多个针对免疫细胞的抗体。
18.权利要求1 17中任一项的装置，其还包含连接至所述基底的流动层以形成微流体通道，从而在运行时所述基底之所述纳米结构化表面区域的至少一部分与流经所述微流体通道的流体相接触，其中所述用于捕获生物细胞的装置是微流体装置。
19.权利要求18的装置，其中所述流动层包含带纹理的表面，其引起混沌流以增加所述生物细胞与所述基底之所述纳米结构化表面区域接触从而被捕获的可能性。
20.权利要求19的装置，其中所述带纹理的表面包含多个相对于流体流动之主要方向取向的结构。
21.权利要求20的装置，其中所述多个结构以鲱鱼骨状图案取向。
22.权利要求18 21中任一项的装置，其中所述流动层包含弹性材料聚合物。
23.权利要求22的装置，其中所述弹性材料聚合物包括硅酮聚合物、聚二甲基硅氧烷 (PDMS)和聚四氟乙烯(Teflon)中的一种或多种。
24.用于捕获生物细胞的微流体装置，其包含包含纳米结构化表面区域的基底；连接至所述基底以形成微流体通道的流动层，从而在运行时所述基底之所述纳米结构化表面区域的至少一部分与流经所述微流体通道的流体相接触；和连接至所述基底之所述纳米结构化表面区域的多个结合剂，其中所述纳米结构化表面区域包含多个纳米结构，每个所述纳米结构具有纵向尺寸和横向尺寸，并且其中生物细胞被协作作用的所述结合剂和所述多个纳米结构选择性地捕获。
25.权利要求对的微流体装置，其中所述基底是硅基底，并且所述多个纳米结构是硅纳米线或纳米纤维。
26.权利要求M的微流体装置，其中所述基底是金属基底，并且所述多个纳米结构是金属纳米线或纳米纤维。
27.权利要求沈的微流体装置，其中所述金属基底包含钛、铝或钢中的至少一种。
28.权利要求对的微流体装置，其中所述基底是无机氧化物基底，并且所述多个纳米结构是无机氧化物纳米线或纳米纤维。
29.权利要求观的微流体装置，其中所述无机氧化物基底包含锌氧化物、硅氧化物、钛氧化物或铝氧化物中的至少一种。
30.权利要求M的微流体装置，其中所述基底是聚合物基底，并且所述多个纳米结构是聚合物纳米线或纳米纤维。
31.权利要求30的微流体装置，其中所述聚合物基底包含聚甲基丙烯酸甲酯、多糖或聚交酯中的至少一种。
32.权利要求25 31中任一项的微流体装置，其中所述纳米线或纳米纤维与所述基底的主体部分形成整体。
33.权利要求25 32中任一项的微流体装置，其中所述纳米线或纳米纤维沉积于所述基底上。
34.权利要求M 33中任一项的微流体装置，其中所述纵向尺寸至少为6μ m长。
35.权利要求M 34中任一项的微流体装置，其中所述横向尺寸大于30nm并且小于 400nmo
36.权利要求M 35中任一项的微流体装置，其中所述基底之所述纳米结构化表面区域包被有链霉亲和素，所述结合剂是生物素化的并且连接至所述包被有链霉亲和素之基底的所述纳米结构化表面区域。
37.权利要求24 36中任一项的微流体装置，其中所述多个结合剂包含DNA、肽、适配体和抗体中的一种或多种。
38.权利要求对 36中任一项的微流体装置，其中所述多个结合剂包含多个针对肿瘤细胞的过表达抗体。
39.权利要求M 36中任一项的微流体装置，其中所述多个结合剂是多个抗上皮细胞粘附分子抗体(抗-EpCAM)。
40.权利要求M 36中任一项的微流体装置，其中所述多个结合剂是多个针对免疫细胞的抗体。
41.权利要求M的微流体装置，其中所述流动层包含带纹理的表面，其引起混沌流以增加所述生物细胞与所述基底之所述纳米结构化表面区域接触从而被捕获的可能性。
42.权利要求41的微流体装置，其中所述带纹理的表面包含多个相对于流体流动之主要方向取向的结构。
43.权利要求42的微流体装置，其中所述多个结构以鲱鱼骨状图案取向。
44.权利要求M 43中任一项的装置，其中所述流动层包含弹性材料聚合物。
45.权利要求44的装置，其中所述弹性材料聚合物包括硅酮聚合物、聚二甲基硅氧烷 (PDMS)和聚四氟乙烯(Teflon)中的一种或多种。
46.权利要求M 45中任一项的装置，其还包含流体输入微通道。
47.权利要求M 46中任一项的装置，其还包含与所述微流体装置流体连通的泵。
48.从细胞样品中选择性分离生物细胞的方法，其包括在使所述结合剂与生物细胞亚群选择性结合的条件下，使所述细胞样品与权利要求 1 47中任一项的装置接触，得到所结合的生物细胞；以及从所述装置中去除未结合的生物细胞。
49.权利要求48的方法，其还包括用含水介质清洗所捕获的生物细胞。
50.权利要求48或49的方法，其中所述细胞样品包括体液、血浆、唾液、脊髓液和尿液中的一种或多种。
51.权利要求48 50中任一项的方法，其中所述生物细胞亚群包括循环肿瘤细胞。
52.从细胞样品中选择性分离至少一个靶生物细胞的方法，其包括在使所述靶细胞与连接至所述纳米结构之所述结合剂有效结合的条件下，提供包含至少一个靶生物细胞的细胞样品；以及将所述细胞样品与多个纳米结构接触，从而导致所述靶生物细胞被捕获，其中特异性针对并结合所述靶生物细胞的多个结合剂与所述纳米结构连接；得到所结合的生物细胞。
53.权利要求52的方法，其还包括用含水介质清洗所结合的生物细胞。
54.权利要求52或53的方法，其还包括检测所述靶生物细胞的存在情况。
55.权利要求52 M中任一项的方法，其中所述细胞样品包括体液、血浆、唾液、脊髓液和尿液中的一种或多种。
56.权利要求52 55中任一项的方法，其中所述靶生物细胞包括循环肿瘤细胞。
57.权利要求52 56中任一项的方法，其中所述多个结合剂包括DNA、肽、适配体和抗体中的一种或多种。
58.权利要求52 56中任一项的方法，其中所述多个结合剂包括多个针对肿瘤细胞的过表达抗体。
59.权利要求52 56中任一项的方法，其中所述多个结合剂是多个抗上皮细胞粘附分子抗体(抗-EpCAM)。
60.权利要求52 56中任一项的方法，其中所述多个结合剂是多个针对免疫细胞的抗体。
61.用于从细胞样品中分离至少一个靶生物细胞的试剂盒，其包含权利要求1 47中任一项的装置。
62.权利要求61的试剂盒，其还包含从哺乳动物对象中获取样品和从所述样品中分离生物细胞的说明。
63.权利要求61或62的试剂盒，其中所述靶生物细胞包括循环肿瘤细胞。
全文摘要
本发明提供了用于捕获稀少细胞的装置和方法。使用本文所述的装置和方法可用于辅助诊断和监测转移癌。
文档编号B82B3/00GK102405411SQ201080017232
公开日2012年4月4日 申请日期2010年3月18日 优先权日2009年3月18日
发明者刘侃, 曾宪荣, 王树涛, 王浩 申请人:加利福尼亚大学董事会