一种代代花萼多酚在制备减肥药物中的应用的制作方法

本发明属于中药领域，具体涉及一种代代花萼多酚在制备减肥药物中的应用。

背景技术：

代谢综合征是多种代谢异常症候群的总称，包括肥胖、胰岛素抵抗，血脂异常，高胰岛素血症、高血压等。在这些代谢异常中，肥胖首当其冲，成为其他代谢异常的首要体现，已经在全球范围内危害着人类的健康。Ⅱ型糖尿病、高血压、心脑血管疾病、肿瘤等多种疾病的发生、发展都与肥胖有着密切的关系。目前肥胖已成为危害人类健康的全球性健康问题，它与Ⅱ型糖尿病、高血压、心脑血管疾病、肿瘤等多种疾病的发生、发展密切相关。

3T3-L1前脂肪细胞分离自小鼠胚胎(17～19d)的Swiss 3T3细胞，能特异性地被诱导分化成成熟的脂肪细胞。由于小鼠前体脂肪细胞的取材较为方便，并且关于小鼠前体脂肪细胞的培养研究技术较成熟，使得3T3-L1前脂肪细胞已成为国际上公认的研究脂肪代谢的细胞模型。越来越多的研究发现中药可通过抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖发挥预防或减肥的功效。比如于华强等利用MTT法以及油红O染色法研究不同浓度的芹菜素对前脂肪细胞增殖以及分化的影响，实验结果表明，芹菜素能够显著地抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖以及分化，并呈剂量依赖性，提示芹菜素可能具有预防或治疗肥胖的作用。

代代(Citrus aurantium L.var.amara Engl)是芸香科柑橘属植物酸橙的一个变种，代代花是其花蕾的干品，具有良好的药理作用，常用于治疗气郁不舒、脘腹胀痛、积食不化、恶心呕吐等。目前国内外对代代花的研究主要以其挥发油类化合物为主，而对代代花其它有效成分的研究报道几乎没有。代代花作为药食两用价值的天然保健品，其有效成分的提取纯化和药理活性等方面的研究还有待进一步深入探讨，全面加强代代花的生物利用，对于开发新药、指导临床用药具有重要的意义。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种代代花萼多酚在制备减肥药物中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种代代花萼多酚在制备减肥药物中的应用。

所述代代花萼多酚的制备方法，包含如下步骤：

将代代花萼粗粉加入溶剂中，加热提取，离心取上清液，浓缩，干燥，得代代花萼多酚；所述溶剂为水、甲醇溶液或乙醇溶液。

以蒸馏水做为溶剂提取到的代代花萼多酚记为CAV-W，以乙醇做为溶剂提取到的代代花萼多酚记为CAV-E，以甲醇做为溶剂提取到的代代花萼多酚记为CAV-M。

所述溶剂与代代花萼粗粉的体积质量比(水料比)为(10～30)mL:1g；

所述加热提取的温度为80～100℃；所述加热提取的时间为1～3h。

所述离心的转速为3000～5000r/min；所述离心的时间为8～12min。

所述浓缩为减压浓缩；所述减压浓缩的温度为40～60℃。

所述乙醇水溶液的体积分数40～60％、所述甲醇水溶液的体积分数为40～60％。

所述代代花萼粗粉是将代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)进行干燥，粉碎过筛得到。

所述干燥温度为40～60℃；所述干燥时间为12～24h；所述的粉碎过筛为40～60目筛。

一种代代花萼多酚(CAV-W、CAV-E、CAV-M)，通过上述制备方法制备得到；

所述的代代花萼多酚(CAV-W、CAV-E、CAV-M)在制备减肥药物中的应用；

所述的代代花萼多酚(CAV-W、CAV-E、CAV-M)可作为新型的减肥药物，应用于肥胖症的治疗。

一种减肥药物，含有上述代代花萼多酚(CAV-W、CAV-E、CAV-M)中的至少一种；

本发明的原理：天然植物来源的有效成分能通过抑制前脂肪细胞的增殖发挥减肥的功效。本发明发现和确证天然植物有效成分具有显著的减肥活性，且使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也较低。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明首次发现代代花萼多酚(CAV-W、CAV-E、CAV-M)在体外能显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖。

(2)本发明使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也较低。

附图说明

图1为实施例1制备得到的代代花萼多酚CAV-W、CAV-E和CAV-M对3T3-L1前脂肪细胞增殖抑制作用图；

图2为采用Folin-Ciocalteu比色法测得的没食子酸标准曲线，以此曲线计算实施例1制备的代代花萼多酚的得率。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中，小鼠3T3-L1前脂肪细胞购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心；代代花萼购自广州清平药材市场。

实施例1从代代花萼中制备得到代代花萼多酚CAV-W、CAV-E和CAV-M

(1)将代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于电热鼓风干燥箱中50℃干燥24h，用粉碎机粉碎后，过60目筛，得代代花萼粗粉备用；

(2)称量代代花萼粗粉5.0g三份于锥形瓶中，分别加入100mL的蒸馏水、100mL的50％乙醇溶液和100mL的50％甲醇溶液，充分震荡摇匀，水浴锅90℃加热1h；加热结束后，离心机4000r/min下离心10min，取上层澄清液，将上清液用旋转蒸发仪在50℃下减压浓缩，50℃下真空干燥箱干燥至恒重，即得代代花萼多酚(其中用蒸馏水做为溶剂的命名为CAV-W，用50％乙醇溶液做为溶剂的命名为CAV-E，用50％甲醇溶液做为溶剂的命名为CAV-M)。

实施例2从代代花萼中制备得到代代花萼多酚CAV-W、CAV-E和CAV-M

(1)将代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于电热鼓风干燥箱中45℃干燥18h，用粉碎机粉碎后，过50目筛，得代代花萼粗粉备用；

(2)称量代代花萼粗粉5.0g三份于锥形瓶中，分别加入150mL的蒸馏水、150mL的60％乙醇溶液和150mL的60％甲醇溶液，充分震荡摇匀，水浴锅100℃加热2h；加热结束后，离心机3000r/min下离心12min，取上层澄清液，将上清液用旋转蒸发仪在55℃下减压浓缩，55℃真空干燥箱干燥至恒重，即得代代花萼多酚(其中用蒸馏水做为溶剂的命名为CAV-W，用60％乙醇溶液做为溶剂的命名为CAV-E，用60％甲醇溶液做为溶剂的命名为CAV-M)。

实施例3从代代花萼中制备得到代代花萼多酚CAV-W、CAV-E和CAV-M

(1)将代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于电热鼓风干燥箱中50℃干燥24h，用粉碎机粉碎后，过60目筛，得代代花萼粗粉备用；

(2)称量代代花萼粗粉5.0g三份于锥形瓶中，分别加入50mL的蒸馏水、50mL的40％乙醇溶液和50mL的40％甲醇溶液，充分震荡摇匀，水浴锅80℃加热3h；加热结束后，离心机5000r/min下离心8min，取上层澄清液，将上清液用旋转蒸发仪在60℃下减压浓缩，60℃真空干燥箱干燥至恒重，即得代代花萼多酚(其中用蒸馏水做为溶剂的命名为CAV-W，用40％乙醇溶液做为溶剂的命名为CAV-E，用40％甲醇溶液做为溶剂的命名为CAV-M)。

实施例4Folin-Ciocalteu比色法测定代代花萼多酚CAV-W、CAV-E和CAV-M中多酚含量

(1)没食子酸标准曲线的测定：精确称量5.0mg没食子酸粉末，加蒸馏水完全溶解并定容至25mL，得到0.2mg/mL的没食子酸母液。取10个25mL的容量瓶，各加入0.2mg/mL的没食子酸母液0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL，0.7mL，0.8mL，0.9mL，1.0mL，再分别加入蒸馏水0.9mL，0.8mL，0.7mL，0.6mL，0.5mL，0.4mL，0.3mL，0.2mL，0.1mL，0mL，则分别得0.02mg/mL，0.04mg/mL，0.06mg/mL，0.08mg/mL，0.1mg/mL，0.12mg/mL，0.14mg/mL，0.16mg/mL，0.18mg/mL，0.2mg/mL的没食子酸溶液各1mL。然后在每个容量瓶中加入3.0ml的福林酚试剂，充分摇匀后再室温下静置反应5min，再加入4.5ml的饱和Na2CO3溶液，加水定容至25ml，摇匀，避光静置反应2h，用紫外分光光度计检测在747nm处的吸光值。以没食子酸浓度为横坐标，747nm处的吸光值为纵坐标绘制没食子酸标准曲线。

(2)样品多酚含量的测定：将由实施例1制得的CAV-W、CAV-E和CAV-M用蒸馏水完全溶解，并定容至100mL，混匀，用移液枪移取200μL CAV-W、CAV-E和CAV-M样品溶液于25mL容量瓶中，加入3mL福林酚试剂，混匀静置5min后，再加入4.5mL饱和的Na2CO3溶液，加蒸馏水定容，混匀，室温下避光反应2h，然后用紫外分光光度计测定在747nm下的吸光值。

图2为没食子酸标准曲线，利用此曲线经测定和计算得到代代花萼多酚CAV-W、CAV-E和CAV-M的多酚得率分别为3.7％、2.1％和3.3％，表明以蒸馏水做为提取溶剂得到的代代花萼多酚的得率更高。

实施例5MTT法检测代代花萼多酚CAV-W、CAV-E、CAV-M对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

分别取生长对数期的小鼠3T3-L1前脂肪细胞，1000rpm离心5min，弃去上清液，用含质量分数为10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞数为5×10⁴/mL，100μL接种于96孔培养板中，置于5％CO₂培养箱中，37℃培养24h后，弃去上清液，各组分别加入含有CAV-W(实施例1制得)、CAV-E(实施例1制得)、CAV-M(实施例1制得)的DMEM培养基(CAV-W、CAV-E、CAV-M的终浓度分别为31.25、62.5、125、250和500μg/mL)。在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，弃去上清液，PBS清洗两次，每孔加入200μL不含血清的DMEM基础培养基和20μL噻唑蓝(MTT)，放入培养箱中继续孵育4h，弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，避光放置于微量振荡器均匀震荡10min，用酶标仪测量在490nm波长下的OD值，计算细胞增殖抑制率；

而CAV-W(图1)、CAV-E(图1)、CAV-M(图1)在31.25～500μg/mL范围内对小鼠3T3-L1前脂肪细胞均表现出显著的增殖抑制作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。