孕酮完全抗原的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种孕酮完全抗原的制备方法及其应用，本发明通过碳二亚胺法(EDC)将活化的11α-羟孕酮(11α-OH-P4)，与卵清白蛋白(OVA)，选用进行偶联，制备免疫抗原。最后将制备的免疫抗原通过免疫小鼠制备抗血清，并确定检测抗原的最佳包被浓度。
【专利说明】孕酮完全抗原的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物领域，具体涉及一种孕酮完全抗原的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 由于孕酮是一种小分子物质，不具备免疫原性，无法令其注入机体后产生抗体。常 用的方法是利用偶联剂做为媒介，通过半抗原和载体蛋白的偶联制备完全抗原。偶联方法 的不同和载体蛋白的选择对完全抗原的免疫活性具有一定的影响。
【发明内容】
[0003] 为解决上述问题，本发明提供了一种孕酮完全抗原的制备方法及其应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0005] 孕酮完全抗原的制备方法，包括如下步骤：
[0006] S1、将lOOmgll α -〇H-P4与30mg半琥珀酸酯化物溶于5mL无水吡啶中，在95°C水 浴锅中水浴90min后，95°C烘干，转化为黄色结晶109. 3mg。
[0007] S2、在0· 5mL DMF中溶解30mg S1所得的11 a -〇H-P4_HS(ll α -羟基孕酮半琥珀 酸酯）；
[0008] S3、再将 8. 94mg NHS 和 16. 02mg DCC 分别溶于 0· OlmL DMF 中；
[0009] S4、将上述S2所得溶液加入S3所得溶液中后，室温下振荡90min ;
[0010] S5、取A、B两份7mL PBS溶液，在A溶液中加入95. 2mg BSA，在B溶液中加入95. 2mg OVA后，分别加入S4所得溶液中，4°C下搅拌过夜；；
[0011] S6、将S5所得A、B液体分别装入透析袋中，在0. lmol/L NaHC032. 2L中透析4. 5小 时，在2. 2L去离子水中透析5小时，三次，最后放入pH = 7. 0的PBS溶液，中透析过夜；
[0012] S7、取出透析袋内液体，低温离心机4?，lOOOOrpm离心30min，弃去沉淀，取上清 液；
[0013] S8、将S7所得上清液真空冷冻干燥，制备出P4_BSA偶联物和P4-〇VA偶联物。
[0014] 作为优选，所述的步骤S5中PBS溶液的PH为7。
[0015] 本发明还公开了上述方法所制备的孕酮完全抗原的应用。
[0016] 本发明通过碳二亚胺法（EDC)将活化的11α-羟孕酮（11α-〇H-P4)，与卵清白蛋 白（0VA)，选用进行偶联，制备免疫抗原。最后将制备的免疫抗原通过免疫小鼠制备抗血清， 并确定检测抗原的最佳包被浓度。
【具体实施方式】
[0017] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发 明。
[0018] 本具体实施提供了一种孕酮完全抗原的制备方法，包括如下步骤：
[0019] S1、将lOOmgll α -〇H-P4与30mg半琥珀酸酯化物溶于5mL无水吡啶中，在95°C水 浴锅中水浴90min后，95°C烘干，转化为黄色结晶109. 3mg。
[0020] S2、在(λ 5mL DMF中溶解30mg S1所得的11 a -〇H-P4-HS (11 α -羟基孕酮半琥珀 酸酯）；
[0021] S3、再将 8. 94mg NHS 和 16. 02mg DCC 分别溶于 0· OlmL DMF 中；
[0022] S4、将上述S2所得溶液加入S3所得溶液中后，室温下振荡90min ;
[0023] S5、取A、B两份7mL PBS溶液（PH = 7)，在A溶液中加入95. 2mg BSA，在B溶液中 加入95. 2mg OVA后，分别加入S4所得溶液中，4°C下搅拌过夜；；
[0024] S6、将S5所得A、B液体分别装入透析袋中，在0. lmol/L NaHC032. 2L中透析4. 5小 时，在2. 2L去离子水中透析5小时，三次，最后放入pH = 7. 0的PBS溶液，中透析过夜；
[0025] S7、取出透析袋内液体，低温离心机4?，lOOOOrpm离心30min，弃去沉淀，取上清 液；
[0026] S8、将S7所得上清液真空冷冻干燥，制备出P4_BSA偶联物和P4-〇VA偶联物。
[0027] 本发明还公开了上述方法所制备的孕酮完全抗原的应用。
[0028] 实施例
[0029] 制备抗血清
[0030] 选取6-8周龄雄性BALB/c小鼠10只，用自制P4-BSA免疫抗原进行多次免疫。首 次免疫：取1. 0mg/mL50 μ LP4-BSA与等量FCA完全乳化后，对每只小鼠腹腔注射，免疫时间 14d ;二次免疫：取1. 0mg/mL50 μ LP4-BSA与等量FIA完全乳化，对每只小鼠腹腔注射，免疫 时间14d ;加强免疫：取1. 0mg/mL50l·! LP4-BSA，对每只小鼠腹腔注射，免疫时间10d。最后 将小鼠挖眼采集血液样品，经离心分离血清，抗血清性质的鉴定。
[0031] 间接ELISA试验
[0032] ①将预先配置的抗原包被液稀释检测抗原，每个孔中加入100 μ L，37°C条件下静 置30min后，置于4°C冰箱12h ;
[0033] ②每孔加入预先配置的封闭液200 μ L，37°C恒温箱温育2h ;
[0034] ③每孔加入预先配置的洗涤液100-200 μ L，如此反复洗涤3次；每次洗涤3分钟 左右；
[0035] ④将加入已用PBS稀释的血清，每孔加100μ L，37°C下湿盒静置lh ;
[0036] ⑤洗涤方法同上；
[0037] ⑥将已用PBS稀释的（1 : 2000)HRP-酶标二抗每孔中加入lOOyL，在37°C下湿 盒静置反应lh ;
[0038] ⑦洗涤方法同上；
[0039] ⑧将每孔中加入100μ L底物，在37°C下避光静置lh ;
[0040] ⑨将每孔中加入50 μ L终止液；
[0041] ⑩将酶标板用酶标仪读出每孔0D490nm值（重复测定3次取平均值）。
[0042] 抗原P4_0VA最适包被浓度
[0043] 包被的抗原P4_0VA最佳稀释浓度利用方阵滴定法测定，即最适包被浓度。横 向用抗血清包被（分别以A-F命名），按照1 : 4·0Χ103、1 : 8·0Χ103、1 : 1.6X104、 1 : 3. 2X104、1 : 6. 4Χ104和1 : 1.28Χ105的稀释浓度包被与酶标板中。纵向（分别以 a-g 命名）用检测抗原 P4-〇VA 按 1 : LOXlO^l : 2·0Χ101、1 : tOXlO^l : 8.0X101、 1 : 1.6X102、1 : 3. 2X102、1 : 1.28X 103的稀释浓度包被与酶标板中，要在ELISA试验中 设横向h和i则分别为阴性对照和空白对照。操作方法同间接ELISA试验，结果以0D 49(lnm 值最接近于1. 0的判定为P4_〇VA最适包被浓度。
[0044] 抗血清与完全抗原中孕酮残基的特异性
[0045] 将最适包被浓度的抗原P4_0VA与OVA分别包被于酶标板中，用封闭液封闭后，将 50 μ LP4-BSA加入12个酶标板孔中。将25 μ g/ml孕酮标准品放入甲醇中稀释（按照1 : 10 做为开始倍比，做12个梯度），振荡混匀20min，之后每孔加入50 μ L在上述12个酶标板孔 中。将PBS缓冲液同无孕酮的甲醇混合为对照。按照间接ELISA试验方法进行操作，测定 每孔00490_值。
[0046] 抗血清与游离的孕酮的特异性
[0047] 将最适包被浓度的抗原P4_0VA包被于酶标板中，用封闭液封闭后，将倍比抗血清 和空白对照（PBS缓冲液）按照间接ELISA试验方法进行操作，测定每孔0D 49(lnm值后，分别 计算OVA孔与空白对照孔的比值和P4-〇VA孔与OVA孔的比值。
[0048] 抗原P4-0VA最适包被浓度测定结果
[0049] 通过方阵法进行抗原P4_0VA最适包被浓度的鉴定。结果显示（表1) :P4-〇VA包 被浓度越高，〇D45tol值越高。通过观察发现0D45(lnm值为1. 0孔为抗原P4-〇VA的包被浓度为 1 : 160,抗血清的稀释浓度为1 : 32000,故将其作为最适包被浓度。
[0050] 表1抗原p4-ova最适包被浓度
[0051]
【权利要求】
1. 孕酮完全抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 51、 将lOOmgll α -〇H-P4与30mg半琥珀酸酯化物溶于5mL无水吡啶中，在95°C水浴锅 中水浴90min后，95°C烘干，转化为黄色结晶109. 3mg。 52、 在 0· 5mL DMF 中溶解 30mg S1 所得的 11 a -〇H-P4-HS ; 53、 再将 8. 94mg NHS 和 16. 02mg DCC 分别溶于 0. OlmL DMF 中； 54、 将上述S2所得溶液加入S3所得溶液中后，室温下振荡90min ; 55、 取A、B两份7mL PBS溶液，在A溶液中加入95.2mg BSA，在B溶液中加入95.2mg OVA后，分别加入S4所得溶液中，4°C下搅拌过夜；； 56、 将S5所得A、B液体分别装入透析袋中，在0. lmol/L NaHC032. 2L中透析4. 5小时， 在2. 2L去离子水中透析5小时，三次，最后放入pH = 7. 0的PBS溶液，中透析过夜； 57、 取出透析袋内液体，低温离心机4?，lOOOOrpm离心30min，弃去沉淀，取上清液； 58、 将S7所得上清液真空冷冻干燥，制备出P4-BSA偶联物和P4-〇VA偶联物。
2. 根据权利要求1所述的孕酮完全抗原的制备，其特征在于，所述的步骤S5中PBS溶 液的PH为7。
3. 如权利要求1所制备的孕酮完全抗原的应用。
【文档编号】G01N33/74GK104086648SQ201410229282
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年5月22日 优先权日:2014年5月22日
【发明者】夏成, 吴凌, 徐闯, 舒适, 许楚楚, 肖鑫焕, 沈泰玉, 张洪友, 包军 申请人:黑龙江八一农垦大学