一种抗膝沟藻毒素gtx2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种抗膝沟藻毒素 GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条及其 制备方法，属于贝类毒素单克隆抗体快速检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，由于水体富营养化致使藻类异常增殖，并释放藻毒素 (Algae Toxin)，运 些次级代谢产物严重危害了人类的用水安全和其他水生生物的安全，其中W膝沟藻 (gonyautoxin，GTX)产生的麻搏性贝类毒素引起了更多的重视。膝沟藻毒素 GTX2,3为已经 发现的60多种膝沟藻毒素异构体的其中一种，是我国南方沿海染毒贝类和有毒赤潮藻的麻 搏性贝类毒素的主要成分之一，其特点是相对分子小、毒性大，对人体危害严重，不具备完 全抗原特性。
[000引随着对膝沟藻毒素 GTX2,3的研究越来越多，专利CN201210325168.0和专利 CN201310279284.8分别公开一种膝沟藻毒素 GTX2,3人工抗原制备的新方法和一种膝沟藻 毒素 GTX2，3完全抗原的制备方法，其在人工完全抗原制备技术上得到了发展。
[0004]在麻搏性贝类毒素的检测技术方面，小鼠生物测试法是常用的检测麻搏性贝类毒 素的方法。但此种方法不能确知毒素的组成及含量，且重复性差，灵敏度不高。近儿年发展 起来的HPLC法具有灵敏、高效的特点，但成本高，费时，需要较高的仪器设备及分析技术。酶 联免疫吸附测定技术巧LISA)具有简便、快速、灵敏、成本低廉等特点，是目前最有前途的检 测麻搏性贝类毒素技术。
[000引其中纸条快速检测技术是近年来逐渐发展成熟的一项简便、快速、检测成本低廉 的免疫学检测技术。该技术W抗体对抗原的特异性识别和单向免疫膜层析技术为基础。试 纸条检测不仅可W进行定性检测，而且也可W实现定量或半定量检测。单克隆抗体为该技 术的核屯、，高亲和力、适合亚型、位点配对、高度特异、识别谱广是对单抗的具体要求。随着 快速检测技术的发展，集成多目标，实现高通量、多残留检测的呵视"检测忍片是我们未来 试纸条检测发展的方向。多位点抗原测、抗体水平检测、半抗原小分子残留检测是未来发展 目标。
[0006] 因为GTX是贝类毒素中危害严重的毒素之一，误食带有GTX毒素的蟹及贝类会导致 人类很高的死亡率。鉴于GTX及GTX毒素目前尚无有效的治疗方法，快速准确的毒素分离检 测及其人工抗原的制备技术已成为各国学者研究的焦点及难点之一，迫切需要一种简便、 快速准确、现场的检测方法，快速检测试纸条的研制与开发正好有望满足运种需要，但是目 前在检测GTX2，3的快速测试纸条的技术上，还未见报道。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术存在小分子膝沟藻毒素 GTX2,3人工抗原制备难，因此难W实 现其单克隆抗体金标试纸条的问题，应用本发明人制备的GTX2,3人工抗原，得到GTX2,3单 克隆抗体，提供一种抗膝沟藻毒素 GTX2，3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，针对海洋 环境尤其是南方近海污染日益严重导致Cl'S贝类毒素在贝类及蟹等水生生物体内蓄积，对 人体造成危害，迫切需要一种简便、快速、准确的现场检测方法，本发明是依据贝类及蟹等 水生生物生理学特点而设计发明的，采用间接ELISA竞争原理制备而成，W达到快速、准确、 简便、灵敏度高、现场检测目的。
[0008] 为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是： 一种抗膝沟藻毒素 GTX2，3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，所述的试纸条底层为 支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、硝 酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，金标抗体纤维层中的金标抗体为抗Cl'S毒素单克隆抗 体，该抗体是用本发明人制备的GTX2，3人工抗原，制备得到GTX2，3单克隆抗体;在硝酸纤维 素膜层上设有膝沟藻毒素控制线(C)和检测线(T)。
[0009] 所述的抗膝沟藻毒素 GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，其线性检测范 围为0.277 ~9.852iig/mL。
[0010] 所述的控制线(C)和检测线(T)，分别包被有羊抗鼠二抗和包被GTX2,3-Gly-KLH抗 原。
[0011] 所述的免疫胶体金标记试纸条，其使用方法为检测端充分浸泡于待测液体中，37 °C恒溫反应；阳性一一白色显示区上下呈现两条红线；阴性：白色显示区上呈现一条红色控 审Ij线C;无效：IOmin内无控制线C出现。
[0012] -种抗膝沟藻毒素 GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条的制备方法，包括 抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被、膝沟藻毒素 GTX2,3的单克隆抗体的制备、胶体金的制备、胶体 金标记抗体、试纸制备步骤。
[0013] 所述的膝沟藻毒素 GTX2,3的单克隆抗体的制备，利用专利CN201210325168.0膝沟 藻毒素 GTX2，3人工抗原加强免疫后的雌性BALB/C小鼠脾细胞中筛选培育的杂交瘤细胞系 4C2,2F10注射预先用无菌石蜡油处理过的BAIB/C小鼠，收集该小鼠的腹水，一硫酸锭利用 辛酸一硫酸锭法对收集的腹水进行柱纯化处理得到抗膝沟藻毒素 GTX2，3单抗； 所述的抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被，条件为封闭条件采用0.5~2%明胶37°C封闭20~ 40min，包被条件为37°C包被0.5~化，包被浓度为^2.5y g/mL 所述的胶体金的制备，为每0.01%氯金酸溶液IOOlul与0.1%巧樣酸=钢2.加 I混合，加 热致l〇〇°C制成胶体金溶液，用0.2~0.3%碳酸钟调至8.2~8.4; 所述的胶体金标记抗体，按每ImL胶体金5~IOug抗GTX单抗的添加量加入到制备好的胶 体金溶液中，慢揽5~20min，4°C过夜，然后将其在4°C下ISOOOg离屯、50~70min，弃上清，取其 沉淀重悬于0.02%叠氮钢、0.5%Tween-20的0.0 lMPBS中，真空冷冻干燥，备用； 所述的试纸制备，为硝酸纤维素膜层用将质量浓度为^3 g/L包被GTX2，3-Gly-KLH包 被于的检测线(T线），包被量为0.5~2 iiL/cm;在距离检测线3 mm处将质量浓度为10~50 g/ L的羊抗鼠二抗包被于质控线(C线），包被量为0.5~化L/cm。包被完毕后将包被好的硝酸纤 维素膜置于37 °C烘干50~80 min,取出；将样品吸收垫置于浓度为0.1 mol/L(抑值为7.2， 体积分数0.5%)胶体金标记抗体的憐酸盐缓冲液中浸泡5~7 h，37 °C烘干;最后吸附层从测 试端依次为吸附纤维层、硝酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，再按试纸条底层为支撑层， 中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，安装好，按需切割成形，即得。
[0014]本发明具有如下优点： 本发明采用间接化ISA竞争原理制备而成，可W在较低的待测抗原浓度达到运一相对 结合率，且使用酶标二抗进行系统放大时，因此灵敏度大大提高。该试纸条简便、可靠，可有 效应用于现场检验，易于推广应用，具有良好的社会和经济价值。经过性能测试结果表明， 本专利提供的抗膝沟藻毒素 GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，灵敏度高，特异 性高，稳定性好。
【附图说明】
[001引图1 Snm胶体胶体金颗粒标记后的胶体金颗粒。
【具体实施方式】
[0016] 下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，运些实施例仅用来说明本发明，并 不限制本发明的范围。
[0017] 实施例1 一种抗膝沟藻毒素 GTX2，3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，所述的试纸条底层为 支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、硝 酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，金标抗体纤维层中的金标抗体为抗Cl'S毒素单克隆抗 体;在硝酸纤维素膜层上设有膝沟藻毒素设有控制线(C)和检测线(T)。
[0018] -种抗膝沟藻毒素 GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条的制备方法，包括 抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被、膝沟藻毒素 GTX2,3的单克隆抗体的制备、胶体金的制备、胶体 金标记抗体、试纸制备步骤： 膝沟藻毒素 GTX2,3的单克隆抗体的制备：利用专利CN201210325168.0膝沟藻毒素 GTX2,3人工抗原加强免疫后的雌性BALB/C小鼠脾细胞中筛选培育的杂交瘤细胞系4C2， 2F10注射预先用无菌石蜡油处理过的BAIB/C小鼠，收集该小鼠的腹水，利用辛酸一硫酸锭 法对收集的腹水进行柱纯化处理得到抗膝沟藻毒素 GTX2，3单抗； 抗原GTX2，3-Gly-KLH的包被:封闭条件采用0.5%明胶37°C封闭20min，包被条件为37°C 包被0.化，包