呼吸道合胞病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的呼吸道合胞病毒抗体的快速检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于诊断呼吸道合胞病毒感染的呼吸道合胞病毒抗原，制备该抗原的方法，用该抗原测定呼吸道合胞病毒感染的方法及试剂，属于临床医学检测领域。将人工合成优化的呼吸道合胞病毒F1基因构建原核表达载体，大肠杆菌表达呼吸道合胞病毒F1抗原，采用透析法、梯度稀释法和凝胶层析法复性包涵体，获得具有三维结构和免疫活性的重组呼吸道合胞病毒F1蛋白抗原。本发明应用胶体金免疫层析技术，以工程表达的呼吸道合胞病毒F1抗原为检测抗原，以高效抗人IgG或IgM单克隆抗体作为捕获抗体，用滤血膜过滤红血球，依据“间接法”原理制备呼吸道合胞病毒抗体快速检测试剂盒，用于检测人体血清、血浆或全血中呼吸道合胞病毒抗体，具有检测方法简单，结果显示准确、快速，无需特殊仪器设备的优点。
【专利说明】
呼吸道合胞病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的呼吸道合 胞病毒抗体的快速检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于诊断呼吸道合胞病毒感染的呼吸道合胞病毒抗原，制备该抗 原的方法，用该抗原测定呼吸道合胞病毒的方法及试剂，属于临床医学检测领域。本发明在 由呼吸道合胞病毒引起的婴幼儿急性下呼吸道感染的诊断中有重要意义。
【背景技术】
[0002] 呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus, RSV)简称合胞病毒，是世界 各地婴幼儿急性下呼吸道感染最重要的病毒病原，流行面广，发病率高，约50%的婴儿肺炎 和90%的婴儿支气管炎均由RSV感染所致。在发展中国家，5岁以下儿童因 RSV感染住院病人 的死亡率为7%，发达国家为0.5%~2.0%。我国每年平约有1500万婴儿出生，90%以上小于2岁 的儿童都感染过呼吸道合胞病毒，且反复感染的几率较高。此外，呼吸道合胞病毒可引起上 呼吸道疾病，症状包括发热、鼻塞、咽炎和中耳炎，呼吸道症状的哮喘，支气管炎，小支气管 炎和肺炎。最新研究发现免疫功能缺陷的成年人及老年人也是RSV的易感人群。在我国呼吸 道合胞病毒还是引发流行性喘憋性肺炎的主要病原，可引起婴幼儿尤其是新生儿较高的病 死率，与支气管哮喘的发作也存在相关性。
[0003] 病原微生物感染的实验室检测主要包括对感染部位的病原菌的检测和对患者血 清、体液中的抗体检测两种方法。目前呼吸道合胞病毒检测主要有分离培养法、聚合酶链式 反应(PCR)法、免疫荧光抗体技术(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和酶桥联技术(APAAP) 等。培养法是呼吸道合胞病毒诊断的"金标准"，但这种方法通常耗时长久，要求严格的的运 输过程和复杂的技术，不适合于快速诊断。聚合酶链式反应(PCR)法等核酸检测技术虽然具 有较高的特异性和敏感性，但其准确性不高，极易造成污染。抗体检测是比较理想的检测呼 吸道合胞病毒感染的方法之一。目前常用的抗体检测技术有免疫荧光抗体技术(IFA)、酶联 免疫吸附试验(ELISA)、酶桥联技术(APAAP)等。IgM是人体感染RSV后初次免疫应答中出现 最早的免疫球蛋白，感染后卜3周在血清中检出，提示新近感染，再次感染后一般IgM不出 现，因此IgM可作为感染早期的诊断标志；IgG是机体再次免疫应答的主要抗体，感染后7~8 周达到峰值，具有重要的免疫效应，可作为感染中后期及再次感染的诊断标志。本发明可对 血浆、血清或全血中的呼吸道合胞病毒抗体IgM/IgG进行同时检测，确定感染阶段。
[0004] 呼吸道合胞病毒的F蛋白（Fusion protein)具有较好的免疫原性，F蛋白是呼吸道 合胞病毒重要的膜蛋白成分，与病毒进入细胞并形成特征性的合胞体有关，还具有促使RSV 在感染细胞间传播及溶血的作用，也是激发机体产生保护性抗体最主要的病毒抗原。合胞 病毒表达的F蛋白前体FO是没有活性的，要经过剪切加工形成Fl和F2的复合体，才能成为有 活性的蛋白，且抗原表位主要集中在Fl段。目前所用的F蛋白来源主要是直接从病毒纯化或 者利用真核系统表达，存在产量较低等问题。因此，制备一种特异性强、检测敏感度高的呼 吸道合胞病毒抗原及一种快速检测呼吸道合胞病毒抗体的试剂盒非常有实际需要。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一目的是提供一种呼吸道合胞病毒特异性抗原，该抗原是F蛋白的部 分序列经过优化后原核表达所得，具有免疫原性高，无特异反应，抗原表位集中等优点。
[0006] 本发明的第二目的是提供一种制备呼吸道合胞病毒抗原的方法，通过该方法制备 的呼吸道合胞病毒抗原具有表达量高，收率高和免疫反应性强的特点。
[0007] 本发明的第三目的是提供一种检测呼吸道合胞病毒抗体的方法，该方法为快速 "一步检测法"，具有灵敏度高、特异性强，检测速度快、操作简便，无需专门设备，适用于临 床检测、流行病学调查和场地检疫等多种场合。
[0008] 本发明的第四目的是提供一种呼吸道合胞病毒抗体快速检测试剂盒，它是一种特 异性强、灵敏度高、快速、简便的"一步法"呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒。
[0009] 本发明的主要内容如下。
[0010] (1)呼吸道合胞病毒抗原，它是一种采用基因工程技术表达的抗原。
[0011] (2)-种制备呼吸道合胞病毒抗原的方法，包括人工合成优化的呼吸道合胞病毒F 蛋白抗原部分基因序列F1，构建原核表达载体，大肠杆菌表达呼吸道合胞病毒Fl抗原蛋白， 采用透析法、梯度稀释法和凝胶层析法复性包涵体，获得具有三维结构和免疫活性的重组 呼吸道合胞病毒Fl蛋白抗原。
[0012] (3)-种呼吸道合胞病毒抗体快速检测方法，包括上述（1)中的呼吸道合胞病毒抗 原固定到硝酸纤维素膜，一种标记抗体(二抗）固定到固相载体，待测样品与标记抗体(二 抗)接触，若待测样品中存在呼吸道合胞病毒抗体，则呼吸道合胞病毒抗体与标记二抗形成 抗体-标记二抗复合物，"复合物"在硝酸纤维素膜水平移动，遇到固定到膜上的呼吸道合胞 病毒抗原产生反应，带有标记的"复合物"就被特异地固定到抗原上，固定抗原的位置就会 有显色反应;若待测样品不含呼吸道合胞病毒抗体，则"复合物"不能固定到抗原的位置上， 此处就没有显色反应，可依据硝酸纤维素膜固定抗原位置是否有显色反应，来判断检测结 果，即待测样品中是否有呼吸道合胞病毒抗体。
[0013] (4)上述(3)呼吸道合胞病毒抗体检测方法，其中待测样品是全血、血浆或者血清。
[0014] (5 )上述(3 )或(4 )中测定呼吸道合胞病毒抗体的方法，其中的标记抗体(二抗)是 标记的抗人I gM或I gG抗体。
[0015] (6)上述(3)-(5)中标记抗体是胶体金属颗粒或者彩色胶乳颗粒标记的抗体。
[0016] (7)-种快速检测呼吸道合胞病毒抗体的试剂盒，它所用抗原为上述(1)中的呼吸 道合胞病毒抗原，所用方法为上述(3)中所说方法。
[0017] (8)上述(7)中用于检测的试剂盒，在样品垫上固定有滤血膜，所述滤血膜是由固 定有抗红细胞单抗或者多抗的无纺布或玻璃纤维构成。
[0018] 下面对本发明进行详细阐述。
[0019] 本发明的呼吸道合胞病毒抗原，主要通过将优化的呼吸道合胞病毒F蛋白部分基 因 Fl构建到原核表达载体pET30a，pET30a-Fl基因表达载体转化大肠杆菌，筛选阳性重组 菌，IPTG诱导重组菌表达呼吸道合胞病毒Fl蛋白，经细菌裂解、包涵体溶解和重组蛋白结构 复性与纯化等步骤获得。
[0020] 下面将详述本发明制备呼吸道合胞病毒抗原的方法。
[0021]从GenBank获取呼吸道合胞病毒F蛋白基因序列，根据呼吸道合胞病毒F蛋白基因 优化密码子，人工合成呼吸道合胞病毒F蛋白部分基因序列F1。目的基因经双酶切后与经同 样双酶切获得的原核表达载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞、筛选阳性重组菌。阳性克隆 菌经质粒提取、双酶切和测序鉴定，证明插入的目的基因正确。重组菌经IPTG诱导表达、离 心得重组菌沉淀，菌体重悬于缓冲液后超声裂解，离心获得包涵体形式的的蛋白沉淀，洗涤 后溶于尿素溶液后复性。变性蛋白需要经过结构复性与纯化才能获得天然蛋白的免疫反应 原性和达到呼吸道合胞病毒抗体检测的应用标准。
[0022]对于呼吸道合胞病毒重组蛋白Fl包涵体复性方法，可应用透析法、梯度稀释法、凝 胶层析法等，优选透析法和梯度稀释法相结合的方法，因为它们易于控制，蛋白复性率高。
[0023] 对于包涵体复性后呼吸道合胞病毒Fl蛋白的纯化方法，可应用凝胶层析、亲和层 析等，优选凝胶层析法，因为它最易于控制，收率高。
[0024] 通过基因重组获得的呼吸道合胞病毒Fl蛋白抗原具有较高的特异性和敏感性。
[0025] 对于快速测定抗体的方法，这里列举的是优选的方法，如应用各种标记抗体的免 疫层析测定，应用各种标记抗体的免疫渗滤法等。
[0026]下面详述免疫层析测定方法。
[0027] 抗呼吸道合胞病毒抗体免疫层析测定方法包括下述步骤:呼吸道合胞病毒Fl蛋白 抗原固定到固相载体1上，标记抗体(二抗）固定到固相2上，待测样品与标记抗体(二抗)接 触，若待测样品存在呼吸道合胞病毒抗体，则呼吸道合胞病毒抗体与二抗反应形成抗体-标 记二抗复合物，该"复合物"在固相1上水平移动，遇到固定到载体1上的呼吸道合胞病毒抗 原产生反应，带有标记的"复合物"就被特异地固定到抗原上，固相载体上固定抗原的位置 就会有显色反应;若待测样品不含呼吸道合胞病毒抗体，则"复合物"不能固定到抗原的位 置上，此处就没有显色反应，可依据固相载体上固定抗原位置是否有显色反应，来判断检测 结果，即待测样品中是否有呼吸道合胞病毒抗体。
[0028] 对于固相载体1，可应用例如硝酸纤维素膜(NC膜）、PVDF膜等。优选硝酸纤维素膜。
[0029] 对于固相载体2,可应用例如玻璃纤维素膜，无纺布等任何一种形式。优选无纺布 作结合物释放垫，因为它最易于控制。
[0030 ]对于标记的抗体，这里指的是用不同标记物标记的抗体，这里指的是抗人I gM抗体 或抗人IgG抗体，可依据被检测抗体的种类适当应用。
【附图说明】 [0031]
[0032]图1显示了发明试剂一检测板的外观结构示意图。
[0033]图2显示了发明试剂一检测条的外部结构示意图。
[0034] 图中各数字表示内容如下：1-检测板;2-加样孔;3-检视窗;4-加样端吸水纸层;5-金标抗体层;6-控制线;7-检测线;8-检测层;9-吸水端吸水层;10-衬板。
【具体实施方式】
[0035] 1)重组呼吸道合胞病毒F蛋白抗原重组表达、结构复性与纯化:呼吸道合胞病F蛋 白基因参考GenBank序列U63644.1，选取部分基因进行合成(AA162-387aa)，合成时去除信 号肽序列并且进行大肠杆菌稀有密码子优化，表达载体pET30a，连接时酶切位点为BamH I/ Hind III，目的基因共681bp(226aa)，转化到BL2UDE3)，表达的重组蛋白共274aa，分子量 30.8 kDa，等电点7.66，重组蛋白以包涵体形式表达。
[0036]重组表达载体的构建与鉴定:分别用BamH I和Hind III对呼吸道合胞病毒目的基 因片段Fl及pET30a进行双酶切，酶切产物纯化回收后，16°C连接过夜，再转入E. coli DH5a 感受态细胞，挑取转化菌落提取质粒进行PCR、酶切及测序鉴定。经PCR及双酶切鉴定，均证 实有大小约700bp的基因片段插入载体，与预期结果一致。测序结果表明插入目的基因片段 为681bp，核酸序列与设计合成的呼吸道合胞病毒Fl蛋白基因序列完全相同，构建的表达载 体开放阅读框正确，可以表达重组蛋白。
[0037] 重组蛋白的诱导表达:取5〇uL pET30a-Fl/BL21(DE3)菌液加入到5mL含lOOyg/mL 卡那霉素的LB培养基中，37°C、200rpm培养过夜，次日按1:50增菌于含卡那霉素的LB培养基 中，培养至吸光值OD6qq为0.6左右时，加入Immo 1/L IPTG，进行诱导表达4小时，5000rpm离心 30分钟，收集菌体，用TE缓冲液悬浮，充分混匀，-80 °C反复冻融3次，超声破菌，4 °C、 12000rpm离心15min，收集上清，沉淀用2M尿素洗2次，4°C、12000rpm离心15min，沉淀用8M尿 素溶解，4 °C保存。SDS-PAGE分析蛋白表达情况。
[0038]重组蛋白的结构复性与纯化:室温条件下用lOmmol/L，pH7.2的I3BS缓冲液对呼吸 道合胞病毒Fl蛋白8M尿素的溶解液进行梯度透析稀释，按溶液中尿素浓度分别为6mo 1/L、 4mo I /L、3mo I /L控制稀释梯度，每个梯度稀释的时间分别为3-4h。将完成稀释复性的含 3mol/L尿素的复性液4°C放置24h。稀释复性的溶液10000rpm/min离心除去沉淀物质，上清 液通过以S-300为介质的凝胶层析分离法进行纯化，从而获得重组呼吸道合胞病毒Fl蛋白 抗原。所得重组呼吸道合胞病毒Fl蛋白抗原组分进行SDS-PAGE检测，确定蛋白质的分子量 及蛋白纯度。结果显示主蛋白条带出现在30.8 kDa处，蛋白纯度达95%以上。
[0039] 2)呼吸道合胞病毒抗体金标快速检测试剂的制备： 将上述所得呼吸道合胞病毒Fl蛋白作检测抗原包被检测线，参照图2,制备呼吸道合胞 病毒抗体金标快速检测试剂，其组成成分包括:在衬板（10)上设有加样端吸水层(4)、检测 层(8)和吸水层(9)，在检测层(8)和加样端吸水层(4)之间设有金标抗呼吸道合胞病毒抗体 层(5)，在检测层(8)上包被有检测线(7)和质控线(6)。其中加样端吸水层(4)和吸水端吸水 层(9)由多层滤纸制成;检测层(8)为硝酸纤维素膜;金标抗体层为玻璃纤维或无纺布浸取 胶体金标记抗体。
[0040] 检测试剂制备程序包括:制备金标抗体层(5)，检测层(8)的质控线(6)、检测线(7) 的包被，然后在衬板(10)上组合金标测试条和检测卡（1)。在塑料衬板(10)的两端分别粘贴 加样端吸水纸层(4)和吸水端吸水层(9);在其中段粘贴包被检测线和质控线的纤维素层 (8)，在加样端吸水纸层(4)与纤维素膜层(8)的交接部位，夹贴含金标抗体层(5)的玻璃纤 维，玻璃纤维的4/5部分在加样端吸水纸层(4)中间，1/5部分在纤维素膜层(8)上。然后按照 4毫米宽、8厘米长规格切条。参照图2,将检测条组装于塑料盒内形成检测卡（1)。盒盖上加 样孔(2)正对测试条的加样端吸水纸层(4)，观察孔(3)正对纤维素膜的检测层(8)。
[0041] 上述金标抗体层的制备包括下述步骤：i .胶体金的制备，取IOOmg氯金酸溶于 1000 mL三蒸水中，加入15mL浓度为1%的柠檬酸三钠溶液，煮沸15分钟，可得到直径为15-50 纳米的胶体金颗粒溶液；? .胶体金标记抗人IgG或IgM单克隆抗体，取IOOmL胶体金溶液， 用0.2M碳酸钾溶液调pH为8.4，加入Img抗人IgG/IgM单克隆抗体，搅拌20分钟，再加入240mg 牛血清白蛋白（BSA)，继续搅拌5分钟，4°C静置2-4小时；iii .将上述胶体金溶液2000转/分 钟离心10-15分钟，去沉淀，得到上清；iv .将上清液10000转/分钟离心60分钟得到沉淀； V.沉淀溶于4mL 0.02M pH7.4的Tris-Hcl缓冲液得到胶体金溶液，该溶液中含有0.25% BSA和0.02%叠氮钠 ；vi.将胶体金溶液浸入玻璃纤维或者无纺布至液体开始渗出为止，37 °C干燥2小时形成金标抗体层(5)。
[0042]所述的检测层(8)是在硝酸纤维素膜上设有重组呼吸道合胞病毒Fl蛋白抗原构成 的检测线(7)和由羊或兔抗鼠 IgM抗体或IgG抗体形成的质控线(6)。其制备方法是:取上述 1)所制备的重组呼吸道合胞病毒Fl蛋白抗原，调浓度为1.5mg/mL，加入2%的甲醇，用喷膜机 在纤维素膜中段喷检测线(7);再取羊或兔抗鼠 IgM/IgG抗体调浓度为1.5mg/mL，用喷膜机 在纤维素膜中段，距检测线〇.5cm处，喷涂质控线(6)，按2yl/cm设置喷膜量，喷膜后置于37 。(:干燥2小时，再用0.0IM pH7.0含10%小牛血清的PBS在37°C下封闭30分钟，0.0IM pH7.0的 PBS漂洗，45 °C干燥。
[0043] 3)呼吸道合胞病毒抗体的测定 取血清样品1〇此滴于检测板（1)的样品孔⑵内，再滴加 IOOyL样品稀释液于样品孔(2) 内，在观察窗（3)观察检测结果，观察结果20分钟内有效。若样品中含有抗呼吸道合胞病毒 抗体，则在观察窗内看到检测线和质控线出现两条红色线条，检测结果判为阳性;若血清中 不含有抗呼吸道合胞病毒抗体，则在观察窗质控线位置看到一条红色线，检测结果判定为 阴性;若观察窗内一条红色都看不到，则检测结果无效。
[0044] 4)全血样本的测定 本发明实现的呼吸道合胞病毒快速检测方法对抗凝全血样本可直接检测，无需血浆或 血清分离，其实现的原理在于，在样品垫增加一层滤血膜，滤血膜中固化有抗人血红细胞抗 体(单抗或多克隆抗体），检测时，当抗凝血全血进入滤血膜后血液中红细胞被抗体结合到 滤血膜上，血浆渗入样品垫，完成检测，结果判定同3)所述。
[0045] 5 )对临床样品的敏感性和特异性 用本发明的抗原及检测方法制备呼吸道合胞病毒抗体(IgM)金标检测试剂，检测50份 临床呼吸道合胞病毒I gM抗体阳性血清样品和90份临床呼吸道合胞病毒I gM抗体阴性血清 样品进行特异性和敏感性试验。同时，为了验证本发明的效果，对用本发明的呼吸道合胞病 毒抗原进行的金标检测试剂盒与欧蒙公司（EUR(HMMUn)产的ELISA试剂盒进行符合率对比 分析，结果见表1、表2。
[0046] 耒1，太发明抗庖的賠异忡75?咸忡給涮结里"
[0047]表1结果显示，本发明抗原的敏感性达到96.00%，特异性达到96.67%。本发明的抗 原可以用于进一步研发呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒。
[0048]表2:本发明的检测试剂与欧蒙公司试剂的符合率分析。
[0049] 表2结果显示，本发明检测方法与欧蒙公司ELISA试剂的阳性符合率为94.00%，阴 性符合率为97.78%，总符合率为96.43%，说明本发明试剂盒的检测结果与欧蒙公司ELISA检 测试剂盒具有较好的符合率。因此，本发明具有较好的临床应用价值。
[0050] 需要指出的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不限制本发明，凡在本 发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范 围内。
【主权项】
1. 一种呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，它是呼吸道合胞病毒F蛋白的F1段序列进行序列优 化后采用基因工程技术表达，利用透析法、梯度稀释法和凝胶层析法复性得到的大小为 30.8 kDa的重组抗原，具有表达稳定，表达量高，免疫原性高等优点。2. -种呼吸道合胞病毒抗体快速检测方法，包括应用权利要求1中的呼吸道合胞病毒 抗原固定到硝酸纤维素膜，胶体金颗粒或彩色胶乳颗粒标记抗体(二抗），所用检测抗体为 血清或者全血的IgM或IgG;若待测样品中存在呼吸道合胞病毒抗体，则呼吸道合胞病毒抗 体与标记二抗反应形成抗体-标记二抗复合物，"复合物"在硝酸纤维素膜水平移动，遇到固 定在硝酸纤维素膜上的呼吸道合胞病毒抗原产生反应，带有标记的"复合物"就被特异地固 定到抗原上，固定抗原的位置就会有显色反应，若待测样品中不含呼吸道合胞病毒抗体，则 "复合物"不能固定到抗原的位置上，此处就没有显色反应，可依据硝酸纤维素膜上固定抗 原位置是否有显色反应，来判断样品中是否有呼吸道合胞病毒抗体。3. -种呼吸道合胞病毒抗体快速检测试剂盒，它所用抗原为权利要求1所述的F1蛋白， 所用方法为权利要求2所述方法。4. 一种呼吸道合胞病毒抗体快速检测试剂盒，其样品垫由玻璃纤维或无纺布和滤血样 品垫组合构成，所述滤血样品垫由经抗人血红细胞单克隆抗体或多抗抗体固化处理的玻璃 纤维或无纺布构成。
【文档编号】C07K14/135GK105859843SQ201610284711
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】李克生, 杜惠芬
【申请人】兰州雅华生物技术有限公司