用于检测rsv的免疫层析装置的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及特异性识别呼吸道合胞体病毒巧SV)的F蛋白的抗体和特异性识别N 蛋白的抗体被固定化的免疫层析装置、W及含有该装置从而形成的RSV的检测用试剂盒。
【背景技术】
[0002] RSV是呼吸道感染症的致病病毒，并且在W下方面具有特征：被病毒感染的细胞 形成多核巨细胞（合胞体）。RSV与年龄无关，是在一生中都会引起感染的病毒，但特别是 在婴幼儿时期，是成为引起非常严重的症状的原因的病原体。出生后1年W内50~70%W 上的婴儿感染该病毒，到3岁为止，几乎全部的幼儿获得了抗体，而出生后数周至数月的期 间内的感染最会引起严重的症状。对出生体重低的婴儿或免疫不健全、有屯、肺类基础疾病 的幼儿而言，病情严重化的风险进一步提高。据报道由RSV感染引起的致死率为1~3%， 但根据不同情况有相当的差异，并且据1980年代报道，在对屯、脏有基础疾病的幼儿的住院 例的研究中，致死率达37 %。
[0003] RSV感染症在世界各地均有报道，并且未见地理的、气候的差异。特征在于，在任意 区域中，幼弱的婴幼儿均会重症化，并且尤其是在都市中每年均会反复流行。
[0004] 据报道，RSV感染症约占婴幼儿肺炎诱因的50%，占毛细支气管炎诱因的50~ 90%。由肺炎、毛细支气管炎等下呼吸道疾病而导致的幼儿的住院数与其说是与流感，不如 说是与RSV感染症的流行高峰相一致。据观察流行期内年长儿童和成人中RSV的再次感染 是普遍的，但与婴幼儿中的重症化相比，年长儿童和成人中多数情况较轻，仅呈现轻度的感 冒样症状。
[0005] 已知RSV在环境下较不稳定，而在家庭中会高效地感染传播。将病毒带入家庭内 的多数是表现出轻度症状的学龄儿童，有报道说有学龄儿童和婴幼儿的家庭中，在流行期， 44%的家庭内经历了RSV的感染传播。作为感染的途径，主要是大的呼吸道飞沫、W及通过 被来自呼吸道的分泌物污染的手指或物品的接触，尤其经由密切接触而发生。因此，为了预 防婴幼儿的感染，极为重要的是，其家庭正确把握有无RSV感染（无论症状的程度），并在确 认感染的情况下，避免与婴幼儿接触，并防止分泌物污染。
[0006] 从RSV感染、特别是对婴幼儿感染的预防和治疗的观点来看，人们期望简便且灵 敏度更高的迅速诊断试剂盒。对于感染了RSV的婴幼儿，希望尽可能在早期开始适当的治 疗，因此需要一方面在短时间内能得到检查结果、另一方面即使在感染初期病毒量很少的 时期也不会成为假阴性的高灵敏度的检测试剂盒。另外，在婴幼儿的家人表现出感冒症状、 疑似RSV感染的情况下，需要检查有无RSV感染且对身体和经济负担小的简易检查方法。
[0007] 作为满足运样要求的简便且高灵敏度的迅速诊断试剂盒，开发了利用免疫层析法 的RSV检测试剂盒。目前，已知多种可用于检测病毒抗原并辅助诊断RSV感染症的利用免 疫层析法的检测试剂盒，但那些试剂盒均使用针对RSV的F蛋白的抗体（专利文献1~3)。
[0008] RSV的F蛋白是存在于RSV表面的2种主要的糖蛋白中的一种。病毒表面除F蛋 白W外还存在G蛋白，G蛋白在RSV亚型A和B之间的同源性只有53%左右，与此相对，F 蛋白良好地保持在亚型之间和亚型内。Beeler和Coelin曲（1989)的研究表明针对RSV的F蛋白的抗体能与1956~1985年间在美国或澳大利亚的各地分离的全部14种临床分离株 结合，并证实了F蛋白非常高度地保存在病毒株之间（专利文献4、非专利文献1)。
[0009] 通过高度地保存抗原决定基应该能够无遗漏地检测全部临床分离株，为此，在用 于检测RSV的试剂盒中使用了针对F蛋白的抗体。然而，在使用通常的RSV检测试剂盒进行 RSV检测的情况下，存在用其他的检查方法为阳性的样本的30~40%被判定为阴性的大问 题。作为利用免疫层析法的检测试剂盒判定假阴性的较多的原因，据认为可能是试剂盒所 使用的针对F蛋白的抗体的结合亲和性不足，结果样本中所含病毒量较少时得不到明确的 阳性信号而判定为假阴性。因此，为了开发即使病毒量小也能检测到明确信号的高灵敏度 检测试剂盒，尝试制作了对RSV的F蛋白具有高亲和性的单克隆抗体（专利文献5)。然而， 仅通过提高针对F蛋白的抗体的亲和性，开发能够无遗漏地检测临床分离株运样的表现出 足W实用的阳性检测率的RSV检测试剂盒是非常困难的。
[0010] 现有技术文献
[0011] 专利文献
[0012] 专利文献1 :日本专利特开2008-14751号公报
[0013] 专利文献2 :日本专利特开2008-122372号公报
[0014] 专利文献3 :日本专利特开2008-164403号公报
[0015] 专利文献4 :日本专利特表2004-534513号公报
[0016] 专利文献5 :日本专利特开2010-25745号公报
[0017] 非专利文献 阳0化]非专利文献 1JournalOfVirology,化Iy1989,Vol. 63,No. 7,P.2941-2950
【发明内容】
[0019] 发明要解决的问题
[0020]本发明提供一种使用了在层析介质的判定部位上与RSV的F蛋白特异性结合的抗 体、RSV的简便且灵敏度更高的免疫层析装置和利用免疫层析法的检测用试剂盒，W及使用 了它们的RSV的检测方法和判定或诊断RSV感染症的方法。
[0021] 另外，本发明提供即使在样本中所含病毒量很少的情况下也能高效检测RSV的免 疫层析装置和利用免疫层析法的检测用试剂盒，W及使用了它们的RSV的检测方法和判定 或诊断RSV感染症的方法。 阳02引解决问题的方案
[0023] 本发明的发明人为了在判定部位上高效捕获样本中所含的RSV从而提高免疫层 析装置的灵敏度，除了使更高亲和性的针对F蛋白的抗体在判定部位上固定化W外，还研 究了将针对F蛋白的抗体与针对RSV的其他蛋白的抗体组合固定化。而且，本发明的发明 人发现，令人惊讶的是，与使针对F蛋白的抗体单独固定化的检测试剂盒相比，通过不仅使 针对F蛋白的抗体固定化、而且使其与针对RSV的N蛋白（核蛋白）的抗体组合固定化，可 W增强阳性样本测定时的信号。本发明的发明人还发现，通过使与F蛋白结合的抗体和与N 蛋白结合的抗体组合固定化在判定部位上，即使是虽然通过PCR法等确认到充分的病毒量 存在，但在通常的免疫层析法中判定为阴性的样本，也能正确地判定为阳性，并且能够显著 改善与其他检查方法的阳性一致率。
[0024]目P，本发明设及一种免疫层析装置，其特征在于，该免疫层析装置包括运样的层析 介质作为构成要素而构成，其中在该层析介质中，与F蛋白特异性结合的抗体和与N蛋白特 异性结合的抗体固定化于判定部位。
[00巧]另外，本发明设及含有上述免疫层析装置而形成的RSV的检测用试剂盒。
[00%] 本发明还设及RSV检测方法，其使用在判定部位上固定化有与F蛋白特异性结合 的抗体和与N蛋白特异性结合的抗体的免疫层析装置。另外，本发明设及利用免疫层析法 的RSV检测率的改善方法，该方法包括使在判定部位固定化的针对F蛋白的抗体和针对N 蛋白的抗体与样本液接触的步骤。
[0027] 进一步如W下（1)~（12)来详细说明本发明的实施方案。
[0028] (1) 一种免疫层析装置，其含有运样的层析介质而构成，该层析介质具有固定化有 与RSV的F蛋白特异性结合的抗体和与RSV的N蛋白特异性结合的抗体的判定部位。
[0029] 似根据上述（1)所述的免疫层析装置，其实质上由试样添加部、层析介质和吸收 部构成。
[0030] (3)根据上述（2)所述的免疫层析装置，其还含有标记试剂保持部。
[003U (4)根据上述（1)~（3)中所述的免疫层析装置，其中与F蛋白特异性结合的抗体 是与亚群A和亚群B各自的RSV株的F蛋白中的任一者或者运二者特异性结合的抗体。
[0032] (5) -种利用免疫层析法的RSV检测用试剂盒，其含有免疫层析装置和样本稀释 液，该免疫层析装置含有运样的层析介质而构成，该层析介质具有固定化有与RSV的F蛋白 特异性结合的抗体和与RSV的N蛋白特异性结合的抗体的判定部位。
[0033] (6)根据上述（5)所述的检测用试剂盒，其中免疫层析装置实质上由试样添加部、 层析介质和吸收部构成。
[0034] (7)根据上述（6)所述的检测用试剂盒，其中免疫层析装置还含有标记试剂保持 部。
[0035] (8)根据上述（6)所述的检测用试剂盒，其中检测用试剂盒还含有标记试剂溶液。
[0036] (9) 一种RSV的检测方法，其使用免疫层析装置，该免疫层析装置具有固定化有与 RSV的F蛋白特异性结