一种河豚毒素免疫层析检测卡及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种河豚毒素免疫层析检测卡及其应用，制备所述河豚毒素免疫层析检测卡所用的抗原包括河豚毒素免疫抗原和河豚毒素包被抗原，所述河豚毒素免疫抗原为河豚毒素和KLH蛋白采用对苯二醛交联剂进行交联反应得到；所述河豚毒素包被抗原为河豚毒素和BSA蛋白采用己二醛交联剂进行交联反应得到。采用本发明的技术方案，检测河豚毒素特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好，检测结果准确，重复性好；样品的前处理简单，处理时间短，提高了河豚毒素免疫检测的灵敏度，减少了河豚毒素检测时间。同时该检测卡小巧，易于携带，可现场快速检测河豚毒素。
【专利说明】
一种河豚毒素免疫层析检测卡及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及河豚毒素检测技术领域，尤其涉及一种河豚毒素免疫层析检测卡及其 应用。
【背景技术】
[0002] 河豚毒素是(Tetrodotoxin，TTX)是一种剧毒的天然非蛋白质类神经毒素，分布广 泛，不仅存在河豚鱼中，也存在于其他海洋动物体内，如织纹螺、虾虎鱼等，是已知毒性最强 的海洋生物毒素之一。它通过对钠离子通道的阻断作用而抑制神经冲动的传导，使感觉神 经麻痹，四肢瘫痪，呼吸困难，最后因呼吸抑制而死亡。其毒力比氰化钠大1000倍。人畜误食 后均可能致死。
[0003] 由于河豚肉味鲜美，营养丰富，因此被人们视为美味，尤其在亚洲国家，人们自古 就有嗜吃河豚的习惯。近年来主要东方豚品种（如暗纹东方豚、红鳍东方豚等）的人工繁殖 和苗种培育的成功，加速推进了我国河豚人工养殖的发展，产量和外销量不断增加。目前我 国养殖的河豚已占世界河豚产量的70%，每年大量外销日本、韩国等国，河豚已成为我国一 种具有较高经济价值和发展潜力的特色水产品。由于河豚体内含有的河豚毒素的化学性质 稳定，一般烹调手段难以破坏，中毒后也缺乏有效的解救措施，严重威胁到消费者的食用安 全，因此河豚加工时必须完全去除内脏、眼球、表皮等毒性富集部位。尽管加工河豚有着严 格的规定，河豚毒素中毒的案例仍然时有发生，仅近3年来在媒体报道的河豚毒素中毒案列 已超过50起。解决这一问题的方法就是建立河豚毒素的前端预警体系，在消费者食用前对 所加工的河豚进行毒性速测。然而目前国内外均无河豚毒素的现场速测产品，也未见河豚 毒素现场速测方法报道。究其原因在于河豚毒素分子不易产生高灵敏度识别的抗体，商品 化的河豚毒素ELISA试剂盒的检测限也只能达到100ng/g的水平，因此采用传统的河豚毒素 抗体制备方法，无法满足风险控制的需要。
【发明内容】
[0004] 针对以上技术问题，本发明公开了一种河豚毒素免疫层析检测卡及其应用，检测 特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好，检测结果准确，重复性好，可现场快速检测河豚毒 素。
[0005] 对此，本发明采用的技术方案为：
[0006] -种河豚毒素免疫层析检测卡，制备所述河豚毒素免疫层析检测卡所用的抗原包 括河豚毒素免疫抗原和河豚毒素包被抗原，所述河豚毒素免疫抗原为河豚毒素和KLH蛋白 采用对苯二醛交联剂进行交联反应得到;所述河豚毒素包被抗原为河豚毒素和BSA蛋白采 用己二醛交联剂进行交联反应得到。
[0007] 作为本发明的进一步改进，所述河豚毒素免疫抗原采用以下步骤制备得到：
[0008] 步骤S101:将对苯二醛溶解至甲醇中，得到对苯二醛的甲醇溶液；
[0009] 步骤S102:将河豚毒素与KLH蛋白溶解至蒸馏水中，往其中加入对苯二醛的甲醇溶 液，在20~28°C下反应24小时后，加入氰基硼氢化钠溶液;4°C下用生理盐水透析3天，得到 河豚毒素免疫抗原。
[0010]优选的，氰基硼氢化钠溶液的浓度为10mg/mL。
[0011]优选的，透析时，每天更换3次透析液，将得到的全抗原以lmg/mL的浓度分装于 0.5mL离心管中，冻存于-20 °C冰箱中。
[0012] 作为本发明的进一步改进，所述河豚毒素、KLH蛋白、对苯二醛的质量比为1: (5~ 15):(5~15)〇
[0013] 作为本发明的进一步改进，所述河豚毒素、KLH蛋白、对苯二醛的质量比为1:10: 10。
[0014] 作为本发明的进一步改进，所述河豚毒素包被抗原采用以下步骤制备得到：
[0015] 步骤S201:将己二醛溶解至甲醇中，得到己二醛的甲醇溶液；
[0016] 步骤S202:将河豚毒素与BSA蛋白溶解至蒸馏水中，往其中加入己二醛的甲醇溶 液，在20~28°C下反应24小时后，加入氰基硼氢化钠溶液;4°C下用生理盐水透析3天，得到 河豚毒素包被抗原。
[0017] 作为本发明的进一步改进，所述河豚毒素、BSA蛋白、己二醛的质量比为1: (5~ 15):(5~15)〇
[0018]作为本发明的进一步改进，所述河豚毒素、BSA蛋白、己二醛的质量比为1:10:10。
[0019] 作为本发明的进一步改进，所述河豚毒素免疫层析检测卡采用以下步骤制备得 到：
[0020] 步骤A:合成所述河豚毒素免疫抗原；
[0021 ]步骤B:合成所述河豚毒素包被抗原；
[0022]步骤C:采用所述河豚毒素免疫抗原与免疫Balb/c小鼠经细胞融合，筛选得到分泌 河豚毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞，用获得的细胞诱导小鼠产生腹水，纯化后获得河豚毒 素单克隆抗体；
[0023] 步骤D:用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金;将胶体金与所述河豚毒素单克隆 抗体混合形成金标抗体，离心复溶后得到胶体金标记的河豚毒素单克隆抗体复合物；
[0024] 步骤E:将所述胶体金标记的河豚毒素单克隆抗体复合物浸于玻璃纤维素膜上，得 到样品垫；
[0025] 步骤F:将所述河豚毒素包被抗原包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，将羊抗小 鼠IgG包被于所述硝酸纤维素膜上，得到质控线；
[0026] 优选的，取河豚毒素包被抗原2mg/ml用0.01mol/L、pH值为7.2的TO缓冲液以250y g/ml间隔，经BIO-DOT型XYZ3010点样仪dispenser线形包被于硝酸纤维素膜的观察结果的 测试反应区，得到检测线；
[0027] 优选的，距离检测带5mm远的质控先用dispenser线形包被浓度为2mg/ml的羊抗小 鼠IgG得到。
[0028]优选的，将得到包被完成的硝酸纤维素膜于37°C干燥2h，4°C密封保存。
[0029]步骤G:用PVB作为背衬，在PVC衬板的中部叠置硝酸纤维素膜，两端分别叠置吸水 垫和样品垫，组装得到所述河豚毒素免疫层析检测卡，其中硝酸纤维素膜分别与吸水垫、样 品垫相搭连。
[0030]优选的，步骤C中，所述河豚毒素单克隆抗体的制备包括以下步骤:取腹水约3mL， 加入2倍体积的0.06mol/L、pH 4.5醋酸钠缓冲液。将正辛酸(33yg/mL腹水)逐滴慢慢加入样 品中，边加边搅拌，加完后继续搅拌30min，4°C下10000r/min离心30min，去沉淀（白蛋白和 其它非IgG蛋白）。取上清经0.45mi微孔膜过滤，与1/10体积10 X PBS混合（10 X PBS : 80gNaCl、2g KCl、11.5g Na2HP04、2g KH2P04、0.5845g EDTA、1000mL蒸馏水，pH 7.4)，用 lmol/L NaOH溶液调pH值到7.4。上清冷却到4°(：，加硫酸铵（0.2778/11^，使最终饱和度为 45%)。搅拌301^11，4°(：下1000(^/111111离心30111111，弃上清。用少量?83溶液溶解沉淀，用50~ 100倍体积的PBS透析过夜，换液3次。透析后的溶液用PEG-6000适当浓缩，4 °C下贮藏备用。 [0031]优选的，所述胶体金制备包括以下步骤:取1 %氯金酸溶液lml，加99ml超纯水成终 浓度0.01 %的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1 %柠檬酸三钠1.6ml-次性迅速加入煮沸的氯 金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热 5min，室温冷却，补充失水至原体积。
[0032]优选的，所述胶体金标记河豚毒素单克隆抗体复合物的制备包括以下步骤：
[0033]按最低稳定量的120%计算出所需待标记蛋白质的总量。在磁力搅拌下，将蛋白质 溶液加入胶体金溶液中（pH已调至5.9~6.2)，加入蛋白质时应逐滴加入，lmg的蛋白质大约 5min加完。分别取lml胶体金-葡萄球菌A蛋白结合物液(实验组)和lml胶体金原液(对照组） 于试管中加10%氯化钠溶液0.1ml，室温静置lh，观察结果:如果对照组试管溶液由红色转 为蓝色，甚至可以看到聚合物沉淀，而实验组溶液仍保持红色，无沉淀，方可继续下一步实 验，否则需补加标记用蛋白葡萄球菌A蛋白。最后加入终浓度为0.2%的聚乙二醇（PEG MW20000)，继续搅拌30min。
[0034] -种如上任意一项所述的河豚毒素免疫层析检测卡的应用，用于河豚汤或河豚组 织的河豚毒素检测中。
[0035] 作为本发明的进一步改进，在进行河豚汤的河豚毒素检测时，取河豚汤下层液体 作为样品液;或者在进行河豚组织的河豚毒素检测时，将每克均质河豚肉加入lmL甲醇抽 提，过滤，将滤液稀释5倍得到样品液；
[0036]使用lmL巴氏吸管滴加3滴样品液至所述河豚毒素免疫层析检测卡上与样品垫对 应的样品孔处，放置5-10分钟内观察结果，如质控线处出现红色条带，检测线处不显色或显 色比质控线浅则样品为阳性;如检测线比质控线红色条带深，则样品为阴性;如质控线不显 色则检测结果无效。
[0037] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0038] 采用本发明的技术方案，检测河豚毒素特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好， 检测结果准确，重复性好;样品的前处理简单，检测操作简单，不需要使用分析仪器。提高了 河豚毒素免疫检测的灵敏度，减少了河豚毒素检测时间。而且该卡片小巧，易于携带，可现 场快速检测河豚毒素。
【附图说明】
[0039] 图1是本发明一种河豚毒素免疫层析检测卡的组装结构示意图。
[0040] 图2是本发明一种河豚毒素免疫层析检测卡组装后的结构示意图。
[0041] 图3是本发明一种河豚毒素免疫层析检测卡检测阳性的示意图。
[0042] 图4是本发明一种河豚毒素免疫层析检测卡检测阴性的示意图。
[0043] 图5是本发明一种河豚毒素免疫层析检测卡检测无效的示意图。
【具体实施方式】
[0044]下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
[0045] 实施例1
[0046] 制备河豚毒素免疫层析检测卡包括以下步骤：
[0047] 步骤A:河豚毒素免疫抗原的合成包括以下步骤：
[0048] 步骤S101:称取对苯二醛10mg，溶解至lmL甲醇中，得到对苯二醛的甲醇溶液。
[0049] 步骤S102:称取河豚毒素lmg，KLH 10mg，溶解至5mL蒸馏水中。缓慢滴加上述对苯 二醛的甲醇溶液。室温反应24小时后，加入lmL，10mg/mL的氰基硼氢化钠溶液。4°C下用生理 盐水透析3d，每天更换3次透析液。得到的全抗原以lmg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中，冻 存于-20°C冰箱中。
[0050]步骤B:河豚毒素包被抗原的合成包括以下步骤：
[0051 ] 步骤S201:称取己二醛10mg，溶解至lmL甲醇中，得到己二醛的甲醇溶液。
[0052] 步骤S202:称取河豚毒素lmg，BSA 10mg，溶解至5mL蒸馏水中。缓慢滴加上述己二 醛的甲醇溶液。室温反应24小时后，加入lmL，10mg/mL的氰基硼氢化钠溶液。4°C下用生理盐 水透析3d，每天更换3次透析液。得到的全抗原以lmg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中，冻存 于-20 °C冰箱中。
[0053]步骤C:河豚毒素单克隆抗体的制备包括以下步骤：
[0054] (1)实验动物免疫
[0055] 采用半抗原河豚毒素免疫抗原与免疫Balb/c小鼠经细胞融合，分别免疫6周雌性 balb/c鼠，每组3只。首次免疫注射时，分别100yg/mL的免疫抗原100此，与等量弗氏完全佐 剂充分乳化，腹腔直接注射。间隔两周后，取用样的抗原，与1〇〇此不完全佐剂乳化，同样方 法注射。
[0056] (2)细胞融合：
[0057] 在细胞融合前Id或当天拉颈处死小鼠，浸泡在70%酒精中，体表消毒。用大头针固 定小鼠在蜡板上，超净工作台上剪开腹部，用小镊子挑起腹膜，注入5mL RPMI-1640完全培 养液，用手轻轻揉动腹腔，将其体内液体用无菌吸管移入75mL HAT完全培养液中，所述75mL HAT完全培养液为75mL RPMI-1640完全培养液中加入0.75mL100 X HAT液，反复2~3次；用吸 管混匀，铺24孔板，每孔加0.5mL，置于37 °C的5 % C02培养箱中。
[0058] 小鼠眼眶放血，收集血清，拉颈处死，70%酒精浸泡消毒体表，无菌取出脾脏，放入 RPMI-1640基础培养液中，并小心剔除筋膜及脂肪，剪碎，置于100目的不锈钢筛内，无菌研 磨，释放出单个脾细胞，吸取含有脾细胞的液体置于50mL无菌离心管中，离心。
[0059]将骨髓瘤细胞和上述制备好的脾细胞以个数5:1的比例加入同一 50mL的离心管 中，加入37°C温浴的RPMI-1640不完全培养液20mL，混合均匀，1500r/min离心6min。除上清， 用手指轻击离心管底部，使沉淀混匀如糊状。用移液管取37°C预热的PEG lmL，滴入离心管， 静置lmin后，于37°C水浴中在2min内滴加RPMI-1640完全培养液lOmLdOOOr/min离心6min， 弃去上清，加75mL HAT培养液，轻轻混匀，将混匀悬液分装于有饲养细胞的24孔板中，每孔 0.5mL，于37°C、5 % C〇2饱和湿度的培养箱中孵育。
[0060] (3)杂交瘤细胞的培养和筛选
[00611融合后6~9d，用HT培养液半量换液1次，在12~14d后根据增殖情况改用完全培养 液。待细胞贴壁至占板孔1/3时，计杂交瘤细胞生长的孔数及细胞总数。取上清液，间接 ELISA选择效价高和间接竞争ELISA选择药物抑制强的阳性杂交瘤细胞。
[0062] 采用间接ELI SA和间接竞争ELI SA法进行阳性杂交瘤细胞筛选，显示阳性并出现竞 争抑制反应的孔为产河豚毒素抗体的孔，并可用于进一步的亚克隆。
[0063]无菌条件下，洗脱阳性孔内的细胞，用弯头吸管将细胞转移至预先以饲养细胞铺 板的96孔培养板中，每个原始孔克隆成8孔，待细胞贴壁长满1/2~1/3孔底后，取上清液，间 接ELISA检测。取呈阳性强的亚克隆，如此反复2~5次，待所克隆的8个孔上清液中抗体阳性 率为100%时，挑取单细胞克隆，检测为全阳性者转移至24孔细胞培养板或25mL细胞培养瓶 扩大培养，建株并以分装、冻存。提前一周注射〇. 5mL降植烷至Balb/c小鼠腹腔。取冻存细胞 株，复苏后，经大量培养繁殖，收集细胞，用不完全培养基洗涤二次后，再用10mL不完全培养 基悬浮，计数。将细胞(每只小鼠lmL，含3.1 X 107个细胞)腹腔注射小鼠腹部，10~15d后，待 小鼠腹部明显膨大时用16号注射器无菌采集腹水。2000r/min离心10min，去除上层脂肪和 下层纤维蛋白及细胞，收集中层，取部分ELISA法测定其效价，其余分装-70°C冻存备用。 [0064] (4)河豚毒素单克隆抗体的制备和纯化
[0065] 取腹水约3mL，加入2倍体积的0.06mol/L、pH 4.5醋酸钠缓冲液。将正辛酸(33邱/ mL腹水)逐滴慢慢加入样品中，边加边搅拌，加完后继续搅拌30min，4°C下10000r/min离心 30min，去沉淀（白蛋白和其它非IgG蛋白）。取上清经0.45wii微孔膜过滤，与1/10体积10 X PBS混合，所述 10XPBS为80gNaCl、2g KCl、11.5g Na2HP04、2g KH2P04、0.5845g EDTA、 lOOOmL蒸馏水，pH 7.4;然后用lmol/L NaOH溶液调pH值到7.4。上清冷却到4°C，加浓度为 0.277g/mL、最终饱和度为45 %的硫酸铵。搅拌30min，4°C下10000r/min离心30min，弃上清。 用少量PBS溶液溶解沉淀，用50~100倍体积的roS透析过夜，换液3次。透析后的溶液用PEG-6000 适当浓缩， 4°C 下贮藏备用，得到河豚毒素单克隆抗体。
[0066]步骤D:胶体金的制备包括以下步骤：
[0067]取1 %氯金酸溶液lml，加99ml超纯水成终浓度0.01 %的氯金酸溶液，加热沸腾后， 取1%柠檬酸三钠1.6ml-次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转 为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积。
[0068]步骤E:胶体金标记河豚毒素单克隆抗体复合物的制备包括以下步骤：
[0069]按最低稳定量的120%计算出所需待标记蛋白质的总量。在磁力搅拌下，将蛋白质 溶液加入胶体金溶液中（pH已调至5.9~6.2)，加入蛋白质时应逐滴加入，lmg的蛋白质大约 5min加完。分别取lml胶体金-葡萄球菌A蛋白结合物液(实验组)和lml胶体金原液(对照组） 于试管中加10%氯化钠溶液0.1ml，室温静置lh，观察结果:如果对照组试管溶液由红色转 为蓝色，甚至可以看到聚合物沉淀，而实验组溶液仍保持红色，无沉淀，方可继续下一步实 验，否则需补加标记用蛋白葡萄球菌A蛋白。最后加入终浓度为0.2%的聚乙二醇（PEG MW20000)，继续搅拌30min，得到胶体金标记河豚毒素单克隆抗体复合物。
[0070] 步骤F:金标垫和样品垫的制备包括以下步骤：
[0071] 保存液稀释实施例5得到的胶体金标记河豚毒素单克隆抗体复合物原液至工作浓 度，按比例均匀浸于玻璃纤维素膜，得到金标垫，用lmg/mL BSA封闭处理的玻璃纤维素膜作 为样品垫，将所述金标垫和样品垫于_20°C冻存，冷冻真空干燥后，密封保存。
[0072]步骤G:河豚毒素包被抗原固相硝酸纤维素膜的制备包括以下步骤：
[0073] 取河豚毒素包被抗原2mg/ml用0.01mol/L的TO缓冲液(pH 7.2)以250μg/ml间隔， 经BI0-D0T型XYZ3010点样仪dispenser线形包被于硝酸纤维素膜的观察结果的测试反应 区，定义为检测线，距离检测线5mm远用dispenser线形包被羊抗小鼠IgG(2mg/ml)，作为质 控线。37 °C干燥2h，4 °C密封保存。
[0074]步骤H:试纸条组装包括以下步骤：
[0075] 如图1和图2所示，用PVC板1为背衬，在PVC板1的中部叠置硝酸纤维素膜8,硝酸纤 维素膜8上按照步骤G包被有检测线4和质控线3,硝酸纤维素膜8的两端分别叠置吸水垫7和 样品垫5,硝酸纤维素膜8和吸水垫7、样品垫5相搭连，然后进行组装，样品垫5上设有加样孔 2和金标垫6,完成后的河豚毒素免疫层析检测卡如图2所示。
[0076] 实施例2 [0077]检测卡的应用。
[0078] (1)当需要对河豚汤进行检测时，取河豚汤，取下层油脂含量较少的液体作为样品 液，使用lmL巴氏吸管滴加3滴至样品孔。
[0079] 当需要对河豚组织进行检测时，取lg均质河豚肉加入lmL甲醇抽提，过滤，将滤液 稀释5倍成为样品液，使用lmL巴氏吸管滴加3滴样品液至样品孔。
[0080] (2)结果判断
[0081] 滴加了样品的河豚毒素免疫层析检测卡放置5-10分钟内观察结果。
[0082] 如图3所示，如质控线C位置处出现红色条带，检测线T位置处不显色或显色比质控 线浅则样品为阳性；
[0083] 如图4所示，如果质控线C位置处、检测线T位置处显色，但是检测线比质控线红色 条带深，则样品为阴性；
[0084]如图5所示，如质控线C位置处不显色则检测结果无效。
[0085] 实施例3
[0086] 在实施例1的基础上，本例中，在制备河豚毒素免疫抗原时，对苯二醛的用量为 5mg，KLH的用量为15mg。在制备河豚毒素包被抗原时，己二醛的用量为15mg，BSA的用量为 5mg。其他同实施例1。
[0087] 实施例4
[0088] 在实施例1的基础上，本例中，在制备河豚毒素免疫抗原时，对苯二醛的用量为 15mg，KLH的用量为5mg。在制备河豚毒素包被抗原时，己二醛的用量为5mg，BSA的用量为 15mg。其他同实施例1。
[0089] 实施例5
[0090]采用本发明的河豚毒素免疫层析检测卡进行灵敏度、河豚汤中河豚毒素检出限、 河豚组织中河豚毒素检出限进行测试，并以免疫抗原、包被抗原均采用甲醛交联法的作为 对照样1，以免疫抗原、包被抗原均采用戊二醛交联法为对照样2,结果如表1所示。
[0091 ]表1实施例1、3和4和对照样1、对照样2的灵敏度检测结果表
[0093] 由表1可见，采用本发明的技术方案的实施例1、3和4,检测河豚毒素特异性好，灵 敏度高，远远高出对照样1和对照样2。
[0094] 同时将本发明的河豚毒素免疫层析检测卡与对照样1和对照样2对样品的前处理 时间进行了比较，结果如表2所示。其中，对照样1的样品前处理采用醋酸抽提的方法，对照 样2的样品前处理采用三氯乙酸抽提的方法。
[0095] 表2本发明和对照样1、对照样2的样品前处理时间对比表
[0097] 通过表2的对比可见，采用本发明技术方案的河豚毒素免疫层析检测卡进行河豚 毒素检测时，样品的前处理简单，处理时间短，减少了河豚毒素检测时间。
[0098] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
【主权项】
1. 一种河豚毒素免疫层析检测卡，其特征在于：制备所述河豚毒素免疫层析检测卡所 用的抗原包括河豚毒素免疫抗原和河豚毒素包被抗原，所述河豚毒素免疫抗原为河豚毒素 和KLH蛋白采用对苯二醛交联剂进行交联反应得到;所述河豚毒素包被抗原为河豚毒素和 BSA蛋白采用己二醛交联剂进行交联反应得到。2. 根据权利要求1所述的河豚毒素免疫层析检测卡，其特征在于:所述河豚毒素免疫抗 原采用以下步骤制备得到： 步骤S101:将对苯二醛溶解至甲醇中，得到对苯二醛的甲醇溶液； 步骤S102:将河豚毒素与KLH蛋白溶解至蒸馏水中，往其中加入对苯二醛的甲醇溶液， 在20~28°C下反应24小时后，加入氰基硼氢化钠溶液;4°C下用生理盐水透析3天，得到河豚 毒素免疫抗原。3. 根据权利要求2所述的河豚毒素免疫层析检测卡，其特征在于:所述河豚毒素、KLH蛋 白、对苯二醛的质量比为1: (5~15) : (5~15)。4. 根据权利要求3所述的河豚毒素免疫层析检测卡，其特征在于:所述河豚毒素、KLH蛋 白、对苯二醛的质量比为1:10:10。5. 根据权利要求1所述的河豚毒素免疫层析检测卡，其特征在于:所述河豚毒素包被抗 原采用以下步骤制备得到： 步骤S201:将己二醛溶解至甲醇中，得到己二醛的甲醇溶液； 步骤S202:将河豚毒素与BSA蛋白溶解至蒸馏水中，往其中加入己二醛的甲醇溶液，在 20~28 °C下反应24小时后，加入氰基硼氢化钠溶液;4 °C下用生理盐水透析3天，得到河豚毒 素包被抗原。6. 根据权利要求5所述的河豚毒素免疫层析检测卡，其特征在于:所述河豚毒素、BSA蛋 白、己二醛的质量比为1: (5~15): (5~15)。7. 根据权利要求6所述的河豚毒素免疫层析检测卡，其特征在于:所述河豚毒素、BSA蛋 白、己二醛的质量比为1:10:10。8. 根据权利要求1~7任意一项所述的河豚毒素免疫层析检测卡，其特征在于:所述河豚 毒素免疫层析检测卡采用以下步骤制备得到： 步骤A:合成所述河豚毒素免疫抗原； 步骤B:合成所述河豚毒素包被抗原； 步骤C:采用所述河豚毒素免疫抗原与免疫Balb/c小鼠经细胞融合，筛选得到分泌河豚 毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞，用获得的细胞诱导小鼠产生腹水，纯化后获得河豚毒素单 克隆抗体； 步骤D:用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金;将胶体金与所述河豚毒素单克隆抗体 混合形成金标抗体，离心复溶后得到胶体金标记的河豚毒素单克隆抗体复合物； 步骤E:将所述胶体金标记的河豚毒素单克隆抗体复合物浸于玻璃纤维素膜上，得到金 标垫，用lmg/mL BSA封闭处理的玻璃纤维素膜作为样品垫； 步骤F:将所述河豚毒素包被抗原包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，将羊抗小鼠 IgG 包被于所述硝酸纤维素膜上，得到质控线； 步骤G:用PVB作为背衬，在PVC衬板的中部叠置硝酸纤维素膜，两端分别叠置吸水垫和 样品垫，组装得到所述河豚毒素免疫层析检测卡，其中硝酸纤维素膜分别与吸水垫、样品垫 相搭连。9. 一种如权利要求1~8任意一项所述的河豚毒素免疫层析检测卡的应用，其特征在于： 用于河豚汤或河豚组织的河豚毒素检测中。10. 根据权利要求9所述的河豚毒素免疫层析检测卡的应用，其特征在于： 在进行河豚汤的河豚毒素检测时，取河豚汤下层液体作为样品液，或者在进行河豚组 织的河豚毒素检测时，将每克均质河豚肉加入lmL甲醇抽提，过滤，将滤液稀释5倍得到样品 液； 使用lmL巴氏吸管滴加3滴样品液至所述河豚毒素免疫层析检测卡上与样品垫对应的 样品孔处，放置5-10分钟内观察结果，如质控线处出现红色条带，检测线处不显色或显色比 质控线浅则样品为阳性;如检测线比质控线红色条带深，则样品为阴性;如质控线不显色则 检测结果无效。
【文档编号】G01N33/577GK106053819SQ201610420917
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】张世伟, 杨国武, 赖心田, 王士峰, 冯荣虎, 林霖, 谌章舟, 姚添琪, 唐栋, 洪晓明
【申请人】深圳市计量质量检测研究院