一种河豚毒素免疫亲和柱及其制备方法
【专利说明】
[0001]技术领域:
本发明涉及一种河豚毒素的免疫亲和柱及其制备方法，属于水产毒素检测领域。
[0002]【背景技术】:
河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是豚鱼类(俗称河豚鱼)、其它多种海洋生物以及蝾螈、火蜥蜴、青蛙、蟾蜍、扁形虫等动物体内含有的一种生物碱(氨基全氢喹唑啉型化合物)，是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一，其分子式为CnH170sN3，分子量为319，是小分子量、非蛋白质的神经性毒素，其毒性比剧毒的氰化钠还要高1250多倍，0.5mg即可致人于死命。河豚毒素对肠道有局部刺激作用，吸收后迅速作用于神经末梢和神经中枢，阻碍神经传导，从而引起神经麻痹而致死亡。其具体作用机制是通过与钠离子通道受体结合，阻断电压依赖性钠通道，从而阻滞动作电位，导致与之相关的生理活动的阻碍，主要是神经肌肉的麻痹，河豚毒素对呼吸和心血管的抑制是对中枢和外周神经共同作用的结果。河豚毒素的化学性质稳定，一般烹调手段难以破坏，中毒后也缺乏有效的解救措施。因此TTX的检测具有非常重要的现实意义。
[0003]TTX检测技术主要包括以小鼠检测法为代表的生物检测技术；以荧光分光光度法、液相色谱检测法为代表的仪器检测技术。小鼠检测法是利用河豚毒素的毒性特点进行的小鼠毒性检测的方法，方法简便，但定量不准确且重复性差、目标性差，已少用。荧光分光光度法是最早建立的测定TTX的仪器方法，操作简便，但灵敏度低、专一性差。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。是定量分析真菌毒素最常用的方法。
[0004]在使用高效液相色谱检测河豚毒素时，需要先将河豚毒素样品进行净化处理。目前常用的净化处理方法就是固相萃取法，也叫柱层析法。是目前真菌毒素净化使用最广泛的方法。其中，免疫亲和柱方法的分析速度快，灵敏度高，分离效率和回收率高，不需要剧毒的真菌毒素标准物来标定，安全可靠。因而成为最常用的方法。
[0005]用于目前制备免疫亲和纯化柱的方法大概有:溴化氰活化直接偶联法、环氧氯丙烷法、过碘酸钠法等。这些方法的基本原理都是将载体基质进行化学活化后，将抗体偶联到载体上。但是由于偶联是非特异性的，抗体的任何部位都有可能和载体偶联，方向性是不可控制的。势必影响亲和纯化柱纯化河豚毒素的效率。
[0006]
【发明内容】
:
本发明的目的在于提供一种河豚毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途。
[0007]为了达到上述目的，在本发明中，利用了蛋白G的功能，蛋白G是一种G型链球菌细胞壁上的蛋白，能特异性的与多种动物抗体的Fc部位相结合。并且具有很高的亲和力。我们克隆了蛋白G的基因序列，并且对其密码子进行了优化、重组后，在大肠杆菌中表达出了与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G。将基因重组的蛋白G偶联到载体上后，再将河豚毒素抗体偶联到蛋白G上，制备出了河豚毒素一蛋白G—载体，再用交联剂将载体进行交联。交联后的载体装柱后就形成了高亲和力的河豚毒素免疫亲和柱。该亲和柱操作简便，纯化河豚毒素效率高。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的河豚毒素。用于高效液相色谱检测。
[0008]具体操作如下:
本发明最大的优势就是利用了蛋白G与Ig抗体特异性结合的特点，IgG抗体由两条重链和两条轻链构成，抗体分为Fab区和Fc区，其中，Fab区是抗原结合的区域。
[0009]蛋白G是链球菌细胞壁上的一种特殊的蛋白，与抗体的Fc区域有特异性的结合能力。蛋白G与抗体结合后，抗体的Fab区域游离在外，不影响抗体的抗原结合能力。经过我们基因优化重组后的蛋白G，1个分子的蛋白G可以结合3个分子的IgG抗体，具有很高的抗体亲和力。并且只有抗体能与蛋白G结合，其余蛋白均不能与蛋白G结合，特异性很高。以此蛋白G为基础制备的免疫亲和柱具有特异性好，河豚毒素结合量大，纯化效率高的特点。
[0010]河豚毒素免疫亲和柱及其制备方法说明如下:
1.载体活化
选择琼脂糖载体，sepharose4B,以环氧氯丙烧活化法进行活化。
[0011 ] 取2%的预溶胀的琼脂糖凝胶sepharose4B,用20倍体积的蒸懼水充分冲洗,洗去残存的乙醇，用漏斗过滤掉水分。
[0012]称取滤去水份后的湿凝胶5克，加入7.5毫升0.8M的NaOH，30%的环氧氯丙烷2毫升，2mg/ml的硼氢化钠NaBH4，5毫升，在25°C下摇床反应8小时。
[0013]反应后，用大量的蒸馏水洗涤，去除凝胶中混杂的环氧氯丙烷。
[0014]2.将蛋白G与活化载体sepharose4B的偶联
将活化好的琼脂糖凝胶sepharose4B用偶联缓冲液(0.1M的NaHC03,0.8M NaCl，PH8.9)洗涤3次。加入2mg/ml的蛋白G，室温偶联4小时。
[0015]将偶联好的琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次。偶联有蛋白G的琼脂糖载体sepharose命名为蛋白G_sepharose。
[0016]3.抗河豚毒素抗体与蛋白G-sepharose载体上的蛋白G连接
蛋白G与抗体具有特异性的亲和力，在一定的反应条件下，将偶联有蛋白G的琼脂糖凝胶与抗体进行连接。将抗体连接于琼脂糖上。由于蛋白G与抗体的结合部位是抗体的Fc区域，抗体的抗原结合区不受影响，充分保证了抗体的抗原结合能力。
[0017]将抗河豚毒素抗体溶于20mM、PH7.4的PBS中，终浓度2mg/ml。将抗体加入用20Mm PH7.4的PBS缓冲液洗涤过的蛋白G_s印harose中。室温结合30分钟。
[0018]结合后的载体用PBS洗涤。连接有抗体的载体命名为抗体一蛋白G—sepharose ο
[0019]4.载体交联
将抗体一蛋白G— s印harose用0.1M PH9.0的硼酸缓冲液洗涤3次。然后加入0.1MPH9.0的硼酸缓冲液，在缓冲液中加入交联剂如庚二亚氨酸二甲酯(DMP)至终浓度20mM。室温交联1小时。
[0020]加入50mM，PH9.0的乙醇胺终止反应。并用50mM的乙醇胺封闭10分钟。
[0021]交联后的抗体一蛋白G—sepharose载体用20mM, PH7.4的PBS洗涤3次。
[0022]5.装柱
将交联后的抗体一琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的河豚毒素亲和纯化柱。