重组免疫毒素Gigantoxin-4-4D5 scFv及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术，特别涉及一种重组免疫毒素 Gigantoxin-4-4D5 scFv 及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤已成为威胁人类健康的最重要疾病之一，特别是在我国，肿瘤已经超过 心血管疾病成为造成最多死亡人数的头号杀手。
[0003] 目前治疗肿瘤的方法主要为化疗和放疗，但是常规放化疗基本不具备针对肿瘤的 特异性，放化疗在破坏癌细胞的同时对正常细胞也产生杀伤作用，从而对人体产生很大的 毒副作用，同时还会导致宿主免疫系统的破坏，放化疗后易引起多种并发症而且肿瘤易复 发，常规放化疗的特点造成肿瘤治疗的疗效和预后都不理想。肿瘤分子靶向治疗是根据肿 瘤上的分子靶点设计的药物来抑制肿瘤细胞生长、转移、清除肿瘤细胞的方法，与其它治疗 手段相比，肿瘤分子靶向治疗具有作用特异性高、范围广泛、毒副作用小等特点。
[0004] 人类表皮生长因子受体2 (HER-2)属于跨膜酪氨酸激酶受体家族的成员，HER-2蛋 白通常只在胎儿时期表达，成年以后只在极少数组织内低水平表达。然而HER-2却在多种 人类肿瘤中过度表达，如乳腺癌（25-30% )、转移性导管癌（60-70% )、膀胱癌（27-63% )、 胰腺癌（31-80% )、非小细胞肺癌（13-55% )、卵巢癌（18-43% )等。
[0005] 抗册1?2单链抗体（4058〇?￥)由重链可变区（￥!1)和轻链可变区（￥1^)2个抗原特 异性结合片段经过一个柔性铰链连接而成，具有较好的血清及热稳定性，并与有HER2较高 的选择性结合能力。
[0006] Gigantoxin-4是从海葵Stichodactyla gigantea提取的一种溶细胞素，能够通 过裂解细胞膜而发挥细胞毒作用。避免了其他一些毒素需通过细胞内化而带来的抗肿瘤效 率低及后续的耐药性。
[0007] 目前，还没有利用抗人表皮生长因子受体2单链抗体4D5 SCFv融合海葵溶细胞素 Gigantoxin-4治疗肿瘤的报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的，就是为了提供一种重组免疫毒素 Gigantoxin-4_4D5 scFv及其制 备方法和用途。
[0009] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种重组免疫毒素 Gigantoxin-4_4D5 scFv，由抗 HER-2 单链抗体 4D5 scFv 和海葵溶细胞素 Gigantoxin-4 融 合表达形成。
[0010] 上述的 Gigantoxin-4_4D5 scFv 运用（G4S) 3 柔性 linker 连接。
[0011] 编码重组免疫毒素 Gigantoxin-4-4D5 scFv的基因，采用PCR扩增方法得到改造 后的4D5 scFv及Gigantoxin-4基因，并采用融合PCR将（G4S) 3柔性linker连接两段基 因，最后得到完整的编码Gigantoxin-4-(G4S) 3-4D5 scFv基因。
[0012] 一种载体，含有Gigantoxin-4_(G4S) 3-4D5 scFv基因，该载体是在 Gigantoxin-4-(G4S)3-4D5 scFv基因前面加上了小分子泛素类修饰蛋白SUM0,促进蛋白的 可溶表达及正确折叠，并构建到含有T7启动子的PET28a(+)表达载体上。
[0013] 一种含有权利要求4所述载体的宿主细胞E. coli BL21 (DE3)pLysS。
[0014] 上述重组免疫毒素 Gigantoxin-4_4D5 scFv的制备方法，包括以下步骤：
[0015] (1)将含有SUM0-Gigantoxin-4-4D5 scFv基因的重组大肠杆菌在37°C培养，当 OD6。。达到0. 2-1. 5时，加入终浓度为0. 05-0. 4mM的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷， 16_37°C诱导 10_25h，异源表达 SUM〇-Gigantoxin-4_4D5 scFv，离心，破碎，取上清；
[0016] (2)将步骤（1)的上清利用His标签的亲和层析分离纯化SUM0-Gigantoxin-4-4D5 scFv ；
[0017] (3)将步骤（2)中的融合蛋白利用SUMO蛋白酶20-37°C酶切2-8h，再一次利用镍 柱分离纯化，收集穿出液；
[0018] (4)将步骤（3)中的穿出液利用20mM磷酸二氢钠缓冲液4°C透析3次，每次至少 4h，利用羧甲基琼脂糖凝胶柱层析，并用相同pH下含有10-30mM的磷酸二氢钠的梯度氯化 钠浓度缓冲液洗脱。
[0019] 重组免疫毒素 Gigantoxin-4-4D5 scFv在治疗卵巢癌SK-0V-3中的应用。
[0020] 本发明具有以下的优点和特点：
[0021] (1)传统毒素存在细胞内化问题导致抗肿瘤效率低，本发明所用毒素作用于细胞 膜，不存在内化问题，抗肿瘤效率高；
[0022] (2)本发明所采用的制备方法简单可行，生产成本低；
[0023] (3)本发明的免疫毒素主要是通过作用于细胞膜而发挥抗肿瘤作用，很难产生耐 药性。
[0024] (4)本发明将抗HER-2单链抗体4D5 scFv创造性地与海葵溶细胞素 Gigantoxin-4 融合，组成了一种新型的免疫毒素，能与肿瘤细胞表面的抗原结合并起到杀伤肿瘤的作用， 具有很强的特异性，毒副作用小，抗肿瘤效果明显，具有很好的应用前景。
【附图说明】：
[0025] 图1为重组免疫毒素的Gigantoxin-4_4D5 scFv质粒构建不意图；
[0026] 图 2 为 SDS-PAGE 验证 SUM0-Gigantoxin-4-4D5 scFv 表达情况；
[0027] 图 3 为 SUM〇-Gigantoxin-4_4D5 scFv 银柱纯化结果；
[0028] 图4为SUM〇-Gigantoxin-4_4D5 scFv酶切后银柱纯化结果；
[0029] 图5为Gigantoxin-4_4D5 scFv经离子交换层析纯化结果；
[0030] 图6为纯化的蛋白卵巢癌SK-0V-3细胞的增殖抑制作用，其中，图6A为 Gigantoxin-4,图 6B 为 Gigantoxin-4_4D5 scFv ；
[0031] 图7为纯化的蛋白对人胚肾293细胞（HEK-293)的增殖抑制作用，其中，图7A为 Gigantoxin-4,图 7B 为 Gigantoxin-4_4D5 scFv ；
[0032] 图8为纯化的蛋白对正常人的红细胞溶血作用；
[0033] 图9为检测Gigantoxin-4-4D5 scFv对HER-2表达阳性的肿瘤细胞SK-0V-3的 靶向性；其中，图9A为Gigantoxin-4作用于SK-0V-3细胞；图9B为Gigantoxin-4-4D5 scFv作用于SK-0V-3细胞；图9C为Gigantoxin-4作用于HEK-293细胞；图9D为 Gigantoxin-4_4D5 scFv 作用于 HEK-293 细胞。
【具体实施方式】
[0034] 图1为重组免疫毒素的Gigantoxin-4-4D5 scFv质粒构建示意图。
[0035] 实施例1重组免疫毒素 Gigantoxin-4_4D5scFv的制备
[0036] 本实施例1是在以下实施条件和技术要求条件下实施的：
[0037] (1)构建 pET28a (+)/SUM〇-Gigantoxin-4_4D5 scFv 重组质粒
[0038] A、SUM0-Gigantoxin-4-4D5 scFv基因片段的克隆。根据各片段模版及要加入的 linker(G4S)3所设计的引物如表1所示：
[0039] 表 1
[0041] 用 Cl 和 C2、C3 和 B2、B3 和 M 分别以 SUM0、Gigantoxin-4、4D5scFv 为模板 PCR 出 相应片段，linker(G4S)3的基因已设计到B2和B3引物中，PCR条件为：98°C预变性lmin， 98°C变性10s，58°C退火30s，72°C延伸30s，循环35次，最后72°C延伸7min。PCR产物经琼 脂糖凝胶鉴定，用胶回收试剂盒（Omega)回收各自目的片段。
[0042] 以回收的Gigantoxin-4、4D5scFv片段为模板，以C3和M为引物进行PCR，PCR条 件为：98°(：预变性11^11，98°(：变性1〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸458，循环35次，最后72 1€ 延伸7min。PCR产物经琼脂糖凝胶鉴定，用胶回收试剂盒回收目的片段。
[0043] 以第一次PCR得到的SUMO片段和第二次融合PCR得到的Gigantoxin-4-4D5scFv 片段为模版，以Cl和M为引物，PCR条件为：98°C预变性lmin，98°C变性10s，58°C退火30s， 72°C延伸lmin，循环35次，最后72°C延伸7min。PCR产物经琼脂糖凝胶鉴定，用胶回收试 剂盒回收目的片段，此片段即为SUM0-Gigantoxin-4-4D5 scFv。
[0044] B、利用限制性内切酶Nco I和Xho I对基因片段SUM〇-Gigantoxin-4_4d5 scFv 和质粒pET28a(+)进行双酶切，经琼脂糖凝胶鉴定及胶回收试剂盒回收后，再用DNA T4连 接酶在22°C下反应3h将基因片段及质粒连接。最后将连接产物转化进E. coli BL21(DE3) PLysS感受态细胞内。涂布含有卡那霉素的平板，16h长出单菌落，挑取阳性克隆，PCR验证 并送公司进行测序。
[0045] (2)重组免疫毒素的表达与纯化
[0046] A、重组免疫毒素的表达
[0047] 将重组菌在37°C培养，当OD6。。达到0. 6时，加入0.1 mM的IPTG进行诱导，18°C诱 导16h后离心收集菌体，超声破粹后，分别取上清及沉淀进行SDS-PAGE验证重组免疫毒素 表达形式。如图2所示，重组免疫毒素以可溶的形式表达。
[0048] B、重组免疫毒素的纯化
[0049] 用10倍柱体积含有20mM咪唑的PB平衡缓冲液（pH 7. 4)平衡HisTrap? HP亲 和柱，将破粹的上清液离心，用0. 22 μ m微孔滤膜过滤后，以流速为lmL/min进行上样，重组 免疫毒素因