专利名称：一种重组人DT388sBAFF免疫毒素及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组人DT388sBAFF免疫毒素及其编码基因与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
免疫毒素是具有导向能力的分子(载体)和具有细胞毒性的分子(毒素)偶联而成的具有特异性细胞杀伤能力的杂合分子，它通过载体的导向作用，使其所携带的毒素分子到达靶细胞，继而在胞内抑制蛋白质合成导致细胞死亡，达到特异性杀伤靶细胞的作用而不损伤正常组织。B 细胞活化因子(B cell activating factor，BAFF)属肿瘤坏死因子 CTumor Necrosis Factor, TNF)家族成员，BAFF主要表达在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和活化的T细胞表面。主要参与B细胞分化发育成熟的功能调节。BAFF又称为BLyS (B lymphocyte stimulator)、 TALL-1(TNF-and apoptosis ligand-felated leukocyte expressed ligand 1)> THANK(TNF homo logue that act ivates apoptosis, NF-KB and JNK)、zTN F4等，是B细胞存活与成熟和T细胞激活的必需因子。人BAFF基因定位于13号染色体长臂32_34区(13q32_q34)，长约Ikb。含857bp 的单一开放读码框，编码285个氨基酸，其中47 73氨基酸为跨膜区，74 285氨基酸为胞外区，133 285氨基酸为其发挥功能的主要区域。BAFF属II型跨膜蛋白，N端在胞内， 缺少信号肽序列，C端在胞外，其胞外段与TNF超家族成员IPRIL有高度同源性。具有TNF 家族特征性结构，富含β 2片层的同源三聚体，在三聚体的中央含2个镁离子，能够稳定蛋白功能。BlyS的生理学功能由三种细胞表面受体介导，分别是BCMA (B cell maturation antigen)>TACI(transmembrane activator and calcium modulator cyclophilin ligand intercator)和BAFF受体(BAFF rec印tor，BAFF_R)，三种受体主要表达在B细胞上，均属于 TNF受体家族成员，他们的表达受T、B细胞的控制。三者均通过一个小的结构域结合BAFF， BAFF与它的三种特异性细胞膜受体结合后，能促进B淋巴细胞增殖、分化发育、活化并分化为浆细胞，刺激免疫球蛋白产生，产生相应的生理和病理性免疫应答，参与机体正常免疫调节和免疫病理。白喉毒素(Diphtheriatoxin，DT)是白喉杆菌产生的细胞毒素，是目前最常用于构建重组免疫毒素的蛋白毒素。DT包含535个氨基酸残基，从N端到C端分成酶催化区(C 区)、跨膜区(T区)和受体结合区(R区)三个结构域。其立体结构为Y型，跨膜区在基底部，其两臂分别是酶活性区和受体结合区。N端前193个氨基酸对应DT的酶催化区，进入真核细胞后与延长因子-II结合，可催化细胞延伸因子EF2特有的白喉酰胺His699发生ADP2 核糖基化，从而阻止蛋白质合成并导致细胞死亡。跨膜区有176个氨基酸残基002-378)， 在酸性条件下能发生变构，插入细胞膜中，并使酶催化区越过细胞膜进入细胞内。受体结合区有149个氨基酸残基(386-535)，具有识别受体并结合受体的能力。其衍生DT388s是去除了 DT分子的受体结合区(389-53 而保留N端的1-388个氨基酸残基。该衍生物缺乏受体结合识别能力，保留了毒性基团，且抑制蛋白质合成毒性强于野生型DT。本发明通过重组DNA技术构建DT388s和突变BAFF的免疫毒素融合基因，DT388s 位于基因上游，突变BAFF位于下游，两者间通过柔性linker-G4S连接，并对基因的密码子进行优化，以适于其在大肠杆菌的高效稳定表达。该免疫毒素以人突变BAFF为导向分子， 以DT388S为毒性基团，具有特异性靶向并杀伤表面带有BAFF受体的B细胞的能力。可用于 B细胞恶性增殖性疾病和异常活化性疾病的靶向治疗。具有高效、低毒、高特异性等特点。本发明提供了一种高效表达重组人DT388sBAFF的方法，通过对人BAFF核苷酸序列进行人工突变，与DT经linker连接，采用大肠杆菌BL21 (DE3)表达体系融合表达人DT388sBAFF，优化表达载体/宿主菌组合，获得高表达、极具产业化价值的一种人 DT388sBAFF的表达方法。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种重组人DT388sBAFF免疫毒素及其编码基因与应用。一种重组人DT388SBAFF免疫毒素，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。编码上述重组人DT388sBAFF免疫毒素的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。一种含有SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的表达载体。含有上述SEQ ID No. 2所示核苷酸序列或上述表达载体的重组细胞。所述重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。一种高表达重组人DT388sBAFF免疫毒素的工程细胞的构建方法，通过将上述编码重组人DT388sBAFF免疫毒素的基因与表达载体pET41a连接后，转入大肠杆菌，筛选获得高表达重组人DT388sBAFF免疫毒素的工程细胞。上述重组人DT388sBAFF免疫毒素在制备以B细胞为靶细胞的靶向治疗药物方面的应用。本发明的优点在于1、本发明所述的编码重组人DT388sBAFF免疫毒素的基因非常适合在大肠杆菌 BL2KDE3)宿主细胞中表达，具有高表达、稳定的特点；2、选用的是大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，通过施加抗生素筛选出多拷贝转化细胞，进而筛选出高表达重组人DT388sBAFF免疫毒素的工程细胞。
图1、重组人DT388sBAFF免疫毒素诱导表达筛选后的电泳图；图中1、PET41 a-DTBAFF 诱导前，2、PET41 a-DTBAFF 诱导后，3、PET41 a-DTBAFF 诱导后，4、PET4Ia-DTBAFF 诱导后，5、PET4Ia-DTBAFF 诱导前，M 自下而上依次为25、34、47、85、 117KD (Fermentas SM 0441)；图2、检测重组人DT388sBAFF免疫毒素表达形式的SDS-PAGE电泳图；图中1、PET4Ia-DTBAFF 包涵体，2、PET4Ia-DTBAFF 包涵体，3、PET4Ia-DTBAFF包涵体，4、PET4Ia-DTBAFF 上清，5、PET4Ia-DTBAFF 上清，6、PET4Ia-DTBAFF 上清，7、 PET4Ia-DTBAFF 上清，8、PET4Ia-DTBAFF 上清，9、PET4Ia-DTBAFF 包涵体，10、M 自下而上依次为19. 9、25、34、47、85、117KD(Fermentas SM 0441)；图3、测定重组人DT388sBAFF免疫毒素的细胞学活性线性图。
具体实施例方式本发明人通过深入而广泛的研究，通过基因编码序列的优化设计，将编码人 DT388sBAFF免疫毒素的基因序列转入大肠杆菌，从而实现了重组人DT388sBAFF免疫毒素的高效表达。在此基础上完成了本发明。本发明根据编码人BAFF天然氨基酸的核苷酸序列，进行人工突变，将自然人 DT388sBAFF免疫毒素基因963位-979位的核苷酸序列gtccatgtctttggggatgaattgagt删除，插入ggtggttca序列。获得具有受体结合活性而缺乏B细胞活化作用的突变BAFF的基因序列；删除DT中编码受体结合区147个氨基酸的核苷酸序列；全基因合成pUC57-DT388s BAFF, PCR扩增DT388s BAFF，将该基因克隆到pMD中测序验证。优化后的DT388s BAFF编码序列与表达载体pET41a连接，转入大肠杆菌，通过实施抗生素筛选出表达工程细胞，再通过小量诱导表达筛选获得高表达工程细胞。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。实施例1表达质粒的构建和高表达工程菌株的获得根据白喉毒素和人天然BAFF氨基酸序列，进行人工突变，全基因合成重组DT388s BAFF蛋白的目的基因序列，通过PCR扩增得到目基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示， 将该基因克隆到PMD中并测序验证。用NdeI 和 Xhol 双酶切(选用 Buffer o，37°C，购自 NEB 公司)pMD_DT388s BAFF 及pET41a质粒(购自MBI公司)。将两个片段用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化进入大肠杆菌DH5 α (购自北京全式金公司)，在含有卡那霉素的LB平板上挑选克隆，小量制备质粒，通过双酶切/PCR鉴定筛选出阳性克隆。大量扩增确证的pET41a-DT388s BAFF质粒,获得含有DT388s BAFF的重组质粒pET41a-DT388s BAFF。表达质粒pET41a-DT388s BAFF经测序验证后，转化进入已制备好的大肠杆菌 BL21 (DE3)感受态细胞中，涂布含50ug/mL卡那霉素的LB平板，然后在转化平板上调取单克隆，用碱裂解法抽提并检测质粒。将确证含有表达质粒pET41a-DT388s BAFF的单克隆在含 50ug/mL卡那霉素的LB平板上保存。实施例2重组DT388s BAFF的表达及表达形式的确定挑选实施例1中确证好的表达工程菌BL21 (DE3) /pET41a_DT388s BAFF,用LB培养基进行培养并用IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳检测是否有目的条带出现，并分析表达量 (如图1所示)。取一部分发酵后的菌液离心，重悬于pH7.4，20mM PBS和2. 5mM EDTA缓冲液中，在冰浴下超声破碎，离心后，收集上清液和沉淀，SDS-PAGE电泳检测，确定其表达形式。分析上清液和沉淀，目的蛋白绝大多数在沉淀中，表明目的蛋白是以包涵体形式表达(如图2所示)。实施例3重组PEiMla-DTSSSs BAFF的纯化取SDS-PAGE 确证好的 IPTG 诱导的 pET41a_DT388s BAFF 表达工程菌 BL21 (DE3) 菌体超声沉淀，用8M尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20, IOmM Tris缓冲液(PH8. 0)重悬，加至用上述缓冲液活化好的Ni-NTA柱，混勻，置4°C摇床上结合3小时，用8M尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20, IOmM Tris 缓冲液(PH6. 3)洗；再用 8M 尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20, IOmM Tris缓冲液(PH4. 5)洗脱，收集pET41a_DT388s BAFF纯化蛋白。分别用6M尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20, IOmM Tris 缓冲液(PH8. 0) ；4M 尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20, IOmM Tris 缓冲液(PH8. 0) ；2M 尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20, IOmM Tris 缓冲液(PH8. 0) ；IM 尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20, IOmM Tris 缓冲液(PH8. 0) ；0. 5M 尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20, IOmM Tris 缓冲液(PH8. 0)和IOOmM NaH2PO4 · 2H20, IOmM Tris缓冲液(PH8. 0)梯度缓冲液透析，洗脱样品中的尿素。产物经测定，氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，过滤除菌。实施例4重组DT388s BAFF的细胞学活性的测定以BCA法测定DT388s BAFF蛋白浓度为30ug/ml，无菌条件下，用IMDM细胞培养基将蛋白稀释5个浓度梯度，分别为0ug/ml、0· 6ug/ml 1. 2ug/ml、l. 8ug/ml和3. 6ug/ml，分别作为五个实验组，并设立对照组和空白组。将处于对数生长期的BAFF-R(+)的B细胞株 Hmy. CHR和BAFF-R(-)的U937悬浮细胞分别接种于含10%胎牛血清的IMDM培养基的96 孔细胞培养板中，接种密度均为5000细胞/50ul/孔，空白组不接种细胞，加空白培养基补足50ul/孔，每组做3个复孔，边缘孔加无菌PBS以维持湿润环境。每组分别加相应浓度梯度的DT388s BAFF蛋白50ul，对照组不加蛋白，加空白培养基50ul/孔取代。37°C，5% CO2 培养72小时，加CCK8溶液IOul混勻，继续培养3小时，450nm测定OD值，计算每组平均OD 值。以每组平均OD值，按下列公式计算出DT388s BAFF蛋白分别对Hmy. CIR细胞和 U937细胞的增值率。细胞增值率=(实验组OD-空白组0D) / (对照组OD-空白组0D)细胞抑制率(％ ) = (1-细胞存活率)χ100%。实验结果见图3。由图3可以看出DT388sBAFF对BAFF-R(+)的B细胞株Hmy. CHR有明显的抑制作用，且随蛋白浓度的提高，DT388sBAFF蛋白对Hmy. CHR细胞的抑制率相应提高，当蛋白浓度为3. 6ug/ml时，DT388sBAFF蛋白对Hmy. CHR细胞的抑制率可达55%。本发明所述的目的蛋白DT388sBAFF对BAFF-R (-)的B细胞株U937细胞无抑制作用，两者比较有明显差异。本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考一样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种重组人DT388SBAFF免疫毒素，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.编码上述重组人DT388sBAFF免疫毒素的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
3.一种含有权利要求2所述核苷酸序列的表达载体。
4.含有权利要求2所述核苷酸序列或权利要求3所述表达载体的重组细胞。
5.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌 BL21(DE3)。
6.一种高表达重组人DT388sBAFF免疫毒素的工程细胞的构建方法，通过将权利要求2 所述编码重组人DT388sBAFF免疫毒素的基因与表达载体pET41a连接后，转入大肠杆菌，筛选获得高表达重组人DT388sBAFF免疫毒素的工程细胞。
7.权利要求1所述重组人DT388sBAFF免疫毒素在制备以B细胞为靶细胞的靶向治疗药物方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种重组人DT388sBAFF免疫毒素及其编码基因与应用，属于基因工程技术领域。本发明所述的重组人DT388sBAFF免疫毒素，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码该重组人DT388sBAFF免疫毒素的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所述的编码重组人DT388sBAFF免疫毒素的基因，非常适合在大肠杆菌中表达，同时通过发酵与纯化工艺优化，提高表达量，具有高表达、高稳定的优点。本发明可高效、简便、低成本的获得重组人DT388sBAFF免疫毒素。
文档编号C12N15/63GK102206284SQ20111009689
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月18日 优先权日2011年4月18日
发明者焦玉莲, 赵跃然, 陈子江, 马金龙 申请人:焦玉莲, 赵跃然