专利名称：通过循环利用由甜叶菊甙a制造方法产生的副产物来以高产率制造甜叶菊甙a的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过重新利用由甜叶菊甙AOtebaudioside A)的制造方法产生的副产物来以高产率和高纯度制造甜叶菊甙A的方法。更详细地讲，本发明通过重新利用由甜叶菊甙A的结晶工艺产生的副产物作为原料而提供比现有制造方法高的产率和高的纯度的甜叶菊甙A。更详细地讲，本发明提供一种制造甜叶菊甙A的方法，其包含以下步骤经由重结晶(re-crystallization)除去包含在甜叶菊甙A晶体的母液中的除甜菊醇糖苷 (steviol glycosides)以外的诸如矿物、灰分及其他有机物质的物质，以此来提高甜叶菊甙A晶体的母液的纯度；以及通过使用具有β-1，3-葡糖基转移活性(i3-l，3-gluCOSyl transactivation)的微生物或酶的转化方法将作为主要成分的甜菊苷(stevioside)转化为甜叶菊甙A，以使得可将其再用作原料。
背景技术：
包含在甜菊植物中的甜菊苷(stevioside，ST)为以甜菊醇作为糖苷配基的二萜糖苷(diterpene glycoside)，且除了甜菊苷以外，其他甜味成分为甜叶菊甙A、C、D、E和杜尔可甙(DulcosideM。这类甜味组分在其甜味程度方面不同，且虽然没有清楚地揭示甜味与化学结构中的特征之间的关系，但是已知甜味和甜味品质主要受糖苷的葡萄糖结合部位、官能团(尤其是-0H)的排列和其排列的间距影响。甜菊苷和甜叶菊甙Α(β-1，3-单葡糖基甜菊苷)为高强度天然甜味料，分别具有比糖的甜味高约200-250倍的甜味。甜菊苷在后面留下一点苦味，而甜叶菊甙A几乎没有苦味，因此其在甜化性质方面优越。而且，甜叶菊甙A在甜味和甜化性质方面优越，且甜叶菊甙A作为可替换当前高强度的合成甜味料的高强度天然甜味料而引人注目。具体地说，美国食品及药品管理局(US FDA)仅批准了含有 95%或95%以上的甜叶菊甙A的甜菊苷作为高强度甜味料，且从2008年以来可以将其用作食品添加剂。此后，美国的大食品公司积极使用甜叶菊甙A，甜叶菊甙A已经以商品名Pure Via和TRUVIA市售。在这些产品中，甜菊市场中的主导产品TRUVIA是由嘉吉(Cargill)和可口可乐(Coca-Cola)生产的产品，占甜菊市场的58%。然而，TRUVIA在人造糖市场中的市场份额仅为6%。这是因为TRUVIA的制造成本高且TRUVIA具有非常特别的味道。因此， 许多食品公司正致力于解决这些问题。甜叶菊甙A的常 规生产方法可主要分成两步骤。第一步骤为获得具有高含量的甜菊醇糖苷的纯化产物的步骤，其中第一步骤中的经纯化的甜菊醇糖苷在东南亚市场中通常用作高强度的甜味料。第一步骤通过以下工艺生产产物通过使用水热流体、乙醇、甲醇或多元醇从干甜菊叶中提取含甜菊醇糖苷的溶液；使包含在所提取溶液中的颜料等脱色；通过脱盐、微量过滤和吸附树脂纯化经脱色的溶液以给出高纯度的甜菊醇糖苷；以及对所获得的甜菊醇糖苷进行喷雾并干燥等(见图1)。然而，因为由第一步骤产生的产物中的甜菊醇糖苷含量比与干甜菊叶原料中的甜菊醇糖苷含量比实质上仍然相同，所以最终产物中甜叶菊甙A含量比低到20%或高达 60%，且最终产物中的含量视作为原料的所栽培甜菊的种子和栽培条件而变化。通常，将如上所述生成的高纯度甜菊醇糖苷产物直接按原样或以通过经由葡萄糖转移酶促反应纯化生成的酶处理产物的形式用作高强度甜味料。第二步骤为用于提高甜叶菊甙A的纯度的选择性分离和纯化步骤。当在美国和欧洲等地区销售时，由第二步骤所生成的高纯度产物通常是有限制地进行生产和销售，因为在美国 和欧洲，仅高纯度的产物被批准用作食品添加剂。这第二步骤是使用选择性分步结晶原理的工艺，使用已经由第一步骤生成(或销售)的高纯度甜菊醇糖苷产物作为原料进行。根据第二步骤的常规实例，通过结晶收集在包括醇类(EtOH)的混合溶液中的作为原料的50-60%甜叶菊甙A，制备作为一次结晶产物的80-85%的甜叶菊甙A，且随后将80-85% 的甜叶菊甙A溶解在具有比上述溶剂具有更高醇(EtOH)含量的溶剂中，然后进行结晶，由此最终生成作为高纯度产物的95%以上的甜叶菊甙A(见图1)。分步结晶工艺具有下述有利特点从具有类似性质的其他物质中纯化单一物质而生成高纯度物质。然而，其具有物理限制从一次晶体收集中可以获得的目标产物的得率较低。具体地说，在高纯度甜叶菊甙A的情况下，由于使用两次结晶作为主要工艺的典型工艺的特征，难以使甜叶菊甙A的通常得率增加到50%以上。最终，在如上所述的生产高纯度甜叶菊甙A产物的工艺期间，所获得的副产物要多于目标产物。副产物作为酶加工产物的第一原料以低产品价值销售，且可以发现副产物的特性是限制从甜菊干叶开始生产甜叶菊甙A的全部工艺步骤中的收益率 (profitability)的主要因素。为了解决这类问题，人们已经致力于栽培具有高甜叶菊甙A含量的植物品种以便大量生产甜叶菊甙A，且在各种现有技术中揭示了已经证明部分有效的种子，这些技术包括韩国专利第10 2008-0058236号(发明名称含有高甜叶菊甙A含量的新品种甜菊植物及其栽培方法，New Species of Stevia Plant containing High Content Rebaudioside-A and Cultivation Method Thereof)以及包括 PCT/JP2006/303992、 US00PP10562P (发明名称命名为“RSIT 94-1306”的甜菊植物，Stevia Plant Named"RSIT 94-1306”)、US00PP10563P (发明名称命名为“RSIT 95_166_13”的甜菊植物，Stevia Plant Named “RSIT95-166-13”)和 US00PP10564P (发明标题命名为 “RSIT 97-751” 的甜菊植物，Stevia Plant Named "RSIT 97-751”)的海外专利。然而，甜菊植物从播种到收获需要长达5-6个月之久且需要宽阔的区域。具体地说，其产量取决于每年的气候条件且生产成本根据栽培环境和劳力成本来决定，且产品质量不一致。因此，经由植物育种生产具有高含量产品的甜叶菊甙A在生产成本、生产量、品质等方面存在限制。同时，研究人员(尤其是一些日本研究人员)对酶转移技术进行了各种研究来增加甜菊醇糖苷中的甜叶菊甙A含量。研究人员进行的研究的目标是人工增加在甜菊醇糖苷中具有优良甜味品质和高察觉甜度的甜叶菊甙A的含量，由此增加产品的附加值。最近，研究人员进行了一项用以增加甜叶菊甙A的得率的研究，该研究通过使用酶转移技术加工主要含有甜菊苷的基本原料，以增加甜叶菊甙A的得率并最终降低制造成本。具体地说，大日本墨水和化学股份有限公司(Dainppon Ink and Chemicals, Inc.)已经被授予了与这类研究成果有关的发明的专利权(见美国专利4590160)。所述美国专利揭示了一种生产甜叶菊甙A的方法，其包含使甜菊苷与β-1，3-糖基糖化合物(i3-l，3-glyCOSyl sugar compound)在水溶液或水性悬浮液中在具有β -1，3-糖基转移活性的微生物或酶存在下反应，由此形成甜叶菊甙Α。然而，所 述方法也未能提供令人满意的纯度水平。因此，需要开发一种制造高纯度甜叶菊甙A的方法。
发明内容
本发明涉及一种以高产率和高纯度生产甜叶菊甙A的方法，且尤其涉及一种生产甜叶菊甙A的方法，其中将由甜叶菊甙A的常规制造工艺产生的副产物、特别是由分步结晶工艺产生的作为母液的残留副产物用作原料并对其进行一系列工艺处理以具有适合第二步生产工艺(高纯度甜叶菊甙A生产工艺)的可再利用水平，且随后将所得副产物在甜叶菊甙A的生产工艺中循环利用。具体地说，对残留副产物进行一系列纯化工艺处理，且通过使用酶转移法结晶，以具有可再利用的水平，以便经济地增加甜叶菊甙A含量。已经开发一种现有技术，该技术仅用于增加甜菊原料或甜菊苷产品中的甜叶菊甙 A含量，而本发明具有如下技术特点开发一种再循环工艺以增加制造工艺的得率且通过将来自结晶过程的母液副产物加工到可再使用水平而提供具有高纯度的产物。根据本发明，已经发现，就产率和纯度而言，对于甜菊苷产品，与增加甜菊苷产品中甜叶菊甙A含量相比，通过使用由第一分步结晶工艺产生的副产物来增加甜叶菊甙A含量更为有效。更详细地讲，本发明的方法包含以下步骤纯化由结晶产生的母液以将经纯化的溶液中所含的甜菊醇糖苷含量增加到90%以上；向经纯化的溶液中加入不溶的β_1，3葡聚糖，例如凝胶多糖(curdlan)；通过β _1，3-葡聚糖酶分解β _1，3葡聚糖的β_1，3键以给出葡萄糖；以及通过使用特异性葡糖基转移酶连接葡萄糖与包含在经纯化的溶液中的甜菊苷，以生成甜叶菊甙Α，其含量为50%以上。根据本发明的高含量的甜叶菊甙A由通过这些步骤生成的产物单独制备或由所述产物与常规原料的混合物制备。本发明的发明人已经通过生产实质上高纯度的甜叶菊甙而完成了本发明，所述生产实质上高纯度的甜叶菊甙是通过以下步骤达成将在纯化并结晶经提取甜叶菊甙A之后生成的残留副产物中所包含的甜菊苷设定为受体，随后施加β -1，3-葡糖基转移酶和 β -1，3-葡聚糖酶，β -1，3-葡糖基转移酶会转移葡萄糖并且也是一种适于生产甜叶菊甙 A的酶，而β-1，3-葡聚糖酶用于分解包含在β-1，3-葡糖基寡醣化合物中的β_1，3葡萄糖。
图1为图示根据本发明的实施例制造甜叶菊甙A的方法的流程图。图2展示常规RA 60产品的HPLC(安捷伦(Agilent) 1200系列)组分分析数据。图3展示在根据本发明的实施例生产甜叶菊甙A的方法中用作原料的副产物样品的HPLC(安捷伦(Agilent) 1200系列)组分分析数据。
具体实施例方式下文参考展示本发明的示例性实施例的附图更全面地描述本发明。然而，本发明可以许多不同形式体现且不应认为本发明局限于本文所阐述的示例性实施例。而是，提供 这些示例性实施例从而使本发明更加全面且将对所属领域的技术人员充分表达本发明的范围。在图中，为了清楚起见，可能将层和区域的尺寸和相对尺寸放大。图中相同的参考编号表示相同的元件。一种以高产率和高纯度生产甜叶菊甙A的方法包括i)纯化在高纯度甜菊醇糖苷产物通过分步结晶纯化时产生的副产物；ii)对经纯化的副产物进行酶转移反应以将副产物中的甜叶菊甙A含量调整到50 重量百分数(wt至60wt%范围内；以及iii)单独分步结晶步骤ii)中生成的产物或分步结晶步骤ii)中生成的产物与高纯度甜菊醇糖苷产物的混合物，以生成甜叶菊甙A。步骤i)中的副产物可包括80wt%以上的甜菊醇糖苷，优选90wt%以上的甜菊醇糖苷。步骤i)中的副产物可包括40-50wt%的甜菊苷。根据本发明，在β-1，3-葡糖基寡醣化合物、能够分解所述化合物中的β_1，3葡萄糖的β-1，3-葡聚糖酶和β-1，3-葡糖基转移酶存在下，在50°C的温度下对经纯化的副产物进行酶转移反应，时间为约5小时。根据本发明，β -1,3-葡糖基寡醣化合物为来源于此项技术已知的微生物的化合物且其实例为凝胶多糖(curdlan)和昆布多糖(Iaminarin)。根据本发明的方法，副产物的纯化可通过脱盐、微量过滤或使用吸附树脂的纯化进行。然而，纯化方法不受此限制。根据本发明的方法，β-1，3-葡糖基转移酶可使用本身具有β-1，3_葡糖基转移活性的微生物或相应的酶，具有β -1，3-葡糖基转移活性的微生物或酶的实例为美国专利 4，590，160中公开的微生物或酶。本发明也涉及一种使用在通过分步结晶纯化高纯度甜菊醇糖苷产品时产生的副产物的方法，其中所述方法的特征在于包括在对副产物进行酶转移反应之后在甜叶菊甙A 的制造方法中再循环副产物。本文使用的术语“高纯度的甜菊醇糖苷产物”是指通过以下步骤生成的产物使用水热流体、乙醇、甲醇或多元醇从甜菊干叶中提取含甜菊醇糖苷的溶液且随后纯化溶液，以给出含至少70衬％的甜菊醇糖苷的产物。本文使用的术语“RA60”或“RA97”是指以产物的总重量计含有60衬％或97wt% 的甜叶菊甙A的产物。除非另作定义，否则本文使用的单位“ ％，，是指重量百分数。现将参考以下实例进一步详细地描述本发明。这些实例仅用于说明目的，并不是打算限制本发明的范围。< 实例 >实例1.对常规RA 60产品中和在由常规甜叶菊甙A生成的残留副产物、尤其是由分步结晶工艺产生的作为母液的残留副产物中的甜菊醇糖苷的含量和灰分含量分析进行HPLC分析以确定甜菊醇糖苷的含量。为此，将Ig的每种样品和IOOOml的蒸馏水装载到IOOOml的大容量圆筒中并均勻混合，且随后经0.45 μ m水性过滤器过滤。使用 HPLC(安捷伦(Agilent) 1200系列)装置且向其中装载20 μ 1的每种样品。设定分析条件 流速为0. 5mL/min且波长为210nm。如图2和图3中所示，测量甜菊苷、甜叶菊甙A和甜叶菊甙C的含量。作为分析结果，常规RA60产品包括23. 3 %的甜菊苷、61. 4 %的甜叶菊甙A和 12. 7%的甜叶菊甙C，而副产物包括42. 6%的甜菊苷、25%的甜叶菊甙A和26. 9%的甜叶菊
试Co表1含量差异和主要含量因素比较
权利要求
1.一种以高产率制造甜叶菊甙A的方法，所述方法包括i)纯化在高纯度甜菊醇糖苷产物通过分步结晶纯化时产生的副产物的步骤； )对所述经纯化的副产物进行酶转移反应以将所述副产物中的甜叶菊甙A含量调整到50wt %至60wt %范围内的步骤；以及iii)单独分步结晶步骤ii)中生成的所述产物或分步结晶包含步骤ii)中生成的所述产物与高纯度甜菊醇糖苷产物的混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中得自步骤i)的所述副产物包含80衬％以上的甜菊糖苷。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶转移反应是在β_1，3-葡糖基寡醣化合物、 能够分解所述化合物中的β_1，3葡萄糖的β-1，3-葡聚糖酶和β-1，3-葡糖基转移酶的存在下对所述经纯化的副产物进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述酶转移反应是在50°C的温度下进行5小时。
5.一种使用在高纯度甜菊醇糖苷产物通过分步结晶纯化时生成的副产物的方法，其中所述方法包含如下步骤对所述副产物进行酶转移反应；以及在甜叶菊甙A的制造方法中再循环所述副产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述酶转移反应是在β-1，3-葡糖基寡醣化合物、 能够分解所述化合物中的β_1，3葡萄糖的β-1，3-葡聚糖酶和β-1，3-葡糖基转移酶的存在下对所述经纯化的副产物进行。
全文摘要
本发明涉及一种通过循环利用在由含甜味物质的甜菊叶生产甜叶菊甙A时产生的副产物来以高产率生产甜叶菊甙A的方法，本发明提供一种制造甜叶菊甙A的方法，其包含以下步骤经由重结晶(re-crystallization)除去包含在甜叶菊甙A晶体的母液中的除甜菊醇糖苷(steviol glycosides)以外的诸如矿物、灰分及其他有机物质的物质，以此来提高甜叶菊甙A晶体的母液的纯度；以及通过使用具有β-1，3-葡糖基转移活性(β-1，3-glucosyl transactivation)的微生物或酶的转化方法将作为主要成分的甜菊苷(stevioside)转化为甜叶菊甙A，以使得可将其再用作原料。
文档编号C12P19/56GK102220398SQ201110096599
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月18日 优先权日2010年4月16日
发明者朴承源, 李柱恒, 李英美, 洪映镐, 金成俌 申请人:Cj第一制糖株式会社