专利名称：一种从油/气藏环境中提取微生物宏基因组的方法
技术领域：
本发明涉及分子生态学技术领域，具体的说是由油/气藏复杂环境中直接提取微生物宏基因组的简易方法。
背景技术：
微生物采油/气技术及油/气藏微生物勘探技术的重点之一在于了解油/气藏复杂环境中微生物的整体信息。限于目 前技术手段的局限，只有大约1%左右的微生物可为人工培育及认识，为此上世纪末，科研工作者开发了宏基因组技术，宏基因组学是通过提取某一环境中的所有微生物基因组DNA、构建基因组文库及对文库进行筛选而寻找和发现新的功能基因及活性代谢产物的一种方法。1998年Handelsman等首次提出宏基因组的概念,并将其定乂为一种以环境样品中的微生物全体基因组作为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，为微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系，以及与环境之间的关系为研究方向的新的微生物研究方法，并第一次使用了 Meta-genomics这个名词。其基本策略流程为样品和基因(组)的富集；提取特定环境中的基因组DNA ;构建宏基因组DNA文库；筛选目的基因；以及目的基因活性产物表达。宏基因组学避开了微生物分离培养的过程，极大地扩展了微生物资源的利用空间，是现代基因工程一个新的发展方向和研究热点。宏基因组学研究的首要前提在于获得自然界真实无偏好的微生物基因组信息，但由于油/气藏环境的复杂性，其操作相对困难。油/气藏是一种独特的极端生态环境，其蕴含着丰富的微生物类群；这些微生物具有多种代谢类型，通过其本身在油/气藏中的繁殖生长以及代谢产物的作用，可在MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery,微生物强化米油)和 MPOG (MicrobiologicalProspecting of Oil and Gas,微生物油气勘探)中发挥重要作用。MEOR是指将地面分离培养的微生物菌液和营养液注入油层，或单纯注入营养液激活油层内的微生物，使其在油层内生长繁殖，产生有利于提高采收率的代谢产物，以提高油田采收率的采油方法，俗称微生物采油，其机制在于
I.改变原油的组成，降低其粘度
微生物在生长代谢过程中，以原油中的正构烷烃作为自身生长的碳源，从而改变原油的碳链组成；另一方面，微生物生长时释放出的生物酶，可以降解原油，使原油碳链断裂，高碳链原油变成低碳链原油，重组分减少，轻组分增加，凝固点和粘度降低，从而起到降粘、防蜡的作用。2.改变原油的驱油环境，使其更易于采出地面 (I)产生表面活性剂
微生物的代谢会产生表面活性剂，这些生物表面活性剂可以降低油水界面张力，减小水驱油毛管力。另外，生物表面活性剂会改变油/气藏岩石的润湿性，使其从亲油变成亲水，这样吸附在岩石表面的油膜脱落下来，油藏剩余油饱和度降低，从而提高原油采收率。
(2)产生生物气
大多数微生物在代谢过程中都会产生气体，如二氧化碳、氢气、氮气等，这些气体溶解在水中，可以降低原油粘度，提高原油流动能力。另外，这些气体的存在还会增加油层压力，间接减小剩余油饱和度。同时，气泡的贾敏效应还会增加水流阻力，提高注入水波及效率。(3)产生酸及有机溶剂
微生物的代谢产生相对低分子量的有机酸，也有部分无机酸，它们能溶解碳酸盐，一方面增加岩石孔隙度，提高了渗透率；另一方面，释放二氧化碳，提高了油层压力，从而降低原油粘度，提高了原油的流动能力。微生物的代谢过程还会产生醇、酯等有机溶剂，可以改变岩石表面性质和原油物理性质，使吸附在岩石表面的原油被释放出来，并易于米出地面。(4)形成生物聚合物
在微生物的代谢过程中会产生生物聚合物。这些生物聚合物可以在油藏高渗透区选择 性地封堵大孔道，调整注水油层的吸水剖面，增大注入水扫油面积。生物聚合物还可以增加水的粘度，降低水油比，提高注入水的扫油效率，从而提高采收率。3.微生物的直接作用
微生物在岩石表面生长，会占据孔隙空间而驱走原油。另外，微生物能吸附到岩石表面，在油膜下生长，最后把油膜推开，使原油释放出来。油气微生物勘探(MicrobialProspection for Oil and Gas , MPOG)是一种依据地表微生物分布情况进行油气勘探的方法，主要研究近地表土壤层中微生物异常与地下深部油气藏的相关关系。MPOG的应用领域包括⑴未采区含油气性预测，其依据在于特定微生物高值异常区通常是地层中烃类渗漏的可靠指标；⑵成熟探区储层评价微生物油气勘探技术在其应用早期只用于油气远景区预测。但近10年来，这种技术在测量成果的解释方面获得了突破。美国地质微生物技术公司率先将该方法用于对地下油气储层分布状况的评价之中，建立了 “微生物储层特性评价技术(MRC—Microbial ReservoirCharacterization ) ”,将该技术的应用范围由勘探领域延伸到开发领域。由于传统方法的限制，目前MPOG的指示微生物研究主要集中于产甲烷菌等少数几种菌株，而地质土壤中很可能存在大量的可用于指示的微生物种类，因此，运用定量PCR，高通量测序检测的优势，可以结合实际油/气藏情况，进行大规模、多菌种的定量筛查，利用多指标的数据结论增加MPOG预测的成功率。同时，可以对不同地区、不同土质、不同沉积环境的不同微生物进行比较，筛选出适合MPOG应用的新的指示菌群。国内外现在尚无任何关于石油宏基因组在ME0R，MPOG和MRC中的相关研究及应用。因此，通过该发明方法为获得微生物完整基因组提供了可操作性强且简便实用高效的方法，可以最大程度地获得完整的样品基因组信息。
发明内容
为克服上述问题，本发明提供了一种提取并纯化油/气藏复杂环境中宏基因组的方法，该方法可针对绝大多数油/气藏样品，操作简单、经济、环境友好、高质高效。本发明提取油/气藏环境宏基因组的得到包括步骤
(I)有机相/水相萃取获得油样/油水样中微生物组份。具体的说，在原油中加入等体积的10-50%乙醇和半数体积的石油醚/正己烷混合物(1-3:1 v/v),充分摇匀；静止使油水相分层，用胶管抽取下层水相。用滤纸过滤掉水相中少量原油和其他杂质；(2)将步骤I所获水相经O. 22Mffl微孔滤膜真空抽滤，富集菌体于滤膜上；(3)对步骤2所得微生物细胞进行裂解，具体的说，将滤膜剪碎放入IOmL离心管中，加入100-500μ 溶菌酶(10mg/mL溶于 IOmM Tris-HCl, ρΗ8· O), 37°C水浴 O. 5-2 h ;加入 50-300μ 10% 的 SDS 和 10_50μ 蛋白酶K (20mg/mL)，37°C水浴1-4 h ; (4)高盐条件下通过CTAB去除步骤3所获组份中的蛋白质和有机大分子(如 多糖)，具体的说，加入100-500μ 的5Μ NaCl颠倒混匀，加入100-500μ 5%CTAB, 50-80°C水浴10_60min ；(5)对步骤4所获组分进行核酸抽提及沉淀，具体的说，冷却后吸出上清，碎膜用100-500μ 无菌去离子水洗涤一次，吸出上清，将两次吸出的上清液体混合，加入等体积的氯仿异戍醇=24 1的混合物,颠倒混勻O. 5-5min,静置l_5min ；12000rpm离心10_30min，吸出上清。加入O. 5-1倍体积的异丙醇，_20°C放置3h或放置过夜；12000rpm离心10_30min,小心倒掉上清,沉淀加入l_5mL 75%冷乙醇洗漆一次,凉至乙醇挥发殆尽，加入ιο-ιοομ 无菌去离子水溶解。本发明的提取对象样本可以为原油样品，同时也包括，但不限于，注水井油水混合样、石油污染土壤、石油污染水体，天然气库周边环境的水、土壤等样品。对不同的样本，微生物富集的方式略有不同，如对于油水样(油含量少于5%)，主要通过过滤收集水相，然后对滤纸上收集的原油样以PBS缓冲液进行涡旋震荡重悬，再次过滤收集水相，然后合并水相获得微生物组份。获得富集后的微生物组份后，操作方法趋于一致。经O. 22ΜΠ1微孔滤膜真空抽滤，理论上可富集99. 5%以上的环境微生物，因此可充分获得油/气藏微生物的全体信息。加入溶菌酶，主要针对常规条件下难以破壁的革兰氏阳性细菌；同时结合阴离子去污剂SDS及蛋白酶K处理，可在相对温和的条件下促进细菌细胞壁破裂，从而释放出基因组。SDS同时还可以抑制细胞内的DNase的活性，提供DNA稳定环境。在高盐环境下，CTAB可结合裂解组份中的蛋白质和多糖等有机大分子，而核酸组份则保持溶解状态，从而获得分离。以等体积的氣仿异戍醇=24 I的混合物进行抽提，可进一步去除残留的蛋白质；继而通过异丙醇沉淀，获得全整的宏基因组。本方面方法所获得的宏基因组，可用于后续的PCR反应，文库建立，Southern等各种分子生物学操作。方法简单，无需复杂设备，全部反应可在10小时内完成；环境友好，对环境及实验人员无毒害作用。本方法的主要优势如下
I本发明主要针对油/气藏复杂环境中宏基因组成份的提取，与常规的微生物筛选技术相比，本发明绕开了复杂的微生物培养过程，同时兼顾可培养微生物与未可培养微生物，因此能够在最大程度上反映油/气藏复杂环境中微生物分布的真实情况；
2由本发明所提供的方法入手，基于对宏基因组组份的深入分析，可以大大缩短微生物菌种及代谢产物的开发周期，提高对本源微生物的认识，在微生物及功能分子筛筛选过程中做到有的放矢；
3就本发明自身而言，与常规基因组提取工艺相比，存在着成本低廉、可重复性高、所获样本无偏好、所针对的目的微生物广泛，等诸多优势；
4油/气藏环境中存在的原油组份、蜡质、浙青质、芳香烃类，以及因施工、其他环境因素等引入的腐殖质、植物胶多糖类等物质，对常规的分子生物学操作会造成相当大的影响，本发明针对上述疑难问题，在工艺上进行了逐一改善，因此在最大程度上提高了宏基因组成份的提纯效率。
图I宏基因组提取情况汇总图；图1中Linel为实施例I例证，Line2为实施例2例证，Line3-4为实施例3例证。Linel :中石油某区块原油样品微生物基因组，Line2 :中石油某区块油水样品微生物基因组，Line3 :中石油某区块地表油泥样品微生物基因组，Line4 :中石油某区块污染水体样品微生物基因组。图2纯化后的16S rDNA序列PCR片段。Linel :源于中石油某区块原油样品，Line2 :源于中石油某区块油水样品，Line3 :源于中石油某区块地表油泥样品，Line4 :源于中石油某区块污染水体样品。
具体实施方式
以下用具体实施方式
对本发明的应用方法进行描述。体积参数不限于描述中所示范围，如需加大提取规模，可按比例放大。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明方法的适用范围。实施例I从原油中提取微生物宏基因组的简易方法 I.取大约IOOmL原油置于玻璃烧杯中，70°C水浴30分钟。2.加入等体积30% (V/V)乙醇和原油一半体积的石油醚正己烷(V/V=l: I)混合物，充分摇匀。3.静止使油水相分层，用胶管抽取下层水相。用滤纸过滤掉水相中少量原油和其他杂质。4.过滤后液体用O. 22Mm微孔滤膜真空抽滤，富集菌体于滤膜上。 5.将滤膜剪碎放入IOmL离心管中，加入360μ 溶菌酶(10mg/mL溶于IOmMTris-HCl, pH8. 0)，37°C水浴 lh。6.加入 115μ 10% 的 SDS 和 25μ 蛋白酶 K (20mg/mL)，37°C水浴 2h。7.加入 400μ 的 5Μ NaCl 颠倒混匀，加入 280μ 5%CTAB, 65°C水浴 20min。8.冷却后吸出上清，碎膜用200μ 无菌去离子水洗涤一次，吸出上清，将两次吸出的上清液体混合，加入等体积的氯仿异戍醇=24 1的混合物,颠倒混勻Imin,静置2min。9. 12000rpm离心30min，吸出上清。加入O. 6倍体积的异丙醇，_20°C放置3h或放置过夜。10. 12000rpm离心20min,小心倒掉上清,沉淀加入ImL冷75%乙醇洗漆一次,凉至乙醇挥发殆尽，加入30μ 无菌去离子水溶解所获宏基因组成份。11.所获基因组成份显示于图I Linel，电泳条件为75V下30分钟。实施例2从油水混合物中提取微生物宏基因组的简易方法 I.取大约IOOmL油水混合物置于玻璃烧杯中，70°C水浴30min。2.用滤纸过滤油水混合物，收集水相。3.留在滤纸上方的原油与二倍体积无菌PBS混合，充分搅拌，用滤纸过滤收集水相，重复三次。4.合并过滤后水相，用O. 22Mm微孔滤膜真空抽滤，富集菌体于滤膜上。5.将滤膜剪碎放入IOmL离心管中，加入360μ 溶菌酶(10mg/mL溶于IOmMTris-HCl, pH8. 0)，37°C水浴 lh。6.加入 115μ 10% 的 SDS 和 25μ 蛋白酶 K (20mg/mL)，37°C水浴 2h。 7.加入 400μ 的 5Μ NaCl 颠倒混匀，加入 280μ 5%CTAB, 65°C水浴 20min。8.冷却后吸出上清，碎膜用200μ 无菌去离子水洗涤一次，吸出上清，将两次吸出的上清液体混合，加入等体积的氯仿异戍醇=24 1的混合物,颠倒混勻Imin,静置2min。9. 12000rpm离心30min，吸出上清。加入O. 6倍体积的异丙醇，_20°C放置3h或放置过夜。10. 12000rpm离心20min,小心倒掉上清,沉淀加入ImL冷75%乙醇洗漆一次,凉至乙醇挥发殆尽，加入30μ 无菌去离子水溶解所获宏基因组成份。11.所获基因组成份显示于图I Line2，电泳条件为75V下30分钟。实施例3从含油土壤(污泥)中提取微生物宏基因组的简易方法
I.取大约IOg含油土壤置于玻璃烧杯中，加入IOOmL PBS，重复搅拌，70°C水浴30min。2.用滤纸过滤混合物，收集水相。3.留在滤纸上方的原油和土壤用IOOmL无菌PBS溶解，充分搅拌，用滤纸过滤收集水相，重复三次。4.合并过滤后水相，用O. 22Mm微孔滤膜真空抽滤，富集菌体于滤膜上。5.将滤膜剪碎放入IOmL离心管中，加入360μ 溶菌酶(10mg/mL溶于IOmMTris-HCl, pH8. 0)，37°C水浴 lh。6.加入 115μ 10% 的 SDS 和 25μ 蛋白酶 K (20mg/mL)，37°C水浴 2h。7.加入 400μ 的 5Μ NaCl 颠倒混匀，加入 280μ 5%CTAB, 65°C水浴 20min。8.冷却后吸出上清，碎膜用200μ 无菌去离子水洗涤一次，吸出上清，将两次吸出的上清液体混合，加入等体积的氯仿异戍醇=24 1的混合物,颠倒混勻Imin,静置2min。9. 12000rpm离心30min，吸出上清。加入O. 6倍体积的异丙醇，_20°C放置3h或放置过夜。10. 12000rpm离心20min,小心倒掉上清,沉淀加入ImL冷75%乙醇洗漆一次,凉至乙醇挥发殆尽，加入30μ 无菌去离子水溶解所获宏基因组成份。11.所获基因组成份显示于图I Line3，4，分别由泥样及水样中获得；电泳条件为75V下30分钟。实施例4基于宏基因组基础上的菌落鉴定及群落多样性分析
I.以由实施例1-3中方法所获得的宏基因组组份作为模板，模板加入量可依据实际丰度进行适当稀释，参考值为单个PCR体系中加入IO-IOOng宏基因组组份，如所需扩增的序列拷贝过低则可适当提高。2.使用细菌 16S rDNA 序列通用引物8F (5，-TTTGATCCTGGCTCAG-3’)以及 1492R(5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。3. PCR反应体系为25 μ ,反应条件为94°C变性4min ;接下来进行30个循环反应94°C变性45 s，50°C退火45 s，72°C延伸90 s ;然后72°C再延伸10 min，最后于4°C保存。4.所获16S rDNA序列PCR产物经纯化后通过TA克隆连接于商品化或自制T载体中，将连接产物转化DH5 α感受态细胞，涂布于相应抗性平板构建文库，并筛选阳性克隆。5.挑选阳性克隆测定插入的16S rDNA部分序列，并与GenBank中已知序列进行同源性比较，确定对应微生物的种属。6.所获宏基因组组份同样可为其他多样性分析技术手段提供微生物群落基础信息，下游相关技术包括，但不限于，核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析(ARDRA)、变形梯度凝胶电泳(DGGE )、温度梯度凝胶电泳(TGGE )链构象多态性分析(SS-CP )、末端限制性片段长度多态性分析(T-PFLP)、随机扩增片段长度多态性分析(RAPD)、扩增片段长度多态性 分析(AFLP)，等。本发明所述方法快捷简单，成本低廉，整个提取过程可在10小时之内完成；所获基因组纯度高，OD260nm:OD280nm比值在I. 7-2. O之间，电泳结果检测基因组整体无降解情况。本发明方法不仅针对油/气藏复杂环境，还适用于其他受石油污染的土壤及水体中微生物基因组的提取。
权利要求
1.一种从油/气藏环境中提取微生物宏基因组的方法，其特征在于包括步骤 (1)有机相/水相萃取获得液相样品中微生物组份；具体的说，在液相样品中加入与样品等体积的10-50% (V/V)的乙醇和样品半数体积的石油醚/正己烷混合物，石油醚/正己烷(V/V)= 1-3 :1，充分摇匀；静止使油水相分层，用胶管抽取下层水相；用滤纸过滤掉水相中原油和其他杂质； (2)将步骤I)所获水相经O.22Mffl微孔滤膜真空抽滤，富集菌体于滤膜上； (3)对步骤2)所得微生物细胞进行裂解，具体的说，将滤膜剪碎放入IOmL离心管中，加入100-500μ 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度是溶菌酶5-20mg/mL溶于IOmM Tris-HCl, pH8. 0，37°C水浴 O. 5-2h ;加入 50-300μ 10%(W/V)的 SDS 和 10-50μ 浓度 20mg/mL 蛋白酶 K，37°C水浴l_4h ； (4)高盐条件下通过CTAB去除步骤3)所获组份中的蛋白质和有机大分子(如多糖)；具体的说，向步骤(3)终溶液中加入100-500μ 的5Μ NaCl颠倒混匀，加入100-500μ 5%CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)，50-80°C水浴10-60min ； (5)对步骤4)所获组分进行核酸抽提及沉淀；具体的说，冷却至室温后吸出上清，碎膜用100-500μ 无菌去离子水洗涤一次，吸出上清，将两次吸出的上清液体混合，加入等体积的氯仿异戍醇=24 1的混合物，颠倒混勻O. 5-5min,静置l_5min ;12000rpm离心10-3min,吸出上清；加入O. 5-1倍体积的异丙醇，_20°C放置3h或放置过夜；12000rpm离心10-30min,倒掉上清，沉淀加入l_5mL冷75%乙醇洗漆一次，凉至乙醇挥发殆尽，加入10-100μ 无菌去离子水溶解所获宏基因组成份。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)所述液相样品包括，原油样品、油水混合物、水样、石油污染土壤或水体或植物及天然气库环境中的水、以生理盐水稀释的土壤样品。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)所述被提取样本中所包含的微生物既包括可培养微生物，也包括未可培养微生物。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)所述被提取样本中所包含的微生物包括，革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、古细菌、真菌中的一种或二种以上。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于按各溶液总体加和体积计算，步骤(I)所用萃取体系中，乙醇的终浓度为4-20%，石油醚终浓度为10-15%，正己烷终浓度为5-10%，以上浓度均为体积比。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(3)细胞裂解中，溶菌酶、SDS、蛋白酶K联合使用，其中溶菌酶处理时的终浓度为5-20mg/mL ;SDS使用终浓度为1_3%，蛋白酶K使用终浓度为O. 2-2 mg/mL。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于蛋白及多糖沉淀步骤(4)所用NaCl和CTAB终浓度分别为1-4 M以及O. 5-2. 0%。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于所获宏基因组样品的后续用途包括，油/气藏环境微生物群落多样性分析、种群结构分析、进化关系、功能活性以及相互协作关系的分子生态学、油/气藏本源微生物宏基因组文库构建、基于功能分析及序列分析的功能活性分子筛选、或活性分子基因工程菌的构建。
全文摘要
本发明提供一种由油/气藏复杂环境样品中直接提取微生物宏基因组的简易方法，包括以有机相/水相萃取获得油样/油水样中微生物组份，真空过滤水相富集微生物，以溶菌酶、蛋白酶、十二烷基硫酸钠(SDS)等裂解细胞，在高盐条件下通过十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)去除蛋白质以及多糖等有机大分子组份，随后通过核酸抽提及沉淀，获得无偏好的油/气藏微生物宏基因组成分。本发明所述方法快捷简单，成本低廉，整个提取过程可在10小时之内完成；所获基因组纯度高，OD260nm:OD280nm比值在1.7-2.0之间，电泳结果检测基因组整体无降解情况。本发明方法不仅针对油/气藏复杂环境，还适用于其他受石油污染的土壤及水体中微生物基因组的提取。
文档编号C12N15/10GK102732504SQ20111009652
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月15日 优先权日2011年4月15日
发明者刘铭楠, 吴迪, 杭晓明, 梅晓丹, 王平, 王金良, 赵静, 项迎霞, 马雯雯 申请人:大连百奥泰科技有限公司