专利名称：一种重组人PE38sBAFF免疫毒素及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组人PE38sBAFF免疫毒素及其编码基因与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
免疫毒素是具有导向能力的分子(载体)和具有细胞毒性的分子(毒素)偶联而成的具有特异性细胞杀伤能力的杂合分子，它通过载体的导向作用，使其所携带的毒素分子到达靶细胞，继而在胞内抑制蛋白质合成导致细胞死亡，达到特异性杀伤靶细胞的作用而不损伤正常组织。B 细胞 舌化因子(B-cell activator factor belonging to the TNF family, BAFF)属肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)家族成员，BAFF主要表达在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和活化的T细胞表面。主要参与B细胞分化发育成熟的功能调节。BAFF 又称为 BLyS (Blymphocyte stimulator)、TALL-1 (TNF-and apoptosis ligand-related leukocyte expressed ligand 1)、 THANK(TNF homologue that activates apoptosis, NF-KB and JNK)、zTN F4 等，是 B 细胞存活与成熟和 T 细胞激活的必需因子。人BAFF基因定位于13号染色体长臂32_34区(13q32_q34)，长约Ikb。含857bp 的单一开放读码框，编码285个氨基酸，其中47 73氨基酸为跨膜区，74 285氨基酸为胞外区，133 285氨基酸为其发挥功能的主要区域。BAFF属II型跨膜蛋白，N端在胞内， 缺少信号肽序列，C端在胞外，其胞外段与TNF超家族成员IPRIL有高度同源性。具有TNF 家族特征性结构，富含β 2片层的同源三聚体，在三聚体的中央含2个镁离子，能够稳定蛋白功能。BlyS的生理学功能由三种细胞表面受体介导，分别是BCMA (B cell maturation antigen)>TACI(transmembrane activator and calcium modulator cyclophilin ligand intercator)和BAFF受体(BAFF rec印tor，BAFF_R)，三种受体主要表达在B细胞上，均属于 TNF受体家族成员，他们的表达受T、B细胞的控制。三者均通过一个小的结构域结合BAFF， BAFF与它的三种特异性细胞膜受体结合后，能促进B淋巴细胞增殖、分化发育、活化并分化为浆细胞，刺激免疫球蛋白产生，产生相应的生理和病理性免疫应答，参与机体正常免疫调节和免疫病理。铜绿假单胞菌外毒素(Pseudomonas Aeruginosa Exotoxin Α, ΡΕ)是铜绿假单胞菌产生的细胞毒素。其在空间上分为3个结构域，Domain I由Domain Ia和Domain Ib组成， Domain Ia (第1 252位氨基酸)具有细胞结合识别能力，Domain Ib (第365 404位氨基酸)位于Domain II和DomainIII之间，功能目前尚不清楚，大部分氨基酸的缺失不影响毒素分子的活性。DomainII (第253 264位氨基酸)具有跨膜转运的能力。DomainIII (第 405 613位氨基酸)具ADP核糖基化活性，能抑制蛋白质合成，PE的细胞毒性机制就主要依赖于其Domainlll。PE分子进入哺乳动物体内后，Domain Ia与广泛分布于哺乳动物细胞的α 2巨球蛋白受体相结合，被细胞内吞，接着PE裂解为大小为Mr 37000和27000的2 个片段，大片段最后进入高尔基体与延长因子2 (EM)相结合使其糖基化失活，抑制蛋白合成，从而导致细胞凋亡。其衍生PE38KDEL是去除了 PE分子的Domain Ia及Λ第365 380位氨基酸，同时将羧基端的REDLK突变为内质网保留序列KDEL。该衍生物缺乏细胞结合识别能力，保留了毒性基团，且抑制蛋白质合成毒性强于野生型ΡΕ。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种重组人PE38sBAFF免疫毒素及其编码基因与应用。一种重组人PE38sBAFF免疫毒素，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。编码上述重组人PE38sBAFF免疫毒素的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。一种含有SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的表达载体。含有上述SEQ ID No. 2所示核苷酸序列或上述表达载体的重组细胞。所述重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。一种高表达重组人PE38sBAFF免疫毒素的工程细胞的构建方法，通过将上述编码重组人PE38sBAFF免疫毒素的基因与表达载体pET41a连接后，转入大肠杆菌，筛选获得高表达重组人PE38sBAFF免疫毒素的工程细胞。上述重组人PE38sBAFF免疫毒素在制备B细胞恶性增殖性疾病和异常活化性疾病的靶向治疗药物中的应用。本发明的优点在于本发明通过重组DNA技术构建PE38KDEL和突变BAFF的免疫毒素融合基因， PE38KDEL位于基因上游，突变BAFF位于基因下游，两者间通过柔性linker_G4S连接，并对基因的密码子进行优化，以适于其在大肠杆菌中的高效稳定表达。该免疫毒素以人突变 BAFF为导向分子，以PE38KDEL为毒性基团，具有特异性靶向并杀伤表面带有BAFF受体的B 细胞的能力。可用于B细胞恶性增殖性疾病和异常活化性疾病的靶向治疗。具有高效、低毒、高特异性等特点。
图1、重组人PET41a_PE38sBAFF免疫毒素诱导表达筛选后的电泳图；图中1、PET41a-PE38sBAFF 诱导前，2、PET41a_PE38sBAFF 诱导后，3、PET41a_PE38sBAFF 诱导后，4、PET41a-PE38sBAFF 诱导后，5、PET41a_PE38sBAFF 诱导前，M 分子量 25、34、47、 85U17KD箭头指向47KD ；图2、检测重组人PET41a-PE38sBAFF免疫毒素表达形式的SDS-PAGE电泳图；图中l、PET41a-PE38sBAFF 上清，2、PET41a_PE38sBAFF包涵体，3、PET41a_PE38sBAFF 上清，4、PET41a-PE38sBAFF 包涵体，5、PET41a_PE38sBAFF)包涵体，M 17，26，34，43，55，72，95， 130(Fermentas SM 0671)；图3、测定重组人PET41a_PE38sBAFF免疫毒素的细胞学活性线性图。
具体实施例方式本发明人通过深入而广泛的研究，通过基因编码序列的优化设计，将人PE38sBAFF 编码序列转入大肠杆菌，从而实现了人PE38sBAFF高效表达。在此基础上完成了本发明。本发明根据编码人BAFF天然氨基酸的核苷酸序列，进行人工突变，将编码人BAFF 氨基酸基因第260位-286位的核苷酸序列gtccatgtctttggggatgaattgagt序列删除，插入 ggtggttca序列。获得具有受体结合活性而缺乏B细胞活化作用的突变BAFF的基因序列； 删除PE中编码受体结合区252个氨基酸的核苷酸序列；通过一段柔性linker-G4S连接， 生成以人突变BAFF为导向分子，以PE为毒性部分的免疫毒素。全基因合成pUC57-PE38s BAFF, PCR扩增PE38s BAFF，将该基因克隆到pMD中测序验证。优化后的PE38sBAFF编码序列与表达载体pET41a连接，转入大肠杆菌，通过实施抗生素筛选出表达工程细胞，再通过小量诱导表达筛选获得高表达工程细胞。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。实施例1 表达质粒的构建和高表达工程菌珠的获得根据铜绿假单胞菌外毒素衍生物和人天然BAFF氨基酸序列，进行人工突变，全基因合成重组PE38sBAFF蛋白的目的基因序列，通过PCR扩增得到目的基因PE38sBAFF，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，将该基因克隆到pMD中并测序验证。用NdeI 和 Xhol 双酶切(Buffer o，37°C，购自 NEB 公司)pMD_PE38sBAFF 及 pET41a 质粒(购自MBI公司)。将两个片段用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化进入大肠杆菌DH5 α (购自北京全式金公司)，在含有卡那霉素的LB平板上挑选克隆，小量制备质粒，通过双酶切/PCR鉴定筛选出阳性克隆。大量扩增确证的pET41a-PE38sBAFF质粒，获得含有 PE38sBAFF 的重组质粒 pET41a_PE38sBAFF。表达质粒pET41a-PE38sBAFF经测序验证后，转化进入已制备好的大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞中，涂布含50ug/mL卡那霉素的LB平板，然后在转化平板上调取单克隆，用碱裂解法抽提并检测质粒。将确证含有表达质粒pET41a-PE38sBAFF的单克隆在含 50ug/mL卡那霉素的LB平板上保存。实施例2 重组PE38sBAFF的表达及表达形式的确定挑选一株实施例1中确证好的表达工程菌BL21 (DE3)/pET41a-PE38sBAFF，用LB培养基进行培养并用IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳检测是否有目的条带出现，并分析表达量 (如图1所示)。取一部分发酵后的菌液离心，重悬于PH7. 4，20mM PBS和2. 5mM EDTA缓冲液，在冰浴下超声破碎，离心收集超声上清和超声沉淀，SDS-PAGE电泳检测，确定其表达形式。分析其超声上清和超声沉淀，目的蛋白绝大多数在沉淀中，表明目的蛋白是以包涵体形式表达(如图2所示)。实施例3 重组PE38s BAFF的纯化取SDS-PAGE确证好的IPTG诱导的pEI^la-PESSsBAFF表达工程菌BL21 (DE3)菌体超声沉淀，用8M尿素，IOOmM NaH2P04. 2H20, IOmM Tris缓冲液(PH8. 0)重悬，加至用上述缓冲液活化好的Ni-NTA柱，混勻，置4°C摇床上结合3小时，用8M尿素，IOOmM NaH2PO4 ·2Η20，IOmM Tris 缓冲液(PH6. 3)洗；再用 8M 尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20, IOmM Tris 缓冲液 (PH4.5)洗脱，收集 pET41a-DT388s BAFF 纯化蛋白。分别用 6M 尿素，IOOmM NaH2PO4 ·2Η20, IOmM Tris 缓冲液(ΡΗ8. 0) ；4Μ 尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20, IOmM Tris 缓冲液(ΡΗ8. 0) ；2Μ 尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20, IOmM Tris 缓冲液(ΡΗ8. 0) ；IM 尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20, IOmM Tris 缓冲液(ΡΗ8. 0) ；0. 5Μ 尿素，IOOmM NaH2PO4 ·2Η20，IOmM Tris 缓冲液(ΡΗ8. 0)和 IOOmM NaH2PO4 · 2H20, IOmM Tris缓冲液(ΡΗ8. 0)梯度缓冲液透析，洗脱样品中的尿素。产物经测定，氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，过滤除菌。实施例4 重组PE38sBAFF的细胞学活性的测定以BCA法测定PE38sBAFF蛋白浓度为30ug/ml，无菌条件下，用IMDM细胞培养基将 PE38sBAFF 蛋白稀释 5 个浓度梯度，分别为 0ug/ml、0. 6ug/ml 1. 2ug/ml、l. 8ug/ml 和 3. 6ug/ml，分别作为五个实验组，并设立对照组和空白组。将处于对数生长期的BAFF-R(+) 的B细胞株Hmy. CIR和BAFF-R(-)的U937悬浮细胞分别接种于含10%胎牛血清的IMDM培养基的96孔细胞培养板中，接种密度均为5000细胞/50ul/孔，空白组不接种细胞，加空白培养基补足50ul/孔，每组做3个复孔，边缘孔加无菌PBS以维持湿润环境。每组分别加相应浓度梯度的PE38sBAFF蛋白50ul，对照组不加蛋白，加空白培养基50ul/孔取代。37°C， 5% CO2培养72小时，加CCK8溶液IOul混勻，继续培养3小时，450nm测定OD值，计算每组平均OD值。以每组平均OD值，按下列公式计算出PE38sBAFF蛋白分别对Hmy. CHR细胞和U937 细胞的增值率。细胞增值率=(实验组OD-空白组0D) / (对照组OD-空白组0D)细胞抑制率(％ ) = (I-细胞存活率)χ100%。实验结果见图3。由图3可以看出PE38sBAFF对BAFF-R (+)的B细胞株Hmy. CHR有明显的抑制作用，且随蛋白浓度的提高，PE38sBAFF蛋白对Hmy. CHR细胞的抑制率相应提高，当蛋白浓度为3.6ug/ml时，PE38SBAFF蛋白对Hmy.(ΠR细胞的抑制率可达70(%。本发明所述的目的蛋白PE38sBAFF对BAFF-R (-)的B细胞株U937细胞无增值作用，两者比较有明显差异。本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考一样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种重组人PE38SBAFF免疫毒素，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.编码权利要求1所述重组人PE38sBAFF免疫毒素的基因，其特征在于，核苷酸序列如 SEQ ID No. 2 所示。
3.一种含有权利要求2所述核苷酸序列的表达载体。
4.含有权利要求2所述核苷酸序列或权利要求3所述表达载体的重组细胞。
5.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌 BL21(DE3)。
6.一种高表达重组人PE38sBAFF免疫毒素的工程细胞的构建方法，通过将权利要求2 所述编码重组人PE38sBAFF免疫毒素的基因与表达载体pET41a连接后，转入大肠杆菌，筛选获得高表达重组人PE38sBAFF免疫毒素的工程细胞。
7.权利要求1所述重组人PE38sBAFF免疫毒素在制备B细胞恶性增殖性疾病和异常活化性疾病的靶向治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种重组人PE38sBAFF免疫毒素编码基因的优化和免疫毒素重组蛋白的高效表达方法，属于基因工程技术领域。本发明所述的重组人PE38sBAFF免疫毒素，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码该重组人PE38sBAFF免疫毒素的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所述的编码重组人PE38sBAFF免疫毒素的基因，非常适合在大肠杆菌中表达，同时通过发酵与纯化工艺优化，提高表达量，具有高表达、高稳定的优点。本发明可高效、简便、低成本的获得重组人PE38sBAFF免疫毒素。
文档编号C12R1/19GK102206283SQ20111009666
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月18日 优先权日2011年4月18日
发明者崔彬, 焦玉莲, 赵跃然, 陈子江, 马金龙 申请人:赵跃然, 马金龙