呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于呕吐毒素单克隆抗体的免疫亲和柱的制备方法。通过细胞融合所得到的单克隆抗体与溴化氰活化的琼脂糖4B偶联得到的免疫亲和吸附剂填充与固相萃取管中得到了可以特异性吸附呕吐毒素的免疫亲和柱。本发明制备的免疫亲和柱能特异性的与呕吐毒素结合，最大结合容量约为240ngDON；重复使用三次，回收率不低于90%。本发明可用于谷物及谷物制品检测呕吐毒素残留的前处理方法。
【专利说明】呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于检测【技术领域】，具体地涉及涉及一种呕吐毒素的免疫亲和柱的制备方法。
【背景技术】
[0002]呕吐毒素，又称脱氧雪腐镰刀菌炼醇(Deoxynivalenol, DON),是于1970年从被禾谷镰刀菌污染的玉米中分离出来的一种能引起呕吐的毒素，主要由禾谷镰刀菌(.Fusarium graminearum)/5^,属单端孢霉炼族化合物B型。对热比较稳定,一般的烹调和加热都不能破坏其毒性，对碱性环境比较敏感，用碳酸钠溶液洗涤粮食，可以除掉70%左右的 DON。
[0003]动物DON中毒后表现为呕吐，食欲减退，体重下降，流产，弱仔和死胎，死亡率增高。人类DON中毒后会出现恶心、呕吐、胃部不适、腹痛、腹泻、头痛、头暈，还可能有口干、全身无力的症状，少数患者会出现颜面潮红、发烧。DON还具有很强的致癌、致畸、致突变的毒性、免疫毒性等危害，已被联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)确定为最危险的自然发生食品污染物之一。1998年，在国际癌症研究机构公布的评价报告中，呕吐毒素被列为三类致癌物。
[0004]许多国家已制定了谷物中呕吐毒素的限量标准，美国制定供人类食用的小麦呕吐毒素允许限量≤2 mg/kg，欧盟规定谷粉及玉米粉中允许限量≤0.75 mg/kg。我国GB2715-2005《粮食卫生标准》中规定小麦、大麦、玉米及其成品粮中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量为lOOOyg/kg，GB 2761-2005《食品中真菌毒素限量》规定小麦和玉米的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量为1000 μ g/kg。
[0005]目前呕吐毒素常用的检测多为仪器检测方法，如高效液相色谱法、液质联用(LC-MS)、气质联用(GC-MS)等。仪器方法检测具有灵敏度高，特异性强的优点，但是对样本的纯度要求较高，需要经过复杂的净化过程，传统的样本前处理技术，如液-液萃取、固相萃取、固相微量萃取等，步骤繁琐、缺乏选择性、容易受其他成分干扰、准确度低。而且呕吐毒素毒性剧烈，前处理过程中操作人员反复暴露在呕吐毒素的环境中，增加了实验的风险。因此建立快捷有效的样品前处理技术已成为呕吐毒素检测分析中亟待解决的问题。
[0006]免疫亲和色谱柱(Immunoaffinity Chromatography, IAC)是一种新型的样本前处理技术，它是将免疫反应与色谱分析方法相结合，利用抗原抗体结合的高度特异性和亲和力，用适当的方法将特异性的抗原或抗体结合到层析载体上，以便有效的分离和纯化各自互补的免疫物质。目前已在抗体、激素、多肽、病毒以及亚细胞化合物的分析中广泛应用。本发明旨在提供一种呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法，作为谷物及谷物制品检测呕吐毒素的前处理方法。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法，所研制的亲和柱是采用呕吐毒素单克隆抗体与溴化氰活化的琼脂糖4B (CNBr-Sepharose 4B)偶联后填充在固相萃取柱中，用于纯化含有呕吐毒素的待测样品。
[0008]本发明所述的呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法，按照下述步骤进行:
Cl)偶联:取纯化后的呕吐毒素单克隆抗体与溶胀后的CNBr-S印harose 4B凝胶共同放置于偶联缓冲液中，室温下震荡偶联；
(2)封闭:在偶联凝胶产物中加入其5~10倍体积的封闭缓冲液，室温下震荡反应
2h ；
(3)洗涤:分别用5~10倍封闭后凝胶体积的醋酸盐缓冲液和Tris-HCL缓冲液交替洗涤3次，然后用5~10倍封闭后凝胶体积的PBS缓冲液洗涤2次，制备得到免疫亲和吸附剂；
(4)装柱:将得到的免疫亲和吸附剂填充到固相萃取柱中，加入PBS缓冲液后自然沉降，得到呕吐毒素免疫亲和柱，4度保存待用。
[0009]所述固相载体可以为纤维素、葡聚糖凝胶、丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等，优选为Sepharose 4B。
[0010]所述的呕吐毒素单克隆抗体与CNBr-S^harose 4B干粉的质量比为1:80 ;所述的偶联缓冲液为0.1 mol/L NaHC03溶液；溶解CNBr-S印harose 4B干粉的缓冲液为1.0mmol /T, HCL0
[0011]所述的封闭缓冲液为0.1 mol/L Tris-HCL (pH 8.0)，用以封闭未偶联的活化位点。
[0012]所述的醋酸盐缓冲液为0.1 mol/L、pH4.0的醋酸盐缓冲液；所述Tris-HCL缓冲液为 0.1 mol/L、ρΗ8.0 的 Tris-HCL 缓冲液。
[0013]本发明制备的呕吐毒素免疫亲和柱可以用于谷物及谷物制品检测呕吐毒素残留的前处理方法。具有以下显著特点:1)减少了操作人员接触到呕吐毒素的几率；2)通过特异性的抗体与呕吐毒素结合，一次净化能够去除绝大部分的干扰物；3)所制备的免疫亲和柱最大结合容量为240ng DON ；4)所制备的免疫亲和柱重复使用三次，回收率不低于90%。
【具体实施方式】
[0014]下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
[0015]实施例1呕吐毒素免疫亲和柱的制备
(I)偶联
取IOmg经过辛酸-硫酸铵法纯化后的针对呕吐毒素的单克隆抗体在0.1 mol/LNaHC03溶液中透析过夜，将浓度调整至2mg/mL ；
称取CNBr-S印harose 4B干胶800mg，在IOmL 1.0 mmol/L HCL中充分溶胀；用10倍以上湿胶体积的0.1 mol/L NaHC03溶液洗漆3次，5000rpm离心Imin ；
将湿胶与抗体充分混匀，室温下搅拌过夜；
用50mL 0.1 mol/L NaHC03溶液洗涤，收集洗涤液，紫外鉴定，计算偶联率。偶联率的计算公式为:
【权利要求】
1.一种呕吐毒素免疫亲和柱的制备，其特征在于，是由固相载体和预期偶联的呕呕吐毒素单克隆抗体组成，具体步骤为:
(1)偶联:取纯化后的呕吐毒素单克隆抗体与溶胀后的CNBr-S印harose4B凝胶共同放置于偶联缓冲液中，室温下震荡偶联； (2)封闭:在偶联凝胶产物中加入其5~10倍体积的封闭缓冲液，室温下震荡反应2h ； (3)洗涤:分别用5~10倍封闭后凝胶体积的醋酸盐缓冲液和Tris-HCL缓冲液交替洗涤3次，然后用5~10倍封闭后凝胶体积的PBS缓冲液洗涤2次，制备得到免疫亲和吸附剂； (4)装柱:将得到的免疫亲和吸附剂填充到固相萃取柱中，加入PBS缓冲液后自然沉降，得到呕吐毒素免疫亲和柱，4度保存待用。
2.根据权利要求1所述的呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于所述的固相载体为 CNBr-Sepharose 4B。
3.根据权利要求1所述的呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于所述的呕吐毒素单克隆抗体与CNBr-S印harose 4B干粉的质量比为1:80 ;所述的偶联缓冲液为0.1 mol/L NaHC03溶液；溶解CNBr-S印harose 4B干粉的缓冲液为1.0 mmol/L HCL。
4.根据权利要求1所述的呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于所述的封闭缓冲液为0.1 mol/L Tris-HCL (pH 8.0)，以封闭未偶联的活化位点。
5.根据权利要求1所述的呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于其中步骤(3)中所述的醋酸盐缓冲液为0.1 mol/L、pH4.0的醋酸盐缓冲液；所述Tris-HCL缓冲液为0.1mol/L、pH8.0 的 Tris-HCL 缓冲液。
6.呕吐毒素免疫亲和柱可用于谷物及谷物制品检测呕吐毒素残留的前处理方法。
【文档编号】B01D15/38GK103801110SQ201210439205
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月7日 优先权日:2012年11月7日
【发明者】杜道林, 曾昆 申请人:江苏维赛科技生物发展有限公司