专利名称：：黄曲霉毒素免疫亲和柱的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种免疫亲和柱的制备方法，特别是一种黄曲霉毒素免疫亲和柱的制备方法。
背景技术：
：黄曲霉毒素(AFT)是一组真菌的次级代谢毒性产物。在全世界范围内，AFT污染比较严重。1993年AFT被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为I类致癌物。在天然污染的食品和词料中以黄曲霉毒素Bi(AFBi)最为常见，是黄曲霉菌产生毒素中的主要成分，其毒性和致癌性也最强，不仅给社会带来重大的经济损失，而且严重威胁消费者的健康。世界各国及地区均制定了严格的AFT限量标准，且限量要求日益严格。目前黄曲霉毒素的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法、免疫亲和层析柱-高效液相色谱法、免疫亲和层析柱-荧光光度法等。薄层层析法，耗时，需大量接触标准品，不利于操作者的健康及环保，灵敏度低。放射免疫测定法，存在放射线辐射和污染等问题。酶联免疫吸附测定法重复性差，试剂寿命短。高效液相色谱法样品处理烦琐，操作复杂。而免疫亲和层析柱-高效液相色谱法和免疫亲和层析柱-荧光光度法，快速、灵敏、准确，巳被国家标准GB/T18979-2003所采用。因此有必要制备性能稳定、结果可靠的黄曲霉毒素免疫亲和柱。目前制备免疫亲和柱的方法大概有溴化氰，环氧氯丙垸法，过碘酸钠法，蛋白A法等。其中溴化氰偶联效率高，但基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa二10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，可能会出现配体脱落现象，而且溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。环氧氯丙烷法用于偶联大分子时，偶联效率低。蛋白A法用于偶联抗体，可以使抗体的非结合活性区域Fc连接到载体上，更好的保持抗体活性，但蛋白A较贵，用于交联抗体不经济。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种黄曲霉毒素免疫亲和柱的制备方法。为达到上述目的，本发明采用如下反应机理首先用过碘酸钠将黄曲霉毒素抗体Fc端衍生出酰肼；再利用过碘酸钠将固相基质氧化产生醛基，最后将含酰肼的抗体与含醛基的固相基质偶联。具体如下l.酰肼化抗体的制备<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>氧化反应物H-CHO5f3(A)=N—NH—C——(CH2)4—C_NH_NH2ooIIII反应物H=H2N—NH—C—(CH2)4—C—NH—NH22.醛基化固相基质的制备氧化CHO.CHO-CHOCHOCHO(B)3.抗体与固相基质的偶联(A)+(B)还原OOIIIIC=N—NH—C—(CH2)4—C—NH-N二C-根据上述机理，本发明釆用如下技术方案一种黄曲霉毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为a..酰肼化抗体的制备用过碘酸钠将抗体非结合活性区域Fc端羟基氧化成醛基，再与己二酸二酰肼反应，生成酰肼化抗体；b.醛基化固相基质的制备将含有连二醇结构的固相基质用过碘酸钠氧化，得到醛基化的固相基质；C.抗体与固相基质的偶联将步骤a所得酰肼化抗体和步骤b所得醛基化的固相基质混合，振荡反应，待反应结束后，再加入硼氢化钠封闭固相基质上未反应的醛基，得到偶联抗体的固相基质；d.装柱。上述的含有连二醇结构的固相基质有糖类或硅胶。上述的糖类有sepharsoe、sephadex或纤维素。上述的酰肼化抗体的具体步骤为a.将黄曲霉毒素抗体用蒸馏水溶解，再将该抗体溶液对pH5.80.2M磷酸钠缓冲液透析；b.在步骤a所得抗体溶液中按抗体过碘酸钠=1:0.050.2的质量比加入过碘酸钠，室温避光搅拌反应l小时，过SephadexG25分离抗体，得到醛基化的抗体；c.向步骤b所得醛基化的抗体中加入pH5.8的己二酸二酰肼水溶液，加入量为每毫克抗体加入0.52毫克己二酸二酰肼，4'C反应过夜，对0.2M磷酸钠pH5.8透析，即得酰肼化抗体。上述的醛基化固相基质的具体步骤如下将含有连二醇结构的固相基质，用0.5MNaCl淋洗，再用蒸馏水洗涤，抽干；再将该固相基质和过碘酸钠按l:0.10.2的质量比溶于蒸馏水中，室温振荡反应2小时，用0.5MNaCl淋洗，再用蒸馏水、0.2M磷酸钠pH5.8洗涤，抽干，即得醛基化的固相基质。上述的抗体与固相基质的偶联的具体步骤为a.抗体与固相基质的偶联将上述的酰肼化抗体溶液的浓度调整为35mg/ml，加入到上述的醛基化的固相基质中，其用量比为每克醛基化的固相基质加入35毫克酰肼化抗体，4'C振荡反应24小时，依次用蒸馏水、1MNaCl、蒸馏水及0.2MpH7.0磷酸钠缓冲液洗涤，抽干，得到偶联抗体的固相基质；b.将步骤a所得偶联抗体的固相基质和硼氢化钠溶于pH7.0磷酸钠缓冲液中，其用量为每克偶联抗体的固相基质加入412毫克硼氢化钠；4'C振荡反应4小时，依次用蒸馏水、1MNaCl、蒸馏水，0.5MNaCl洗涤,即得到所需的偶联抗体的固相基质。与现有技术相比，本发明抗体偶联方法具有以下显而易见的特点和显著的优点1)将抗体的非结合活性区域FC端定向偶联到固相基质上，更好地保持抗体的活性；2)将抗体衍生上酰肼，而不是固相基质，避免酰肼基团可能带来的非特异性吸附；3)合成好的亲和柱，除偶联抗体外，未引入新基团(如羧基、氨基等)，避免由此可能引起的非特异性吸附。具体实施方式实施例一本发明的一个优选实施例的具体步骤为-1)酰肼化抗体的制备用硫酸胺沉淀腹水(黄曲霉毒素抗体)，离心，去上清，沉淀加蒸馏水溶解，使抗体浓度约大于25mg/ml，对pH5.80.2M磷酸钠缓冲液透析。向抗体溶液中加入十分之一体积的2040mg/ml过碘酸钠水溶液，室温避光搅拌反应1小时，过SephadexG25分离抗体。向上述过碘酸钠氧化抗体加入过量己二酸二酰肼水溶液(pH5.8)(每毫克抗体加入0.52毫克己二酸二酰肼)，4。C反应过夜，对0.2M磷酸钠pH5.8透析。2)醛基化固相基质(Sepharose4B)的制备取适量Sepharose4B抽干，称取15g，用200ml0.5MNaCl淋洗，再用500ml蒸馏水洗涤，抽干。于胶中加入150ml蒸馏水及2g过碘酸钠。室温振荡反应2小时后，用200ml0.5MNaCl淋洗，再用500ml蒸馏水、50ml0.2M磷酸钠pH5.8洗涤，抽干、待用。3)抗体与固相基质的偶联将酰肼化抗体的浓度将抗体浓度调为35mg/ml，加入到上述醛基化Sepharose4B中(每克Sepharose4B加入35毫克酰肼化抗体)，4。C振荡反应24小时，用300ml蒸馏水、300ml1MNaCl、300ml蒸馏水及100ml0.2MpH7.0磷酸钠缓冲液洗涤，抽干。向上述抽干的Sepharose4B中加入20mlpH7.0磷酸钠缓冲液及100mg硼氢化钠，4°C振荡反应4小时，用300ml蒸馏水、300mllMNaCl、300ml蒸馏水，300ml0.5MNaCl洗涤,待用。4)装柱①取lml注射器的注射针管，去除金属针头，酒精灯上烧结，密封出液口，做为亲和柱的下层密封盖。②用下层密封盖，密封注射器的下端出液口，加入适合大小的垫片，用lml枪吸取适量偶联黄曲霉毒素抗体的Sepharose4B悬液注入注射器，加入0.5MNaCl注满注射器，静置使Sepharose4B自然沉降，加入适合大小的垫片。③放开下层密封盖，让溶液自然流出，去除下层空气。④盖上下层密封盖，用0.5MNaCl注满注射器，用一个小塞子将注射针管上端密封，存于4°C。实施例二免疫亲和柱荧光光度法测定黄曲霉毒素在不含AFT的空白样品(加拿大小麦)中，分别添加1、5、20、50ppb黄曲霉毒素混合标准品(AFBi，AFB2，AFG,，AFG2)，样品提取液用实施例一制备的亲和柱纯化，用荧光光度计测定浓度。具体操作方法参照国家标准GB/T18979-2003。结果如下参见表l:表1采用本发明制备的免疫亲和柱和荧光光度法测定黄曲霉毒素的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从以上数据可以看出，在空白样品加拿大小麦中对AFT进行4个水平浓度添加回收率实验，平均回收率82.7~99.3%，变异系数5.3~9.3%，这表明用本发明制备的黄曲霉毒素免疫亲和柱性能稳定、结果可靠，完全可以满足黄曲霉毒素检测的要求。权利要求1.一种黄曲霉毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为a..酰肼化抗体的制备用过碘酸钠将抗体非结合活性区域Fc端羟基氧化成醛基，再与己二酸二酰肼反应，生成酰肼化抗体；b.醛基化固相基质的制备将含有连二醇结构的固相基质用过碘酸钠氧化，得到醛基化的固相基质；c.抗体与固相基质的偶联将步骤a所得酰肼化抗体和步骤b所得醛基化的固相基质混合，振荡反应，待反应结束后，再加入硼氢化钠封闭固相基质上未反应的醛基，得到偶联抗体的固相基质；d.装柱。2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于所述的含有连二醇结构的固相基质有糖类或硅胶。3.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于所述的糖类有sepharsoe、sephadex或纤维素。4.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于所述的酰肼化抗体的具体步骤为a.将黄曲霉毒素抗体用蒸馏水溶解，再将该抗体溶液对pH5.80.2M磷酸钠缓冲液透析；b.在步骤a所得抗体溶液中按抗体过碘酸钠=1:0.050.2的质量比加入过碘酸钠，室温避光搅拌反应l小时，过SephadexG25分离抗体，得到醛基化的抗体；c.向步骤b所得醛基化的抗体中加入pH5.8的己二酸二酰肼水溶液，加入量为每毫克抗体加入0.52毫克己二酸二酰肼，4'C反应过夜，对0.2M磷酸钠pH5.8透析，即得酰肼化抗体。5.根据权利要求1、2或3所述的黄曲霉毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于所述的醛基化固相基质的具体步骤如下将含有连二醇结构的固相基质，用0.5MNaCl淋洗，再用蒸馏水洗涤，抽干；再将该固相基质和过碘酸钠按1:0.10.2的质量比溶于蒸馏水中，室温振荡反应2小时，用0.5MNaCl淋洗，再用蒸馏水、0.2M磷酸钠pH5.8洗涤，抽干，即得醛基化的固相基质。6.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于所述的抗体与固相基质的偶联的具体步骤为a.抗体与固相基质的偶联将上述的酰肼化抗体溶液的浓度调整为35mg/ml，加入到上述的醛基化的固相基质中，其用量比为每克酸基化的固相基质加入35毫克酰肼化抗体，4'C振荡反应24小时，依次用蒸馏水、1MNaCl、蒸馏水及0.2MpH7.0磷酸钠缓冲液洗涤，抽干，得到偶联抗体的固相基质；b.将步骤a所得偶联抗体的固相基质和硼氢化钠溶于pH7.0磷酸钠缓冲液中，其用量为每克偶联抗体的固相基质加入412毫克硼氢化钠；4'C振荡反应4小时，依次用蒸馏水、1MNaCl、蒸馏水，0.5MNaCl洗涤，即得到所需的偶联抗体的固相基质。全文摘要本发明涉及一种黄曲霉毒素免疫亲和柱的制备方法。该方法的具体步骤为酰肼化抗体的制备用过碘酸钠将抗体非结合活性区域Fc端羟基氧化成醛基，再与己二酸二酰肼反应，生成酰肼化抗体；醛基化固相基质的制备将含有连二醇结构的固相基质用过碘酸钠氧化，得到醛基化的固相基质；抗体与固相基质的偶联将酰肼化抗体和醛基化的固相基质混合，振荡反应，待反应结束后，再加入硼氢化钠封闭固相基质上未反应的醛基，得到偶联抗体的固相基质；装柱。本发明将抗体的非结合活性区域Fc端定向偶联到固相基质上，更好地保持抗体的活性；将抗体衍生上酰肼，而不是固相基质，避免酰肼基团可能带来的非特异性吸附；合成好的亲和柱，除偶联抗体外，未引入新基团(如羧基、氨基等)，避免由此可能引起的非特异性吸附。文档编号G01N33/531GK101241128SQ200810034739公开日2008年8月13日申请日期2008年3月18日优先权日2008年3月18日发明者戴小峰,沈彦萍,田汉莉,陈宇光,鸣顾,黎双华申请人:上海大学