一种蛋白a免疫亲和柱的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物分离材料技术领域，更具体地，涉及一种蛋白A免疫亲和柱的制备 方法。
【背景技术】
[0002] 抗体是生物医药领域的中流砥柱。1986年，美国食品与药品管理局(FDA)批准上市 了第一个抗体药Orthoclone 0KT3用于治疗移植物抗宿主病(GVHD)，翻开了生物医药历史 崭新的一页。2003年，市场对单克隆抗体的需求量为几克到几千克不等，约占生物药品的 20%(Journal of Chromatography B，2007,848(l) :97_107)。2015年，超过25种抗体药物被 FDA批准用于治疗人类的疾病，临床试验近千例（Journal of Chromatography B，2015， 983-984:26-31)。开发工艺简便、适于大规模生产的抗体纯化材料成为生物医药领域的研 究热点之一。
[0003] 由于硅胶具有耐高压、耐高流速和性质稳定等优点，二十世纪七八十年代，研究者 采用无定型硅胶或无孔硅胶开发键合蛋白A材料（美国发明专利4681870 ; Journal of Immunological Methods，1987,101(2):209-217;Artificial Organs，1989,13(1):71-77; Journal of Chromatography A，1989，476: 195-203)，IMRE Corporation开发的商品柱 PR0S0RBA? columns (Seattle，WA)在临床得到应用，但普遍存在蛋白A偶联量低、抗体结合 能力差(0.1~5 mg)和效率低等不足。1990年，Kuroda等首次报道孔径为2~50 nm的介孔硅胶 (Bull Chem,1990, 63：988-992；Journal of the Chemical Society, Chemical Communications，1993，8:680-682)。介孔硅胶具有很高的比表面积和大的孔体积，传质扩 散性能优良，在蛋白A复合材料制备及纯化生物大分子和抗体中得到良好的应用(Journal of Chromatography A,2007,1161(1-2)：36~40；Journal of Materials Chemistry,2009, 19(14):2013;Analytical Biochemistry，2011，409(l):123-129)〇
[0004] 将蛋白A偶联到硅胶基质的文献方法主要有：卤代烷烃偶联法（Journal of Chromatography A，2007，11 6 1 ( 1 _2 ) : 36-40 )、戊二酉签偶耳关法（Journa 1 of Chromatographic Science，2011，49(2):148-153)、席夫喊偶联法（Analytical Biochemistry，2010，406(2) : 235-237)和琥泊酰亚胺偶联法(Analytical Biochemistry， 2011,409(1):123-129)等。它们各具特色，又有不足，如反应步骤复杂、条件苛刻、或反应时 间长，以及在柱外进行蛋白A偶联再转移装柱，不利于规模化生产，更为重要的是，复杂的反 应步骤和繁琐的操作可能导致蛋白A变性失活，降低经济效益。
[0005] 1，1' -羰基二咪唑较多应用在蛋白质的固定中，偶联反应的效率高，反应时间短 (Journal of Biological Chemistry, 1979，254(8):2572;Journal of Separation Science,2013,36(8)： 1343-1348；Chinese Journal of Analytical Chemistry,2012,40 (1) : 89-94;)。中国发明专利200610123710.9公开了一种为羰基二咪唑偶联法合成琼脂糖 基的蛋白A亲合柱;Bencina等用羰基二咪唑偶联法将蛋白A结合到甲基丙稀酸酯整体柱上， 蛋白A的偶联量远高于其它方法（Journal of Separation Science，2004,27(10_ll) :811- 818)。然而，尚未见以1，Γ -羰基二咪唑为偶联剂，柱上衍生法将蛋白Α固定到多孔硅胶的 报道。
【发明内容】
[0006] 本发明根据目前蛋白A免疫亲和柱生产周期长、反应条件苛刻、转移操作繁琐、难 以实现连续化、以及单位蛋白A纯化抗体量低等不足，提供了一种蛋白A免疫亲和柱的制备 方法。
[0007] 本发明的技术目的通过以下技术方案实现： 本发明提供了一种蛋白A免疫亲和柱的制备方法，包括如下步骤： 51. 将多孔硅胶与3-三氨丙基三乙氧基硅烷得到改性硅胶； 52. 将S1中所得改性硅胶装柱，利用1，1'_羰基二咪唑(CDI)作为偶联剂，在柱内与蛋 白Α发生偶联反应，即得所述蛋白Α免疫亲和柱； 所述S1中硅胶的粒径为40 μL?，孔径为100 nm; 所述S2中蛋白A的偶联浓度按改性硅胶质量计为10.0~75.0 mg/g。
[0008] 本发明所述路线如下所示：
载体的孔隙是配体向待分离大分子接近的运动通道，对吸附材料的亲和能力有很大影 响，并且这一影响与配体分子及待分离大分子的大小有关，因而亲和吸附材料基质的孔径 选择极为重要。其适中的比表面积和较大的孔径尺寸的有利于蛋白A结构的舒展和抗体分 子自由进出孔道内，大大降低传质阻碍，达到较高的吸附能力。
[0009] 本发明人发现，当硅胶孔径为40 μπι，粒径为100nm时，较其它孔粒径的硅胶能获得 更好的效果。
[0010] 另外，本发明人发现蛋白A的偶联浓度会影响蛋白A的偶联量和免疫亲和柱纯化抗 体的能力。
[0011]因此，只有在载体孔径和粒径合适的前提下，采用适当浓度的蛋白A与改性硅胶发 生偶联，才能获得抗体纯化的最佳效果。
[0012]所述S2中蛋白A的加入量在20.0~50.0 mg/g范围（按改性硅胶质量计）。本申请 人发现在上述蛋白A的量在20.0~50.0 mg/g(按改性硅胶质量计)范围内，其偶联量较10~75 mg/g(按改性硅胶质量计)范围内蛋白A的偶联量、覆盖率和结合兔IgG量均有提升。
[0013]更优选地，所述S2中蛋白A的量在30.0~50.0 mg/g的范围（按改性硅胶质量计）。即 在该条件下，蛋白A在改性硅胶上的偶联量、覆盖率和结合兔IgG量进一步提升。
[0014]更优选地，所述S2中蛋白A的量为40.0 mg/g (按改性硅胶质量计）。
[0015] 本发明以1，Γ -羰基二咪唑为偶联剂，柱上衍生法将蛋白A偶联到多孔硅胶基质； 在优化的蛋白A初始条件下进行生产，蛋白A免疫亲和柱能在较高的流速下纯化抗体，效率 显者提尚。
[0016] 通过本发明提供的蛋白A免疫亲和柱，在硅胶粒径为40 μπι，孔径为100 nm，蛋白A 的加入量为40 mg/g(按改性硅胶质量计），所述亲和柱表面覆盖率30.1 nmol/m2,兔IgG的 结合量达到27.4 mg/g(按改性硅胶质量计），洗脱液中兔IgG纯度为92%~95%，说明本发明制 备的蛋白A免疫亲和柱具有优异的偶联和纯化抗体效果，应用前景良好。
[0017] 优选地，所述S1中硅胶与3-氨丙基三乙氧基硅烷反应的质量体积比为1: 1.5;所 述s 1中溶剂为甲苯，所述反应在氮气保护下回流反应，所述反应时间为4 h。
[0018] 优选地，所述S2中改性硅胶以乙腈-异丙醇的混合液为匀浆液、甲醇为顶替液进行 装柱，所述乙腈与异丙醇的体积比为1: 1。
[0019]优选地，所述S2中以乙腈冲改性硅胶柱5~15 min，然后以1，Γ -羰基二咪唑的乙腈 溶液循环冲柱5~30 min，再以溶有蛋白A的磷酸缓冲盐溶液(PBS)循环冲柱20~40 min，最后 使用pH 7.0、50 mM的PBS溶液循环冲柱5~15 min;所述溶解蛋白A的PBS溶液的pH为7.0,摩 尔浓度为10 mM; 所述S2中所述1，Γ-羰基二咪唑的质量与乙腈的体积比为1:30。
[0020] 同现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明通过选用粒径与孔径合适的多孔硅胶基质填柱，有利于蛋白A与抗体分子的结 合作用，降低了传质阻碍，提高了蛋白A免疫亲和柱耐受高压和高流速的性能，有利于实现 大规模的抗体纯化。采用羰基咪唑偶联法柱上键合蛋白A，制备工艺简便、连续，条件温和， 减少了合成过程中的转移操作，有利于保持配体活性和实现蛋白A免疫亲和材料的连续化 生产。对蛋白A的偶联浓度进行了优化，有利于提高昂贵的蛋白A的利用率，节约成本。
【附图说明】
[0021] 图1为实施例8中蛋白A的HPLC谱图； 图2为实施例8中蛋白A的浓度与HPLC色谱峰间的关系图； 图3为实施例8中IgG的浓度与其在280 nm处的吸光度值间的关系图； 图4为用施例5中的蛋白A亲和柱提纯的IgG电泳图； 图5为用实施例1和实施例7中的蛋白A亲和柱提纯的IgG电泳图。
【具体实施方式】
[0022] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对 本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员 可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。
[0023] 除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设 备。
[0024] 实施例1在含有40.0 g多孔硅胶(粒径40 μL?，孔径10 nm)的无水甲苯溶液中加入 60.0 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，氮气保护加热反应4h，索式洗涤后真空干燥得到氨基改 性的硅胶（即改性硅胶）。以体积比1:1的乙腈-异丙醇混合液为匀浆液、甲醇为顶替液，在14 MPa压力下将2.0 g改性硅胶装填入不锈钢柱管内。然后，将装填硅胶的不锈钢柱连接到液 相栗上，先以乙腈冲柱10 min，接着以2.0 g 1，Γ-羰基二咪唑的60 mL乙腈溶液循环冲柱 15 min，再以溶有40.0 mg蛋白A的10 mL PBS溶液(pH 7.0,10 mM)循环冲柱30 min，继续 以10 mL PBS溶液(pH 7.0,50 mM)循环冲柱lOmin洗除未键合的蛋白A，4°C保存。
[0025] 实施例2在含有40.0 g多孔硅胶(粒径40 μπι，孔径100 nm)的无水甲苯溶液中加 入60.0 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，氮气保护加热反应4h，索式洗涤后真空干燥得到氨基 改性的硅胶（即改性硅胶）。以体积比1:1的乙腈-异丙醇混合液为匀浆液、甲醇为顶替液，在 14 MPa压力下将2.0 g改性硅胶装填入不锈钢柱管内。然后，将装填硅胶的不锈钢柱连接到 液相栗上，先以乙腈冲柱10 min，接着以2.0 g 1，1'_羰基二咪唑的60 mL乙腈溶液循环冲 柱15 min，再以溶有40.0 mg蛋白A的10 mL PBS溶液(pH 7.0，10 mM)循环冲柱30 min，继 续以10 mL PBS溶液(pH 7.0,50 mM)循环冲柱lOmin洗除未键合的蛋