检测粉尘螨过敏原特异性IgE抗体的试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医疗器械生物类免疫体外诊断领域，特别是涉及一种检测粉尘螨过敏 原特异性IgE抗体的试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] IgE抗体介导的I型过敏反应性疾病相当普遍，世界各国变态反应疾病的总发病 率约为15%_30%，我国大约有5-10%的人受过敏原的袭扰，是当前世界性的重大卫生学问 题，被世界卫生组织（WHO)列为二十一世纪重点防治的三大疾病之一。
[0003] 过敏性疾病是患者吸入、摄食入或者注入含有致敏成分的物质（称为过敏原或变 应原，Allergen)后触发机体的B细胞产生特异性免疫球蛋白E(Immunoglobulin E, IgE)， 从而引发过敏反应(或称变态反应，Allergy)的疾病及相关症状，如过敏性哮喘、枯草热、荨 麻疹、过敏性鼻炎、湿疹、结膜炎及胃肠道I型过敏性疾病及严重过敏反应等。上述过敏性 疾病的发生，IgE抗体起关键作用。
[0004] 粉尘螨中重要的致敏蛋白组分为Der Π和Der f2。尘螨既有共同的过敏原组分， 也有种属特异性的过敏原组分。螨的一些致敏蛋白组分与无脊椎动物具有广泛的交叉反应 性。
[0005] 在国内，粉尘螨过敏原特异性IgE抗体（D2)检测临床上主要以国外进口试剂和免 疫组化试剂应用为主，国外进口试剂价格非常昂贵，给患者带来很大的经济负担，不利于在 基层普及。具有自主知识产权的国产粉尘螨过敏原特异性IgE抗体（D2)免疫化学发光检 测试剂盒目前还没有。
[0006] 因此，有待开发对粉尘螨过敏原特异性IgE抗体（D2)检测灵敏度高与可靠性并能 降低检测成本的检测技术。
【发明内容】
[0007] 本发明主要解决的技术问题是提供一种检测粉尘螨过敏原特异性IgE抗体的试 剂盒及方法，该试剂盒性能可靠，灵敏度高，线性范围宽，可配合全自动仪器使用，能提高检 测灵敏度及可靠性，并降低成本，延长有效期。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种粉尘螨过敏原特 异性IgE抗体的试剂盒，包括的试剂有：校准品、质控品、生物素标记的粉尘螨过敏原溶液、 碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗溶液、链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液。
[0009] 在本发明一个较佳实施例中，所述生物素标记的粉尘螨过敏原溶液的浓度为 0. 1~1. 0 ug/ml ;所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的浓度为0. 1~1. 0 mg/ml ;所述 碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗溶液的浓度为0. 1~2. 0 ug/ml。
[0010] 在本发明一个较佳实施例中，所述校准品的浓度为：0 IU/ml、0. 35 IU/ml、0. 7 IU/ml、3.5 IU/ml、17.5 IU/ml、50 IU/ml、100 IU/ml，所述校准品是 IgE 蛋白与 0·1Μ、ρΗ值 为7. 4的Tris-HCl缓冲液配制得到的；所述质控品的浓度为：0. 7 IU/ml、17. 5 IU/ml，所述 质控品是IgE蛋白与0. 1M、pH值为7. 4的Tris-HCl缓冲液配制得到的。
[0011] 在本发明一个较佳实施例中，所述粉尘螨过敏原为能与人体内粉尘螨特异性IgE 蛋白结合的抗原，所述生物素标记的粉尘螨过敏原溶液的制备过程为：将粉尘螨过敏原按 1:20摩尔比加入到溶于二甲基甲酰胺的生物素中，再用0. 1Μ、ρΗ值为7. 4的磷酸盐缓冲液 透析得到。
[0012] 在本发明一个较佳实施例中，所述标记的鼠抗人IgE二抗为能与人体内IgE蛋 白特异结合的抗体，所述碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗溶液的制备过程为：将浓度为 1. 0-5. Omg/mL的碱性磷酸酶溶液与鼠抗人IgE二抗按摩尔比为2-10 :1进行混合后并纯 化，得到碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗，所述纯化是用pH为8-9的碳酸氢盐缓冲液平 衡并洗脱，再紫外检测和记录纯化图谱，再用〇. 05M、pH值为6. 0的MES缓冲液对碱性磷酸 酶标记的鼠抗人IgE抗体稀释。
[0013] 在本发明一个较佳实施例中，所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的制备过 程为：将链霉亲和素标记的纳米磁微粒用磁分离器沉淀，再用0. 01M、pH值为7. 4的磷酸盐 缓冲液重悬，混匀磁分离沉淀，并重复清洗，清洗后的纳米磁微粒分散于〇. 〇1Μ、ρΗ值为7. 4 的磷酸盐缓冲液。
[0014] 提供一种纳米磁微粒化学发光法定量检测血清粉尘螨过敏原特异性IgE抗体的 方法，包括步骤为： (1) 将磁微粒试剂、生物素标记的粉尘螨过敏原和待检样本混匀并反应，反应后置于磁 场中静置并去上清，得到第一溶液； (2) 向所述第一溶液中加入碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗混匀并反应，反应后置 于磁场中静置并去上清，得到第二溶液； (3) 向所述第二溶液中加入发光底物并反应，测发光强度； (4) 利用已知浓度的校准品绘制发光强度标准曲线，根据步骤（3)得到的发光强度对照 所述标准曲线，计算得出待测血清样本中粉尘螨特异性IgE的含量。
[0015] 在本发明一个较佳实施例中，步骤（1)中所述反应的条件为37°C下反应15分钟， 所述静置的时间为3分钟；步骤（1)中还包括对所述第一溶液用清洗液进行清洗，置于磁场 中静置并去上清，清洗重复2次；步骤（2)中所述反应的条件为37°C下反应15分钟，所述静 置的时间为3分钟；步骤（2)中还包括对所述第二溶液用清洗液进行清洗，置于磁场中静置 并去上清，清洗重复2次；步骤（3)中所述反应的条件为37°C下反应5分钟，在化学发光分 析/测定仪中测定发光强度。
[0016] 在本发明一个较佳实施例中，所述方法在全自动化学发光仪Lumiray系列上进 行，所述 Lumiray 系列为 Lumiray 1200、Lumiray 1220、Lumiray 1260 或 Lumiray 1280。
[0017] 在本发明一个较佳实施例中，所述方法包括步骤为： (1) 将所述试剂盒放入全自动化学发光仪的试剂仓里并进行识别； (2) 将校准品置于所述全自动化学发光仪的仪器样本仓，识别校准品信息，分配校准品 位置； (3) 将质控物或待测样本置于仪器样本仓，编辑检测信息； (4) 启动运行程序，所有校准品/质控物/待测样本自动进行处理得到结果。
[0018] 本发明的有益效果是：本发明的检测粉尘螨过敏原特异性IgE抗体的试剂盒及方 法，试剂盒中各试剂组分稳定性良好，有效期可至一年以上，检测灵敏度高、特异性能好、变 异小。经过大量实验的工艺优化，得到完善统一工艺，并严格按照标准生产操作规程和质量 控制规程进行生产。用户仅需按照操作说明进行规范操作，就可得到可靠的结果。在临床 研究中与国外进口试剂的符合相关性高达90 %以上，且费用仅为其1/2。
【附图说明】
[0019] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它 的附图，其中： 图1是本发明的实施例一中检测粉尘螨过敏原特异性IgE抗体（D2)的试剂盒的标准 曲线图； 图2是本发明的粉尘螨过敏原特异性IgE抗体（D2)检测试剂盒与进口试剂的性能对 比图。
【具体实施方式】
[0020] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0021] 实施例一： 提供一种基于纳米磁微粒全自动化学发光法定量检测粉尘螨过敏原特异性IgE抗体 (D2)的试剂盒，包括如下试剂： (1) 生物素标记的粉尘螨过敏原溶液，浓度为0. 1-1. 0 ug/mL ; (2) 链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液，浓度为0. 1-1. 0 mg/mL ; (3) 碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗溶液，浓度为0. 1-2. 0 ug/mL ; (4) 6个不同浓度水平的校准品：0 11]/1111，0.35 11]/1111，0.7 11]/1111，3.5 11]/1111，17.5 IU/ml,50 IU/ml,100 IU/ml ； (5) 2个不同浓度水平的质控品：0. 7 IU/ml，17. 5 IU/ml。
[0022] 实施例二： 本发明提供的一种纳米磁微粒全自动化学发光法定量检测血清粉尘螨过敏原特异性 IgE抗体试剂盒的制备包括如下步骤： (1)配制缓冲液： 配制(λ 01M、pH值为L 4的磷酸盐缓冲液，(λ 1Μ、ρΗ值为L 4的Tris-HCl缓冲液，(λ 05M、 pH值为6. 0的MES缓冲液。
[0023] 0· 01M、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液的配制：取容量1L的烧杯，加入800ml去离子 水，称取2. 56g Na2HP04*12H20、0. 44g NaH2P04*2H20和9g NaCl，加入到烧杯中，搅拌使其充 分溶解，用HC1或NaOH调节pH值至7. 4 ±0. 05,加入质量分数为2%的甘露醇、质量分数为 1%的甘油，搅拌0. 5h至完全溶解，加去离子水定容至1L。
[0024] 0· 1M、pH值为7· 4的Tris-HCl缓冲液的配制：取容量1L的烧杯，加入800ml去 离子水，称取12. llg Tris (三羟甲基氨基甲烷）加入到烧杯中，搅拌使其充分溶解，用HC1 或NaOH调节pH值至7. 4±0. 05,加入质量分数为2%的BSA、质量分数为0. 3%的Proclin 300,搅拌0. 5h至完全溶解，加去离子水定容至1L。
[0025] 0· 05M、pH值为6. 0的MES缓冲液的配制：取容量1L的烧杯，加入800ml去离子水， 称取9. 76g MES(2-(N-吗啉代）乙磺酸)、9g NaCl加入到烧杯中，搅拌使其充分溶液，用HC1 或NaOH调节pH值至6. 0±0. 05,加入质量分数为1%的BSA、质量分数为0. 1%的Tween-20， 搅拌0. 5h至完全溶解，加去离子水定容至1L。
[0026] (2)制备生物素标记的粉尘螨过敏原溶液 将粉尘螨过敏原以1:20的比例加入到溶于二甲基甲酰胺的生物素中，室温条件下充 分混合反应30分钟，反应后的溶液用0. 1M、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液透析。BCA法测定 生物素标记的粉尘螨过敏原溶液的浓度，并调整其浓度到〇. 1-1. 〇 ug/ml。
[0027] (3)制备链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液 将链霉亲和素标记的纳米磁微粒用磁分离器沉淀出来，用〇. 〇1Μ、ρΗ值为7. 4的磷酸盐 缓冲液重悬，充分混匀15分钟后磁分离沉出，弃去上清，再用0. 01M、pH值为7. 4的磷酸盐 缓冲液重悬，如此重复清洗5次，清洗后的纳米磁微粒分散于0. 01M、