专利名称：荞麦过敏原及其IgE试剂盒以及它们的制备和使用方法
技术领域：
本发明涉及试剂盒，具体属于一种荞麦过敏原IgE试剂盒及其制备和使用方法。 技术背景食物过敏已成为食品卫生工作中的热点问题之一。全球范围内约有2%的成年人和4 6。/。 的儿童患有食物过敏症。 一旦发生，后果相当严重，芙国有近500万人患食物过敏，每年发生 950例，死亡10-20人。据不完全统计，我国每年仅在协和医院门诊就医的食物过敏患者就达 1.5万人，发生过因食入一粒花生米而致死的就有数起。在巴黎食物过敏大会上，有关专家指 出，食物过敏会对儿童健康及其今后发展产生不利影响。儿童时期可能出现的过敏形式有皮肤 过敏、食物过敏和哮喘等。发病时间越早，过敏现象可能越重，且历时越长，甚至持续到成年， 这对儿童的未来发展不利。目前，我国对于食品过敏，还没有引起足够的重视，与国外发达国 家(日本，韩国等)相比也有很大的差距，这对于我国全体国民的身体健康构成了很大的威胁。荞麦属双子叶蓼科植物，有2个栽培种，即甜荞(普通荞麦)和苦荞(鞑靼荞麦)。全球荞麦 种植面积700 800万公顷，总产量500 600万吨，主要生产国有俄罗斯、中国、波兰、法国、 加拿大、日本、韩国等。近年来农业、医学及食品营养学等方面的研究表明，荞麦特别是苦荞 麦，其营养价值居所有粮食作物之首，不仅营养成分丰富、营养价值高，而且含有其它粮食作 物所缺乏和不具有的特种微量元素及药用成分，这些物质对现代"文明病"及几乎所有中老年 心脑血管疾病有预防和治疗功能，近年还被公认为预防癌症的保健食品，因而受到各国的重视。 目前荞麦保健食品已风靡全球，荞麦生产和保健食品开发呈现新的发展势头，荞麦在世界贸易 中的地位也正在提高，尤其在闩本有很大的消费潜力，因此荞麦被称为用途广泛的21世纪型 作物。近年来关于荞麦过敏的报道逐年增多，很多人食用养麦后会产生哮喘、休克和皮疹等过敏 症状。荞麦过敏己受到社会各界的普遍关注。这也成为荞麦利用的一个瓶颈。在日本，己经把 荞麦列为五大过敏原之一，其病理机制为I型过敏反应，而且是由IgE介导的速发反应。国内 关于荞麦过敏的研究较少，现阶段大部分报道都来自国外。有关荞麦过敏原，目前美国有用于 临床检测的产品，但其属于一种24kD荞麦过敏原，它的检测范围较窄，对于一些荞麦过敏的 病例易造成漏检。发明内容本发明的目的是提供一种荞麦过敏原，以及含有该荞麦过敏原的IgE检测试剂盒，以及该 荞麦过敏原及其试剂盒的制备和使用方法。该荞麦过敏原及其试剂盒具有检测范围宽，灵敏度
高，可实现大规模检测的特点。本发明提供的一种荞麦过敏原，来源于荞麦，其分子量为56kD，属于13S贮藏蛋白家族。 所述的荞麦过敏原通过如下方法制得首先将荞麦去壳粉碎，脱脂；然后按每克脱脂荞麦 粉加入10-15mlpH8.0的稀盐缓冲液，4'C搅拌过夜；离心，除去沉淀，将上清调节pH到5.0, 加入(NH4)2SO4至80。/。饱和度，4'C搅拌30-60分钟，离心，收集沉淀；将沉淀用少量稀盐缓冲液重新溶解，并用同样缓冲液对样品进行透析，除去(NH4)2S04，得到荞麦盐溶蛋白的粗提物; 将粗提物先用阴离子交换柱分离纯化，再用凝胶柱分离纯化；收集活性峰，蒸馏水透析后，真 空冷冻干燥，得到分子量为56kD的荞麦过敏原。 所述的荞麦是苦荞麦或甜荞麦；所述的稀盐缓冲液是Tris-HCl缓冲液(10mmol/LTris和150mmol/LNaCl); 所述的阴离子交换柱可以是Resource Q阴离子交换柱，凝胶柱可以是Sephacryl S-200凝胶柱。本发明提供的一种荞麦过敏原IgE试剂盒，是一种用间接酶联免疫吸附试验检测荞麦过敏 的IgE检测试剂盒，该试剂盒采用了上述得到的分子量为56kD的荞麦过敏原。其具体包括已预包被荞麦过敏原的酶标板8X12孑L样品稀释液10ral阳性血清0.5ml阴性血清0.5ml酶结合物10ml浓縮洗涤液20ml显色剂A2mg显色剂B5ml终止液5ml其中，所述的样品稀释液为0.01 mol/L PBST, pH7.4，酶结合物为辣根过氧化物酶标记的 鼠抗人IgE酶结合物，浓縮洗涤液为含0.05。/。Tween-20的生理盐水，显色剂A为邻苯二胺， 显色剂B为H202，终止液为lmol/LH2S04溶液。本发明荞麦过敏原IgE试剂盒的制备方法，是采用荞麦过敏蛋白包被酶标板(聚苯乙烯微 孔板)，以鼠抗人IgE标记辣根过氧化物酶(简称HRP)制备而成，包括如下歩骤A:荞麦过敏原酶标板的制备将荞麦过敏原用pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液包被 用浓度为1%的明胶封闭；用浓度为20%的蔗糖室温保护3小时，干燥后，装入含干燥剂的 包装中保存；B:样品稀释液的制备将8gNaCl， 0.2gKH2PO4,2.9gNa2HPO4.12H2O,0.5mlTween-20加蒸馏水至1000ml配制而成；C:鼠抗人IgE酶结合物的制备用市售的鼠抗人IgE酶结合物，用样品稀释液稀释1000倍；D:阳性血清和阴性血清的制备阳性血清取自荞麦过敏病人，阴性血清血清取自健康人 血清；E:浓縮洗涤液的制备将170gNaCl用1000ml蒸馏水配成浓縮洗涤液；F:显色剂A的制备取试剂邻苯二胺；G:显色剂B的制备取610ml 0.1 mol/L柠檬酸，640ml 0.2 mol/L Na2HP04.12 H20,加入 1250ml蒸馏水和4 ml H202;H:终止液的制备lmol/LH2S04溶液。本发明提供的荞麦过敏原IgE试剂盒的使用方法，包括如下步骤A:取出酶标板，在室温下平衡10分钟，每孔各加95^il样品稀释液，再加5pl待检标本 血清，同时设空白对照(只加10(V1样品稀释液)，阴性对照(加100pl，不加样品稀释液)， 阳性对照(加lOOpl，不加样品稀释液)，37。C水浴作用0. 5-1. 5小时；B:将浓縮洗涤液用蒸馏水稀释为20倍的稀释洗涤液；C:用稀释洗涤液洗涤酶标板3次，最后一次倒扣于吸水纸上，使里面的液体充分流尽； D:每孔加lOOpl酶结合物，37'C水浴作用0.5-1.5小时；E:用稀释洗涤液洗涤3次，最后一次倒扣于吸水纸上，使里面的液体充分流尽； F:将显色剂A和显色剂B混合，每孔加入lOOpl混合物，暗处反应10-30分钟； H:每孔加入一滴终止液； G:在492nm处测定其光吸收值。与现有技术相比本发明的优点和效果1、制备获得荞麦中的一个56kDa过敏原，较目前 临床检测中使用的过敏原有较宽的检测范围；2、该过敏原与荞麦过敏病人血清中的IgE具有 特异性的结合活性，可用于临床检测及荞麦过敏症的早期诊断，也适合作流行病学调査；3、 以明胶作为惰性蛋白，提高了灵敏度，同时本底没有明显增加；4、检测时间短， 一般2个小 时内即可检出结果；5、样品无需无菌化处理，操作简单易行；6、检测成本低廉，可以进行大 批量检测，适于推广使用。
图1:荞麦过敏原制备流程2: SDS-PAGE检测荞麦过敏原纯度，泳道1为分子量Marker;泳道2为纯化的荞麦 过敏原。
具体实施方案实施例/:荞麦过敏原的制备制备流程见图1，首先将苦荞麦(Tartary buckwheat)去壳 粉碎，按每克蛋白加入3ml丙酮，4'C搅拌3小时，真空抽虑除去丙酮，然后加入等体积的无 水乙醚，真空抽虑除去乙醚，风干得到脱脂的荞麦粉；然后按每克蛋白加入10ml Tris-HCl缓 冲液(10mmol/LTris和150mmol/LNaCl pH8.0)， 4。C搅拌过夜；3000r/m离心10分钟，除去沉淀， 将上清调节pH到5.0，加入(NH4)2SO4至80。/。饱和度，13000r/m离心30分钟，除去上清，用 尽量少的Tris-HCl缓冲液将沉淀重新溶解。用Tris-HCl缓冲液对样品进行透析，以除去 (NH4)2S04,得到荞麦盐溶蛋白的粗提物。将粗提物上样到Resource Q阴离子交换柱，在 AKTATMPurifer上进行分离纯化，所用的平衡缓冲液为20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.3)，洗 脱液为20mmol/L Tris-HCl缓冲液(0.5mol/LNaCl， pH7.3)，收集有活性的洗脱峰然后上样到 Sephacryl S-200凝胶柱进行进一步纯化，所用缓冲液为20mmol/L Tris-HCl (150mmol/L NaCl， pH7.3)。收集活性峰，蒸馏水透析后，真空冷冻干燥，得到荞麦过敏原产品。用非还原SDS-PAGE 检测过敏原的纯度，结果见图2。实施例2、实验材料取甜荞麦(Commonbuckwheat)，实验步骤和条件同实施例1，同样 得到分子量为56kD的荞麦过敏原。实施例j、荞麦过敏原IgE试剂盒制备1、 抗原预包被酶标板的制备a. 包被将实施例1得到的分子量为56kD的荞麦过敏原，用抗原包被液(0.05moI/L碳 酸盐缓冲液，pH9.6 )稀释成lOOpg/ml,包被酶标板，每孔lOOpl， 4 'C过夜，倒掉包被液， 甩干；b. 封闭每孔加含1%的明胶的封闭液4 'C过夜，倒掉封闭液，甩干；c. 干燥加入20%的蔗糖室温保护3小时，至干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装中保存'-2、 酶结合物的制备采用商品化的酶结合物，用样品稀释液稀释IOOO倍使用。3、 其他试剂的制备样品稀释液的制备将NaC18g， KH2P04 0.2g, Na2HP04 .12H20 2.9 g, Tween-20 0.5 ml 加蒸馏水至1000ml配制而成。浓缩洗涤液的制备将NaCl 170g, 10ml,蒸馏水1000ml配成20*生理盐水浓縮洗涤液。 显色剂A的制备取邻苯二胺试剂。显色剂B的制备取610ml， O.lmol/L柠檬酸(2.1gA00ml)， 640ml 0.2mol/LNa2HPO4.12 H20 (7.163g/100ml),加入1250ml蒸馏水,加入4 ml H202 。终止液的制备所述终止液为用蒸馏水稀释后的硫酸，浓度为lmol/LH2S04。 4、试剂盒的组装按每盒一包96孔/包的抗原预包被酶标板， 一瓶洗涤液(20ml), —瓶 样品稀释液(10ml)， 一瓶酶结合物工作液(10ml)， 一瓶显色剂A(2mg)， 一瓶显色剂B(5ml)， 一 瓶阳性对照(0.5ml)， 一瓶阴性对照(0.5ml)和一份使用说明书组装。将试剂盒置于4'C条件下 保存备用。实施例么荞麦过敏原IgE试剂盒的使用取待检标本l、 2、 3检测其是否对荞麦过敏，按如下方法检测A:取出酶标板，在室温下平衡10分钟，每孔各加95pl样品稀释液，再加5pl待检标本 血清，同时设空白对照(只加100pl样品稀释液)，阴性对照(加100nl，不加样品稀释液)， 阳性对照(加100pl，不加样品稀释液)，37'C水浴作用1小时；B:将浓縮洗涤液用蒸馏水稀释为20倍的稀释洗涤液；C:用稀释洗漆液洗漆酶标板3次，最后一次倒扣于吸水纸上，使里面的液体充分流尽；D:每孔加10(^1酶结合物，37'C水浴作用40分钟；E:用稀释洗涤液洗涤3次，最后一次倒扣于吸水纸上，使里面的液体充分流尽； F:将显色剂A和显色剂B混合，每孔加入10(^1混合物，暗处反应20分钟； H:每孔加入一滴终止液；G:在492nm处测定其光吸收值，检测结果及分析血清号空白对照阴性对照阳性对照待检标本1待检标本2待检标本3OD值0.0370.0490.7500.0511.0790.669P/N--59.41.1586.852.7结果判定P/N=(标本OD值-空白对照OD值)/ (阴性对照OD值-空白对照OD值)，以 P/N》2. 1为阳性，P/N<1. 5为阴性。经计算标本1的P/N值小于1. 5,而标本2和标本3 P/N 值
权利要求
1.一种荞麦过敏原，特征在于它是分子量为56kD的荞麦过敏原。
2. 如权利要求1所述的荞麦过敏原的制备方法，其特征在于包括如下步骤首先将荞麦 去壳粉碎，脱脂；然后按每克脱脂荞麦粉加入10-15mlpH8.0的稀盐缓冲液，4'C搅拌过夜； 离心，除去沉淀，将上清调节pH到5.0，加入(NH4)2SO4至80。/。饱和度，4'C搅拌30-60分钟， 离心，收集沉淀；将沉淀用少量稀盐缓冲液重新溶解，并用同样缓冲液对样品进行透析，除 去(NH4)2S04，得到荞麦盐溶蛋白的粗提物；将粗提物先用阴离子交换柱分离纯化，再用凝胶 柱分离纯化；收集活性峰，蒸馏水透析后，真空冷冻干燥，得到分子量为56kD的荞麦过敏 原。
3. —种荞麦过敏原IgE试剂盒，其特征在于包括己预包被荞麦过敏原的酶标板 8X12孔样品稀释液 10ml阳性血清 0.5ml阴性血清 0.5ml酶结合物 10ml浓缩洗涤液 20ml显色剂A 2mg显色剂B 5ml终止液 5ml其中，所述的样品稀释液为0.01mol/LPBST, pH7.4，酶结合物为辣根过氧化物酶标记的 鼠抗人IgE酶结合物，浓縮洗涤液为含0.05% Tween-20的生理盐水，显色剂A为邻苯二胺， 显色剂B为H202，终止液为lmol/LH2S04溶液。
4.如权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 A:荞麦过敏原酶标板的制备将荞麦过敏原用pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液包被； 用浓度为1%的明胶封闭；用浓度为20%的蔗糖室温保护3小时，干燥后，装入含干燥剂的 包装中保存；B:样品稀释液的制备用8 g NaCl， 0.2 g K H2P04 ， 2.9 g Na2HP04 .12H20, 0.5 ml Tween-20 加蒸馏水至1000 ml配制而成；C:鼠抗人IgE酶结合物的制备用市售的鼠抗人IgE酶结合物，用样品稀释液稀释IOOO倍；D:阳性血清和阴性血清的制备阳性血清取自荞麦过敏病人，阴性血清血清取自健康人 血清；E:浓縮洗涤液的制备将170gNaC110mlTween-20，用1000ml蒸馏水配成浓縮洗涤液；F:显色剂A的制备取试剂邻苯二胺；G:显色剂B的制备取610ml O.lmol/L拧檬酸，640ml 0.2 mol/LNa2HP04. 12 H20,加入 1250ml蒸馏水和4 ml H202;H:终止液的制备lmol/LH2S04溶液。 5.如权利要求3所述的荞麦过敏原IgE试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤 A:取出酶标板，在室温下平衡10分钟，每孔各加95pl样品稀释液，再加5^1待检标 本血清，同时设空白对照，阴性对照，阳性对照，37匸水浴作用0.5-1.5小时；B:将浓縮洗涤液用蒸馏水稀释为20倍的稀释洗涤液；C:用稀释洗涤液洗涤酶标板3次，最后一次倒扣于吸水纸上，使里面的液体充分流尽；D:每孔加,1酶结合物，37'C水浴作用0. 5-1. 5小时；E:用稀释洗涤液洗涤3次，最后一次倒扣于吸水纸上，使里面的液体充分流尽；F:将显色剂A和显色剂B混合，每孔加入lOO^il混合物，暗处反应10-30分钟；H:每孔加入一滴终止液；G:在492nm处测定其光吸收值。
全文摘要
本发明提供了一种荞麦过敏原，通过将荞麦去壳，粉碎，脱脂，溶解，分离纯化等步骤制得，其分子量为56kD。本发明提供了一种荞麦过敏原试剂盒，是一种用间接酶联免疫吸附试验检测荞麦过敏的IgE检测试剂盒。本发明的荞麦过敏原与荞麦过敏病人血清中的IgE具有特异性的结合活性，较目前临床检测中使用的过敏原有较宽的检测范围，可用于临床检测及荞麦过敏症的早期诊断，也适合作流行病学调查。所制备的试剂盒灵敏度高，检测时间短，操作简单易行，检测成本低廉，可以实现大批量检测，适于推广使用。
文档编号C07K14/415GK101148471SQ200710139639
公开日2008年3月26日 申请日期2007年10月26日 优先权日2007年10月26日
发明者崔晓东, 昕 张, 王转花 申请人:山西大学