专利名称：Cd133在制备肿瘤标志物中的用途及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和肿瘤药物领域。具体地说，本发明涉及一种肿瘤干细胞表面标志CD133在胶质瘤侵袭中的作用，以及CD133与下游通路在肿瘤的药物筛选和治疗中潜在的应用。
背景技术：
脑星形胶质瘤是ー种致命和常见的颅内肿瘤。在常规手术治疗，放化疗的前提下，病人的平均存活时间在15个月左右。造成胶质瘤难以治愈的原因是胶质瘤细胞易侵袭和播散到周围正常的脑组织中，导致手术切除不完全进而引起肿瘤的复发。然而，目前对胶质瘤侵袭的机制和特性的认识仍然不足，因此，探究胶质瘤侵袭的分子机制是治疗胶质瘤的关键。 现有的研究中表明，⑶133是5次跨膜糖蛋白，位于细胞表面。⑶133在脑肿瘤干细胞以及白血病干细胞、大肠癌干细胞、前列腺癌干细胞、肝癌干细胞等多种实体肿瘤干细胞中均有表达，可以作为相关肿瘤干细胞的广谱标志物。在肿瘤的研究中已发现，CD133阳性的肿瘤细胞比CD133阴性的细胞有更强的自我更新和増殖能力，但是目前还没有发现其在胶质瘤侵袭中的作用。
发明内容
本发明的目的是提供CD133的新用途。本发明提供了 CD133作为肿瘤细胞侵袭的标志的用途，以及以CD133为靶标筛选抑制肿瘤细胞侵袭的药物的应用，为肿瘤的鉴定和治疗提供了參考依据。本发明提供了 CD133作为肿瘤细胞侵袭的标志的应用，尤其是针对胶质瘤细胞。具体检测时，可以先取待测样本，然后分析比较待测样本与正常对照中CD133的表达量。⑶133表达量高于正常対照的，肿瘤细胞易发生侵袭。所述的待测样本可以是细胞样本，组织样本，或者细胞、组织的蛋白抽提物。正常对照可以是正常人的样本，较好的是取自患者本人癌旁或者肿瘤组织周边的组织或者细胞样本。检测时，通常采用相关抗体等检测样本中CD133含量。实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用双侧t检验来比较差异。P <0.01认为具有统计学差异。所有数据采用SPSS V13. O软件或者具备类似统计功能的软件分析。实际检测时待测样本比正常对照中CD133的表达量高30%及以上为阳性结果，表明肿瘤细胞趋向侵袭或者迁移。本发明的CD133是位于细胞表面的跨膜蛋白，其序列及相关信息可以參考genbank数据库。例如使用NP_006008的序列报告。本发明运用转染了荧光素酶质粒的GL261鼠胶质瘤细胞建立小鼠胶质瘤模型，目的在于对胶质瘤的分布进行定位，并对脑组织切片进行CD133的免疫组化分析，目的在于探究肿瘤中CD133的表达情况与分布。结果表明，CD133在胶质瘤周围的侵袭灶中高表达，明显高于周围正常组织和肿瘤的内部，对人脑胶质瘤组织切片的免疫组化分析也有相同结果。与此同时，本发明通过对GL261鼠胶质瘤细胞转染⑶133-Flag质粒，建立了高表达⑶133的小鼠胶质瘤模型和体外transwell侵袭能力测验模型,并与转染空质粒Flag组和对照组进行比较，目的是明确CD133在胶质瘤生长中的作用，由此发现CD133高表达的胶质瘤细胞更易发生侵袭，在另建立的U87-GFP和U87-⑶133-GFP的裸鼠模型中也观察到了相同的现象。因此本发明明确了 CD133使胶质瘤细胞易发生侵袭的新作用。本发明运用流式细胞术检测细胞周期、明胶酶谱试验、细胞黏附试验、体外划痕试验和细胞骨架蛋白F-actin染色对转染⑶133-Flag质粒、转染Flag空质粒和对照三组细胞进行研究，目的是探究CD133高表达引起胶质瘤侵袭能力增强的原因，结果发现细胞周期、与基质降解有关的MMP酶谱和细胞黏附均无明显差异，而细胞划痕试验与免疫荧光证实了 CD133高表达胶质瘤体外的迁移能力也有增强，细胞骨架蛋白F-actin有呈束状排列的现象，明确了 CD133通过提高肿瘤细胞的迁移能力和改变细胞骨架使胶质瘤更易发生侵袭，为相关的基础和临床研究提供了新的思路。本发明还提供了 CD133在制备抑制肿瘤细胞侵袭药物中的应用，CD133可以作为筛选抑制肿瘤细胞侵袭药物的药靶。降低CD133表达量的物质是抑制肿瘤细胞侵袭药物的候选药物。所述的抑制肿瘤细胞侵袭药物可以是消减肿瘤细胞迁移能力的药物，也可以是抑制肿瘤细胞细胞骨架生长的药物。相应的，本发明提供了一种筛选抑制肿瘤细胞侵袭药物的试剂盒，该试剂盒含有CD 133。较好的，该试剂盒针对胶质瘤细胞。通常，试剂盒中含有标准剂量的CD133蛋白对照品，操作手册，稀释液或者缓冲液等。
本发明运用了 Westernblot技术对⑶133表达发生改变时PI3K/AKT，FAK以及ERK信号通路进行研究。结果发现⑶133高表达细胞中pPDKl、pAkt的水平明显上调，而PFAK和pERK的水平几乎不变，说明了⑶133可以激活PI3K/PDK/Akt通路。运用抑制剂Wortmannin可以在体外抑制⑶133介导的胶质瘤细胞侵袭,这证明抑制⑶133及其下游效应物可以抑制胶质瘤细胞侵袭。这从另ー个角度说明，本发明的CD133可以作为筛选抑制胶质瘤细胞的药物的药靶。本发明涉及肿瘤干细胞表面标志CD133在胶质瘤侵袭中的作用及相关机制。本发明的实验表明，CD133在胶质瘤周围侵袭灶中表达增高，并且CD133过表达的胶质瘤细胞更易发生侵袭；同时本发明发现⑶133通过与下游PI3K/Akt相互作用调节细胞骨架蛋白F-actin和细胞的迁移能力，进而使胶质瘤细胞更易发生侵袭。尽管本发明的实施例以胶质瘤细胞为模型，但是，本发明也可以应用于其他ー些肿瘤。因此CD133的特性及其与下游通路作用的分子机制可以为肿瘤的基础研究和抗肿瘤药物的研发提供新的思路。本发明确定了⑶133的表达与胶质瘤细胞的侵袭性相关，并且证实⑶133通过与下游PI3K/Akt信号通路的作用參与了胶质瘤侵袭的过程，利用PI3K的抑制剂Wortmannin能够抑制胶质瘤的侵袭。本发明的主要实验结果验证了
(1)⑶133在胶质瘤周围侵袭灶中表达增高，⑶133高表达的胶质瘤细胞在体内和体外更易发生侵袭；
(2)CD133高表达引起胶质瘤侵袭增强的原因与细胞周期、细胞外基质降解和细胞粘附能力增强无明显关系，而与细胞的迁移能力增强和骨架蛋白F-actin结构改变有关；
(3)⑶133下游PI3K/Akt通路相互作用引起胶质瘤迁移能力增强和F-actin结构改变进而使胶质瘤的侵袭能力增强。本发明应用质粒转染、鼠胶质瘤模型建立、活体成像、免疫组化，Transwell技术验证CD133在胶质瘤周围的侵袭灶中高表达，并且CD133高表达的胶质瘤细胞更易发生体内和体外的侵袭。应用流式细胞术细胞周期检测、明胶酶谱试验、细胞黏附试验、体外划痕试验和细胞骨架染色技术发现CD133通过提高肿瘤细胞的迁移能力和改变细胞骨架使胶质瘤更易发生侵袭。应用Westernblot技术和PI3K抑制剂发现⑶133与下游PI3K/Akt通路相互作用，抑制该通路可以抑制⑶133介导的胶质瘤细胞侵袭。因此⑶133不仅是胶质瘤干细胞的表面标志，还可以作为胶质瘤侵袭能力的标志，CD133及其与下游的PI3K/Akt通路作用的新机制不仅可以为胶质瘤的基础研究提供新的思路，还可以为临床抗肿瘤药物的研究和筛选提供參考。
图I显示具有代表性的人恶性胶质瘤标本⑶133免疫组化染色区域主要位于胶质瘤的侵袭区域。图2显示⑶133可以促进胶质瘤的体内侵袭。A,显示GL261，GL261_Flag和GL261_CD133_Flag细胞形成的小鼠胶质瘤的HE染色。B,显示具有代表性的GL261-CD133_Flag脑内成瘤后的Flag免疫组化染色。图3-图5显示⑶133可以促进胶质瘤细胞的体外侵袭和迁移。图 3，光镜下 GL261-Mock, GL261_Flag 和 GL261_CD133_Flag 细胞的 Transwell侵袭实验分析。图4，GL261-Mock, GL261_Flag 和 GL261_CD133_Flag 细胞的划痕迁移实验分析。图5，GL261-Mock, GL261_Flag 和 GL261_CD133_Flag 细胞 F-actin 染色分析。图6-图10显示⑶133通过激活PI3K/Akt通路促进胶质瘤的侵袭。图 6，利用 Western blot 分析 GL261-Mock, GL261_Flag 和 GL261_CD133_Flag 细胞Akt，PDK, ERK和FAK的磷酸化情况。图7，PI3K抑制剂Wortmannin抑制CD133诱导的Akt活化。图8，B中细胞的划痕实验分析。图9，B中细胞Transwell侵袭实验的定量分析。图10，B中细胞F-actin染色分析。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用双侧t检验来比较差异。P <0.01认为具有统计学差异。所有数据采用SPSS V13. O软件分析。一、细胞培养和转染
本实验利用人胶质瘤细胞U87-MG和小鼠胶质瘤细胞GL261。所有细胞均采用含10%胎牛血清、100 μ g/ml青霉素及50 μ g/ml链霉素的DMEM培养液，在5%C02_95%空气，饱和湿度以及37°C的条件下培养。基因转染參照LipofectAMINE转染试剂盒操作手册。将处于对数生长期的细胞以IX IO5细胞/孔接种于六孔细胞培养板中，培养16-24 h，细胞密度约60-80%吋，置转染试剂(A试剂1μ g质粒+100 μ I无血清无双抗的1640/DMEM培养基；Β试剂5μ ILipof ectamine+100 μ I无血清无双抗的1640/DMEM培养基)。将A试剂和B试剂小心混匀，室温静置30-45 min，以形成DNA-脂质体复合物。弃去培养孔中培液，用2 ml无血清无双抗的RPMI1640/DMEM培养基洗涤细胞两次。在DNA-脂质体复合物中加入800 μ I无血清无双抗的RPMI 1640/DMEM培养基，小心混勻，共1.0 ml加入ー个培养孔中。37で，5%0)2培养
5h，再加入I. O ml含20%血清的培养基，370C，5%C02培养24 h，更换新鲜完全培养液继续培养。用脂质体法将 LV-GFP、LV-Luc, LV-Flag, LV_CD133_Flag (CD133_Flag 序列见 SEQID NO I)及GST-⑶133-⑶表达质粒转染相应细胞，筛选后得到稳定转染株。ニ、试剂
活性Src蛋白购于Millipore有限公司。抗-⑶133抗体(k_18)、抗-GAPDH抗体购于Santa Cruz生物技术有限公司。抗-ρ-ERK、抗-p-PDKl (Ser241)抗体、抗-Akt抗体、抗 _P_Akt (Ser473)抗体、抗 _p_Akt (Thr308)抗体、抗-p_FAK (Tyr925)抗体、杭-鼠-HRP ニ抗、抗-羊-HRP ニ抗和抗-兔-HRP ニ抗均购于Cell Signaling有限公司。抗-Flag抗体和PI3K抑制剂Wortmannin购于Sigma有限公司。三、小鼠/裸鼠胶质瘤模型建立
稳转相应质粒72小时后，IO5个GL261或U87-MG细胞注射入四周龄雄性C57BL/6小鼠或四周龄雄性裸鼠的右侧尾状核。进针部位为右侧脑，Breggma点后移O. 5mm,然后侧移2. 2mm左右，向下3mm左右。4 6周后以小动物活体成像系统检测颅内肿瘤生长情况。麻醉并以4%多聚甲醛灌流小鼠，取脑，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片。四、组织病理及免疫组化
胶质瘤标本固定于4%多聚甲醛，石蜡包被，切片，HE染色后光镜下观察组织病理形态。脱腊后以抗-⑶133和抗-Flag抗体进行免疫组化检测。照片以Motic Image Advanced 3. 2图片分析系统获取。五、Transwell细胞侵袭试验
在24孔Transwell室聚碳酸酯膜(膜孔径8 mm)上涂lmg/ml的matrigel 40 μ I, 37°C孵育5 h，使之在微孔滤膜上重组为基底膜结构。之后吸出上室残余液体，加70 μ I不含血清的DMEM水化基底膜，37°C孵育30 min。取对数生长期的A2780/s、A2780/cis、Mortalin/HSPA9/Grp75 SiRNA细胞，以不加血清的DMEM培养液调整细胞数为I X IO5个/ml。取200μ I细胞悬液接种Transwell上室内，下室加入10 % FBS的DMEM培养液600 μ I, 37 °C5%C02培养箱中培养24 h。24 h后弃去孔中培养液，PBS洗2遍，甲醇固定15 min, O. 1%结晶紫染色15 min, Cl2H2O2洗3適，将滤膜上层细胞用棉签轻轻抹去，400倍光镜下选择膜上下左右中5个不同视野的穿膜细胞数，求平均值。六、划痕试验
取生长至80%融合的细胞，细胞重悬于无血清培养液中24小吋。胰蛋白酶消化后以
IX IO6个细胞/孔接种于6孔细胞培养板，培养24 h细胞基本融合。用无菌I ml枪头垂直在培养板底划平行、垂直的4条“划痕”，用培液冲洗若干次以洗去被划下的细胞。于指定时间点在倒置相差显微镜下计数距离划痕O. 2 mm内的细胞数，每组设双复孔，3次独立实验。七、细胞黏附试验
细胞重悬于无血清培养液中24小时。24孔板包被基质胶(Matrigel)，每孔加入含
2.5*105个细胞的O. 5 ml细胞悬液，37度孵育lh。PBS洗4次(洗去未贴壁细胞)。O. 5%结晶紫(20%甲醇溶液)染色lOmin。ddH20洗涤lOmin。每孔加入10%醋酸O. 25ml，裂解液于590nm处比色。ノV、明胶酶谱试验
制备10%凝胶。制备分离胶时，加入10mg/ml gelatin水溶液,65 °C水浴，使得gelatin终浓度为lmg/ml。蛋白样品制备1)上清细胞无血清培养24h。冰上收集上清，3000rpmX10min离心去除细胞和残骸，浓缩20倍，后于-4°C保存。2)细胞裂解液裂解细胞(裂解液含 1% Triton X-100 的 I X TBS 溶液，301/60mm dish), cocktail 1:200，置于冰上摇30 min，后于-70°C保存。溶解后12000rpmX IOmin离心，定量吸取上清。加入等体积 Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)稀释,室温放置 10 min,加溴酹蓝 0. 51。电泳至溴酹蓝跑出胶。IXDeveloping BufferlOOml,室温慢摇平衡凝胶30min, 37°C平衡过夜。
0.5%考马斯亮蓝R-250 (甲醇冰醋酸水=30:10:60)染色30min，脱色液(甲醇冰醋酸:水=50:10:40)中脱色，拍照。九、免疫印迹
取对数生长期细胞，移去培养基，用0. 25%胰酶消化，0. OlM PBS吹打细胞，收集至IOmlEP管，离心，PBS洗涤细胞两次。根据细胞量加入适量SDS蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂cocktail。SDS-PAGE 电泳后，湿转蛋白至 PVDF 膜，5%BSA (TBS/0.1% Tween 20 溶解)封闭
2小时，之后与ー抗在室温下孵育2小时或在4°C孵育过夜，用TBS/0. 1% Tween 20洗三遍，每次lOmin。再室温孵育二抗2小时，TBS/0. 1% Tween 20洗三遍，每次lOmin。用ECL化学发光检测试剂盒检測。实施例I
用萤光素酶标记的GL261小鼠胶质瘤细胞构建GL261的C57鼠原位模型，小动物活体成像动态检测肿瘤生长。利用小鼠胶质瘤模型和人恶性胶质瘤标本，通过免疫组化检测CD133(CD133-Flag序列见SEQ ID NO I,其荧光素酶序列见SEQ ID NO 2)在胶质瘤内部、胶质瘤和正常组织交界以及正常组织中的表达特点和差异。结果显示胶质瘤向正常脑组织区域明显侵袭。脑片的CD133免疫组化染色显示，肿瘤侵袭区域CD133高表达，而肿瘤内部以及正常脑组织CD133表达较少。同样的结果也在人的胶质瘤标本中得到了验证。对18例有肿瘤和正常组织交界的胶质瘤标本进行的CD133免疫组化染色提示，交界区的CD133表达量远高于肿瘤内部和正常脑组织。因此，⑶133还可以作为胶质瘤细胞侵袭的标志。实施例2
构建了表达⑶133的质粒，在上述两种胶质瘤细胞中过表达⑶133。利用GL261的C57鼠模型以及U87的裸鼠模型，观察CD133过表达后肿瘤形成的边界、子体瘤数目、胼胝体侵袭和脑室播散情況。结果显示，Mock和Flag组形成的肿瘤边缘光滑，而⑶133组的肿瘤呈现高侵袭性，表现为向正常脑组织侵袭明显，以及大量的脑脊液播散和种植。这些播散灶均为⑶133+，提示它们均来源于外源的⑶133细胞。U87-GFP和U87-⑶133-GFP的裸鼠模型中观察到了与上述相同的现象，即⑶133组肿瘤的侵袭性明显强于Flag组，表现为⑶133组形成大量的子体瘤，数量约是Flag组子体瘤的5倍。这说明，CD133能够用于促进肿瘤的侵袭性。CD133不仅是胶质瘤干细胞的表面标志，还可以作为胶质瘤侵袭能力的标志。实施例3
利用过表达⑶133的GL261和U87胶质瘤细胞，通过Transwell模型、流式细胞术检测细胞周期、明胶酶谱试验、细胞黏附试验、体外划痕试验以及细胞骨架蛋白F-actin染色进一歩分析CD133在胶质瘤侵袭过程中的作用。Transwell侵袭实验结果显示0)133组侵袭细胞数明显多于Mock组和Flag组,提 示CD133在体外可以明显促进GL261胶质瘤细胞的侵袭。三组细胞的细胞周期分布没有统计学差异，这就排除了细胞周期对Transwell侵袭实验结果的影响。MMP酶谱实验结果提示三组细胞MMP-2和MMP-9的活性没有差异，说明CD133对胶质瘤细胞降解基质能力没有明显影响。细胞黏附实验结果说明了 CD133对胶质瘤细胞黏附能力同样没有明显影响。最后，在划痕实验中观察到⑶133组细胞的迁移能力明显高于其余两组。对F-actin的染色结果证实了这ー现象。Flag细胞的actin弥散分布在胞衆中，而⑶133细胞的actin聚集成束，形成突起，多分布于细胞边缘。说明⑶133能够调节actin细胞骨架的组织。上述实验进一步证实了⑶133能够促进胶质瘤细胞的侵袭。而且，⑶133通过增强细胞迁移能力和调节actin细胞骨架促进肿瘤细胞的侵袭。实施例4
通过Western blot检测⑶133表达改变对胶质瘤侵袭调节通路，包括PI3K/AKT，FAK以及ERK信号通路的作用。利用PI3K的抑制剂Wortmannin检测PI3K/AKT信号通路在CD 133调控胶质瘤细胞侵袭中的生物学功能，其中检测方法包括Transwell模型、体外划痕试验以及细胞骨架蛋白F-actin染色。结果表明，较之Mock组和Flag组，CD133组细胞中pPDKl、pAkt的水平明显上调，而pFAK和pERK的水平几乎不变，说明了 CD133可以激活PI3K/PDK/Akt通路。Western blot结果显示Wortmannin可以明显抑制Akt的磷酸化。划痕实验和Transwell侵袭实验结果显示Wortmannin可以明显抑制胶质瘤细胞的迁移能力。对F-actin的染色证实了 Wortmannin可以显著抑制actin细胞骨架的组织。因此，⑶133及其与下游的PI3K/Akt通路，不仅可以为胶质瘤的基础研究提供新的思路，还可以为临床抗肿瘤药物的研究和筛选提供參考。例如，Wortmannin可以明显抑制Akt的磷酸化，就能够明显抑制胶质瘤细胞的侵袭。CD133及Akt可以用于筛选抑制肿瘤细胞侵袭的药物，尤其是抑制胶质瘤细胞细胞侵袭的药物。
权利要求
1.CD 133在制备肿瘤标志物中的用途，其中，所述的CD133为肿瘤细胞侵袭的标志。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞是胶质瘤细胞。
3.如权利要求I所述的应用，其特征在于，取待测样本，检测CD133的表达量；待测样本的CD133表达量高于正常对照样本的，肿瘤细胞易发生侵袭。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的待测样本是细胞样本，组织样本，或者细胞、组织的蛋白抽提物。
5.CD 133在制备抑制肿瘤细胞侵袭药物中的应用，其中，CD133是筛选抑制肿瘤细胞侵袭药物的药靶。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抑制肿瘤细胞侵袭药物是降低CD133表达量。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抑制肿瘤细胞侵袭药物是消减肿瘤细胞迁移能力的药物。
8.一种筛选抑制肿瘤细胞侵袭药物的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有CD133。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的肿瘤细胞是胶质瘤细胞。
全文摘要
本发明涉及肿瘤的分子生物学和肿瘤药物治疗领域。本发明提供了CD133作为肿瘤细胞侵袭的标志的用途，以及以CD133为靶标筛选抑制肿瘤细胞侵袭的药物的应用。本发明利用质粒转染、鼠胶质瘤模型建立、活体成像、免疫组化和Transwell技术验证CD133在胶质瘤周围的侵袭灶中高表达，并且CD133高表达的胶质瘤细胞更易发生体内和体外的侵袭。进一步研究表明，CD133通过提高肿瘤细胞的迁移能力和改变细胞骨架使胶质瘤更易发生侵袭。CD133可以为肿瘤治疗方案的选择和抗肿瘤药物的筛选提供新的思路。
文档编号G01N33/68GK102692506SQ20111006776
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月21日 优先权日2011年3月21日
发明者江一舟, 江建海, 王杉杉, 许诺, 邹飞, 魏湲颜 申请人:复旦大学