癌症标志物及癌症的判定方法与流程

文档序号:11109470阅读:664来源:国知局
癌症标志物及癌症的判定方法与制造工艺
本发明涉及癌症标志物及使用该癌症标志物判定癌症的方法。
背景技术
:将一类具有叉头或翼螺旋DNA结合域的转录因子称为叉头框(Forkheadbox,FOX),在人体中存在约50种。FOX主要作为生长调节因子、组织特异性调节因子、细胞周期调节因子发挥作用,但是,许多FOX的作用几乎尚未阐明。其中,已报告了FOXB2在非洲爪蟾中参与形成胚胎神经,然而,其在哺乳动物中的功能还尚未明确。另一方面,已知DNA的甲基化与癌变有关,在日本特开2008-283947中记载有一种基于FOXB2基因的CpG岛(CpG二核苷酸:-CG-序列)中的甲基化率检测食道癌的方法。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开2008-283947。技术实现要素:发明所要解决的问题上述专利文献1记载了癌细胞的CpG二核苷酸中的胞嘧啶多发生甲基化,并且,还记载了采用BAMCA法(BacterialArtificialchromosomearray-basedMethylatedCpGislandAmplification,细菌人工染色体的甲基化CpG岛扩增阵列法)测定食道癌的FOXB2基因并确认了CpG二核苷酸中的胞嘧啶被甲基化。然而,由于BAMCA法测定CCCGGG序列的甲基化,因此,其测定位点非常有限。另一方面,本发明人对癌细胞中CpG二核苷酸的胞嘧啶的甲基化进行了悉心研究,其结果发现:并不是癌细胞中的全部CpG二核苷酸均被甲基化,另外,其甲基化率因CpG二核苷酸的位置不同而不同。因此,如BAMCA法那样根据多个位点的甲基化判定癌症的精度低,人们期待一种更高精度地判定细胞癌变的方法。另外,癌症发生于多种细胞中,人们期待一种癌症的判定方法,其能够应用于各种细胞,而不仅是判定特定的细胞的癌变。于是,本发明的课题是提供一种能够高精度地判定细胞的癌变并且能够判定各种细胞的癌变的癌症的判定方法及癌症标志物。解决问题的技术方案本发明人鉴于上述情况而进行悉心研究,其结果,以来自于各种正常细胞、健康人的血液以及各种癌细胞的基因组DNA为模板,采用亚硫酸氢盐法,对FOXB2基因的特定区域进行分析时发现,该特定区域中CpG二核苷酸的胞嘧啶在各种正常细胞和健康人全血基因组DNA中呈非甲基化状态,而在各种癌细胞中呈甲基化状态。于是,本发明人根据该结果而完成了本发明。即,本发明涉及“癌症标志物,由来自细胞的FOXB2基因中的由序列号1表示的碱基序列中的一部分或全部组成,至少包含由序列号3表示的碱基序列,碱基序列内存在的-CG-序列中的胞嘧啶的30%以上被甲基化”、“癌症标志物,由来自细胞的FOXB2基因中的由序列号1表示的碱基序列中的一部分或全部组成,至少包含由序列号2表示的碱基序列,碱基序列内存在的-CG-序列中的胞嘧啶的30%以上被甲基化”以及“判定细胞癌变的方法,对来自细胞的FOXB2基因中的由序列号1表示的碱基序列内存在的-CG-序列中的胞嘧啶的一部分或全部,通过亚硫酸氢盐反应,测定胞嘧啶的甲基化率,并基于该甲基化率判定细胞的癌变”。发明效果通过以本发明的癌症标志物为指标并且采用本发明的方法,无论何种细胞,均能够对各种细胞判定细胞的癌变。进一步地,由于本发明的方法测定特定区域的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率,因此,能够高精度地判定细胞的癌变。附图说明图1是表示对于实施例1的hiPS(人正常皮肤成纤维细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图2是表示对于实施例1的HDF(人正常皮肤成纤维细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图3是表示对于实施例1的WI-38(人正常肺成纤维细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图4是表示对于实施例1的CCD-8Lu(正常人肺二倍体细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图5是表示对于实施例1的HE23(正常人胚胎细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图6是表示对于实施例1的全血中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图7表示FOXB2启动子区域的碱基序列(PCR扩增区域,基因银行登记号AL353637:106566-107058,序列号10)。图8是表示对于实施例2的IMR-32(人腹部神经母细胞瘤细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图9是表示对于实施例2的HEK293(人胚胎肾细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图10是表示对于实施例2的HeLa(人子宫颈癌细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图11是表示对于实施例2的HepG2(人肝癌细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图12是表示对于实施例2的MDA-MB-231(人乳腺癌)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图13是表示对于实施例2的TYK-nu(人卵巢未分化癌细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图14是表示对于实施例2的HCC2998(人大肠腺癌细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图15是表示对于实施例2的HCT-15(人结肠腺癌细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图16是表示对于实施例2的HCT116(人结肠腺癌细胞)的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图17是表示对于实施例2的LoVo(人结肠腺癌细胞(锁骨淋巴结))中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图18是表示对于实施例2的SW620(人结肠腺癌细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图19是表示对于实施例2的SW837(人直肠腺癌细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图20是表示对于实施例2的COLO205(人结肠腺癌细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图21是表示对于实施例2的WiDr(人结肠腺癌细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图22是表示对于实施例2的LNCap.CloneFGC(人前列腺癌细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图23是表示对于实施例2的NCI-H460(人非小细胞肺癌细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图24是表示对于实施例2的ACHN(人肾腺癌细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图25是表示对于实施例2的MCF-7(人乳腺癌细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图26是表示对于实施例2的PANC-1(人胰腺癌细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图27是表示对于实施例2的CFPAC-1(人胰腺癌)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图28是表示对于实施例2的DAUDI(人伯基特(Burkitt)淋巴瘤细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图29是表示对于实施例2的HL60(人早幼粒细胞性白血病细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图30是表示对于实施例2的Jurkat(人T细胞性白血病细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图31是表示对于实施例2的MonoMac6(人单核细胞性白血病细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。图32是表示对于实施例2的THP-1(人急性单核细胞性白血病细胞)中的FOXB2基因而言,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶还是甲基化胞嘧啶的图。具体实施方式[本发明的癌症标志物]本发明的癌症标志物,由来自细胞的FOXB2基因中的启动子区域中存在的由序列号1表示的碱基序列中的一部分或全部组成,至少包括由序列号3表示的碱基序列或者至少包括由序列号2表示的碱基序列(以下也将上述碱基序列简称为本发明的癌症标志物碱基序列),该碱基序列内存在的-CG-序列中的胞嘧啶的30%以上被甲基化,优选40%以上被甲基化,更优选50%以上被甲基化。作为上述本发明的癌症标志物碱基序列,具体而言,可举出:序列号1所示的碱基序列;序列号2所示的碱基序列;序列号3所示的碱基序列;由序列号2所示的碱基序列以及与其3’侧邻接的1~72个碱基中的与序列号2邻接的至少一个碱基组成的连续碱基;由序列号2所示的碱基序列以及与其5’侧邻接的1~21个碱基中的与序列号2邻接的至少一个碱基组成的连续碱基;由序列号2所示的碱基序列和与其3’侧邻接的1~72个碱基中的与序列号2邻接的至少一个碱基以及与序列号2的5’侧邻接的1~21个碱基中的与序列号2邻接的至少一个碱基组成的连续碱基(序列号1所示的碱基序列除外);由序列号3所示的碱基序列以及与其3’侧邻接的1~72个碱基中的与序列号3邻接的至少一个碱基组成的连续碱基;由序列号3所示的碱基序列以及与其5’侧邻接的1~56个碱基中的与序列号3邻接的至少一个碱基组成的连续碱基;由序列号3所示的碱基序列和与其3’侧邻接的1~72个碱基中的与序列号3邻接的至少一个碱基以及与序列号3的5’侧邻接的1~56个碱基中的与序列号3邻接的至少一个碱基组成的连续碱基(序列号1所示的碱基序列除外)等。作为本发明的癌症标志物碱基序列,更具体地说,可举出:序列号1所示的碱基序列(图7中的碱基序列);序列号2所示的碱基序列(图7中的碱基序列);序列号3所示的碱基序列(图7中的碱基序列);由序列号2所示的碱基序列以及与该碱基序列的3’侧邻接的23个碱基、40个碱基、54个碱基或72个碱基组成的连续碱基序列(图7中的碱基序列、的碱基序列、的碱基序列或的碱基序列);由序列号2所示的碱基序列以及与该碱基序列的5’侧邻接的11个碱基或21个碱基组成的连续碱基序列(图7中的碱基序列或的碱基序列);由序列号2所示的碱基序列、与该碱基序列的3’侧邻接的23个碱基、40个碱基、54个碱基或72个碱基以及与序列号2所示的碱基序列的5’侧邻接的11个碱基或21个碱基组成的连续碱基序列(图7中的碱基序列、的碱基序列、的碱基序列、的碱基序列、的碱基序列、的碱基序列、的碱基序列或的碱基序列);由序列号3所示的碱基序列以及与该碱基序列的3’侧邻接的23个碱基、40个碱基、54个碱基或72个碱基组成的连续碱基序列(图7中的碱基序列、的碱基序列、的碱基序列或的碱基序列);由序列号3所示的碱基序列以及与该碱基序列的5’侧邻接的8个碱基、10个碱基、14个碱基、32个碱基、35个碱基、46个碱基或56个碱基组成的连续碱基序列(图7中的碱基序列、的碱基序列、的碱基序列、的碱基序列、的碱基序列、的碱基序列或的碱基序列);由序列号3所示的碱基序列、与该碱基序列的3’侧邻接的23个碱基、40个碱基、54个碱基或72个碱基、以及与序列号3所示的碱基序列的5’侧邻接的8个碱基、10个碱基、14个碱基、32个碱基、35个碱基、46个碱基或56个碱基组成的连续碱基序列(以图7中的为5’末端且以为3’末端的碱基序列)等,其中,优选序列号1所示的碱基序列、序列号2所示的碱基序列、序列号3所示的碱基序列等,更优选序列号2所示的碱基序列、序列号3所示的碱基序列等,进一步优选序列号3所示的碱基序列。另外,对于本发明的癌症标志物碱基序列而言,只要序列中包含的-CG-序列的胞嘧啶相同,就能够用作相同的癌症标志物,因此,上述具体的碱基序列可以包括5’末端方向和/或3’末端方向的截至下一个-CG-序列中的胞嘧啶的一个碱基前为止的碱基序列的一部分或全部。即,例如,上述序列号1所示的碱基序列可以包括与5’侧邻接的53个碱基中的与序列号1邻接的至少一个碱基和/或与3’侧邻接的38个碱基中的与序列号1邻接的至少一个碱基。例如,序列号2所示的碱基序列可以包括与5’侧邻接的10个碱基中的与序列号2邻接的至少一个碱基和/或与3’侧邻接的22个碱基中的与序列号2邻接的至少一个碱基。例如,序列号3所示的碱基序列可以包括与5’侧邻接的7个碱基中的与序列号3邻接的至少一个碱基和/或与3’侧邻接的22个碱基中的与序列号3邻接的至少一个碱基。当本发明的癌症标志物碱基序列是序列号2所示的碱基序列或序列号3所示的碱基序列时,该癌症标志物的-CG-序列中的胞嘧啶的40%以上被甲基化,优选50%以上被甲基化,更优选60%以上被甲基化。在基因银行登记号AL353637的碱基号106812-106961中记载有上述序列号1所示的碱基序列。在基因银行登记号AL353637的碱基号106833-106889中记载有上述序列号2所示的碱基序列。在基因银行登记号AL353637的碱基号106868-106889中记载有上述序列号3所示的碱基序列。对于序列号1和2所示的碱基序列而言,还包括因物种差异、个体差异或细胞、组织差异等产生的突变而导致碱基缺失、取代或附加的碱基序列。本发明的癌症标志物中的FOXB2基因只要是来自细胞的FOXB2基因即可,根据判定的癌症选择细胞的种类。例如,当判定肝癌时,使用来自肝细胞的基因即可;当判定前列腺癌时,使用来自前列腺细胞的基因即可。另外,当判定白细胞癌变时,可以从血液中提取白细胞、或者使用血液本身,只要使用来自白细胞的基因即可。作为FOXB2基因的来源的细胞优选为来自哺乳动物的细胞,特别优选为来自人的细胞。作为优选的细胞,例如,可举出神经母细胞、肾脏、子宫、肝脏、乳腺、卵巢、大肠(结肠、直肠)、前列腺、肺、胰脏、骨髄细胞、T细胞等。使本发明的癌症标志物碱基序列进行亚硫酸氢盐反应,并检测-CG-序列中的甲基化胞嘧啶,基于所述甲基化胞嘧啶的数量计算本发明的癌症标志物碱基序列内存在的-CG-序列中的胞嘧啶的甲基化率。如果使本发明的癌症标志物碱基序列进行亚硫酸氢盐反应,则非甲基化胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化胞嘧啶不转化为尿嘧啶。因此,通过分析亚硫酸氢盐反应后的碱基序列并与正常的碱基序列进行比较,能够检测甲基化胞嘧啶,通过用-CG-序列中的甲基化胞嘧啶的数量除以-CG-序列中的胞嘧啶的数量,能够计算甲基化率。需要说明的是,对于亚硫酸氢盐反应的详细情况,在后文的本发明的癌变的判定方法一项中进行说明。对于本发明的癌症标志物而言,例如,能够通过从来自哺乳动物的细胞中获取基因组DNA后、从该基因组DNA中获取本发明的癌症标志物碱基序列来获得。作为从上述细胞中获取基因组DNA的方法,例如,按照基因工程实验室手册(丸善株式会社)、基因工程手册(羊土社株式会社)等中记载的碱性SDS法等公知的DNA提取方法、或者使用市售的基因组DNA提取试剂盒,从细胞、微生物、病毒等中提取,从而得到上述基因组DNA。作为从上述得到的基因组DNA中获取本发明的癌症标志物碱基序列的方法,可以采用在本领域中使用的公知方法,例如,可举出设计能够获取目标碱基序列那样的引物并通过聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)来获取的方法等。作为在这种情况下使用的引物,例如,可举出以下引物。正向引物GGTTTGGTTAAGTGTTTGGTTAGGGG(序列号4)GTAGTTAGTTTTAGTATTTAGTTTTTGG(序列号5)反向引物CCTAACTACCCCCACTAATTCCCACTC(序列号6)CCCTCTCTACTTCTCTCTCCTACCTTCTC(序列号7)作为PCR的具体方法,可以按照后述的[具有本发明的目标碱基序列的DNA的取得]一项中记载的PCR反应来进行。[本发明的癌变的判定方法]作为本发明的癌变的判定方法,对于来自细胞的FOXB2基因中由序列号1表示的碱基序列中的一部分或全部(以下,有时简称为本发明的目标碱基序列)而言,通过亚硫酸氢盐反应,测定该碱基序列内存在的-CG-序列中的一部分或全部胞嘧啶的甲基化率,并基于所述甲基化率判定细胞的癌变,从而实现本发明的癌变的判定方法。具体而言,该甲基化率为30%以上、优选为40%以上、更优选为50%以上时,判定为细胞癌变。作为上述本发明的目标碱基序列,可举出与上述本发明的癌症标志物碱基序列相同的碱基序列,其中,优选序列号2所示的碱基序列、序列号3所示的碱基序列,更优选序列号2所示的碱基序列。当测定本发明的目标碱基序列内存在的-CG-序列的一部分或全部胞嘧啶的甲基化率时,只要适当地选定用于判定癌症的-CG-序列的胞嘧啶,并测定这些胞嘧啶的甲基化率即可。作为用于判定癌症的-CG-序列的胞嘧啶的组合,例如,可举出图7中的⑦~⑩与的组合、⑦~⑩与的组合、⑧~⑩与的组合、⑧~⑩与的组合等,其中,优选(相当于序列号2所示的碱基序列)、(相当于序列号3所示的碱基序列)等,优选等。当测定上述或的-CG-序列中的胞嘧啶的甲基化时、或者序列号1所示的碱基序列中的一部分为序列号2所示的碱基序列或序列号3所示的碱基序列时,在本发明的癌变的判定方法中,所述碱基序列内存在的-CG-序列中的胞嘧啶的甲基化率为40%以上、优选为50%以上、更优选为60%以上时,判定为细胞癌变。作为本发明的癌变的判定方法,具体而言,使来自细胞的FOXB2基因的基因组DNA进行亚硫酸氢盐反应后,获取具有本发明的目标碱基序列的DNA,然后,测定上述碱基序列内存在的-CG-序列中的全部胞嘧啶的甲基化率、或者如上所述选定上述碱基序列内存在的-CG-序列中的一部分胞嘧啶,并测定所选定的胞嘧啶的甲基化率,接着,基于所得到的甲基化率判定细胞癌变,从而实现本发明的判定癌变的方法。[基因组DNA的取得]在上述本发明的判定癌变的方法中,来自细胞的FOXB2基因的基因组DNA能够通过下述方法得到:通过例如基因工程实验室手册(丸善株式会社)、基因工程手册(羊土社株式会社)等中记载的碱性SDS法等公知的DNA提取方法来得到,或者使用市售的基因组DNA提取试剂盒、通过从目标细胞中提取而得到。作为目标细胞,可以根据所判定的癌症进行适当选择。该细胞优选为来自哺乳动物的细胞,特别优选为来自人的细胞。另外,上述细胞既可以是培养的细胞,也可以是从哺乳动物等中提取的细胞,提取的细胞既可以是直接提取的细胞,也可以是从血液等体液中提取的细胞。[亚硫酸氢盐反应]作为上述本发明的癌变的判定方法中的亚硫酸氢盐反应,可以按照本领域公知的亚硫酸氢盐法来进行,具体而言,例如,对上述得到的基因组DNA进行单链化处理,使其与亚硫酸盐反应从而将胞嘧啶磺酸化,然后使磺酸化的胞嘧啶水解,进一步地,在碱存在的条件下进行脱磺酸化,由此进行。根据该反应,甲基化胞嘧啶不进行反应而保持原有状态,只有非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。在上述亚硫酸氢盐反应中,可以在WO2013/089063记载的由下述通式[1]~[8]表示的化合物中的至少一种存在的条件下,进行亚硫酸氢盐反应。在上述情况下,对于这些化合物中的取代基(R1~R39)的具体例、化合物的具体例、化合物的用量、使用方法而言,可以按照WO2013/089063的记载进行设定、实施。由通式[1]表示的化合物(式中,R1~R6各自独立地表示氢或碳数为1~6的烷基,n表示1~3的整数)由通式[2]表示的化合物(式中,Y表示碳原子、氧原子或氮原子,R7~R12各自独立地表示氢原子或碳数为1~6的烷基,k表示0~2的整数,当Y为氧原子时,k表示0;当Y为氮原子时,k表示1;当Y为碳原子时,k表示2。)由通式[3]表示的化合物(式中,R13~R15各自独立地表示氢原子或碳数为1~6的烷基)由通式[4]表示的化合物(式中,R17和R19各自独立地表示氢原子、氨基或碳数为1~6的烷基,R16、R18和R20各自独立地表示氢原子、氨基、碳数为1~6的烷基或碳数为2~6的二烷基氨基,R16、R17、与R16相邻的碳原子以及与R17相邻的碳原子可以共同形成苯环)由通式[5]表示的化合物(式中,R21和R22各自独立地表示碳数为1~6的烷基,X1表示抗衡阴离子(counteranion)由通式[6]表示的化合物(式中,R23表示碳数为1~6的烷基,R24~R28各自独立地表示氢原子或碳数为1~6的烷基,X2表示抗衡阴离子)由通式[7]表示的化合物(式中,R29~R34各自独立地表示氢原子或碳数为1~6的烷基)由通式[8]表示的化合物(式中,Z表示氮原子或碳原子,m表示0或1的整数,当Z为氮原子时,m表示0;当Z为碳原子时,m表示1。R35~R39各自独立地表示氢或碳数为1~6的烷基)可以以溶解有基因组DNA的溶液的形式提供上述亚硫酸氢盐反应中的基因组DNA,作为该溶液,例如,可举出pH为6~8的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)等两性离子缓冲液(Good's缓冲液);磷酸缓冲液;三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液;甘氨酸缓冲液;硼酸缓冲液;碳酸氢钠缓冲液;溶解于灭菌水等的溶液等,其中,优选溶解于灭菌水的溶液。对该溶液中的DNA量没有特别限定,通常,1~10μL溶液中含有10~100ng的DNA。可以通过本领域公知的单链化处理进行亚硫酸氢盐反应中基因组DNA的单链化处理。可举出:例如,通过在通常为80~100℃、优选为85~95℃的条件下,通常加热30秒~10分钟、优选加热1~3分钟而进行的热处理;例如,通过使DNA接触碱而进行的碱处理等,优选热处理。特别是,在由通式[1]~[8]表示的化合物的存在的条件下进行亚硫酸氢盐反应时,即使将反应温度设为80~100℃,也能够在DNA不分解的情况下进行反应,因此,可以使基因组DNA在80~100℃条件下进行亚硫酸氢盐反应,使单链化处理和亚硫酸氢盐反应同时进行,简化了处理,因此,在进行单链化处理的情况下,更优选该方法。作为上述碱处理,具体而言,例如,在上述基因组DNA或含有基因组DNA的溶液中添加碱或碱的水溶液,通常,将溶液通常设为pH10~14的碱性,优选设为pH12~14的碱性,由此进行。作为该碱,例如,可举出氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物;氢氧化钡、氢氧化镁、氢氧化钙等碱土金属氢氧化物;碳酸钠等碱金属的碳酸盐、氨、胺类等,其中,优选氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物,在这些碱中,特别优选氢氧化钠。在上述亚硫酸氢盐反应中,作为DNA与亚硫酸氢盐的反应中的亚硫酸盐,例如,可举出亚硫酸氢钠、亚硫酸铵等,优选亚硫酸氢钠。通常,对于所述亚硫酸盐的用量而言,通常在相对于包含50~500ng的DNA的1~500μL溶液中以使反应液中的最终浓度达到1~6mol/L的方式来添加。对于该DNA与亚硫酸盐的反应而言,在通常为30~100℃、优选为50~100℃、更优选为80~95℃的温度条件下,使反应通常进行60分钟~20小时,优选进行60分钟~5小时,更优选进行60~120分钟,由此进行该DNA与亚硫酸盐的反应。通过该反应,胞嘧啶被磺酸化。对于上述亚硫酸氢盐反应中磺酸化的胞嘧啶的水解而言,只要采用本领域中常用的方法即可,没有特别的限定,在通常为30~100℃、优选为80~95℃的温度条件下,通常加热60分钟~20小时,优选加热60分钟~5小时,更优选加热60~120分钟,由此进行水解。另外,该水解处理也可以与上述DNA和亚硫酸盐的反应同时进行。在上述情况下,可以根据磺酸化的胞嘧啶的水解条件来设定DNA与亚硫酸盐的反应中的反应温度和反应时间。对上述已水解的DNA,优选在脱磺酸化处理前进行纯化处理。该纯化处理的目的在于,除去在亚硫酸氢盐反应中使用的高浓度亚硫酸盐等,可以按照本领域中常用的DNA纯化方法进行。具体而言,可举出:例如,在DNA或包含DNA的溶液中添加胍盐酸盐、碘化钠等离液剂、并采用高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)等分离纯化所述DNA的方法;例如,利用苯酚/氯仿/异戊醇的混合溶液提取纯化的方法;醇沉淀法;利用填充了硅胶的柱进行纯化的方法;利用过滤器的过滤法等,其中,优选醇沉淀法。作为所述醇沉淀法,具体内容如下。即,对于含有水解处理后的DNA的溶液10μL,通常添加40~110μL的醇、30~100μL的缓冲液,进行离心分离。离心分离后,除去上清液,用醇进行洗涤,从而能够对DNA进行分离纯化。在添加上述醇及缓冲液时,为了易于除去分离后的上清液,可以对含有DNA的溶液10μL添加0.1~1μL的Ethachinmate(乙醇沉淀核酸载体)、糖原。作为上述醇,可举出乙醇、异丙醇、丁醇等,特别优选异丙醇。如果使用异丙醇,则能够高效地仅使DNA沉淀,能够高效地进行反应。作为上述缓冲液,例如,可举出MES、HEPES等的Good’s缓冲液;磷酸缓冲液;Tris缓冲液;甘氨酸缓冲液;硼酸缓冲液;碳酸氢钠缓冲液等,其中,优选MES、HEPES等的Good’s缓冲液;Tris缓冲液等,特别优选Tris缓冲液。这些缓冲液的pH通常为7~8,优选为7~7.5,作为缓冲液中的缓冲剂浓度,通常为0.1~5mol/L的范围,优选为0.1~2mol/L的范围。上述离心分离只要是本领域中通常采取的方式,就没有特别的限定,通常,在12000~22000g的条件下进行10~30分钟离心分离。作为上述亚硫酸氢盐反应中的在碱存在的条件下进行的脱磺酸化反应,可举出与上述单链化处理一项中的碱处理相同的方法,也可举出相同的优选方式。具体而言,例如,可以如下所述地进行。即,对水解后的溶液10μL、或水解处理后进行纯化处理的溶液10μL,通常添加0.5~3mol/L碱水溶液1~10μL,优选添加1~5μL,将反应溶液的pH设为11~14,优选设为12~14,在通常为25~70℃、优选为30~50℃的温度条件下,通常加热5~60分钟,优选加热5~30分钟,从而进行脱磺酸化反应。下面,说明上述亚硫酸氢盐反应的优选具体例。即,例如,使用DNA提取试剂盒等从目标细胞中提取DNA,将1μg的DNA溶解在例如灭菌水5~15μL中。在该溶液3~5μL中,添加例如2~5mol/L的亚硫酸氢钠(pH5.0~7.0)50~100μL以及由通式[1]~[8]表示的化合物或含有这些化合物的水溶液1~12μL,以使在由通式[1]~[8]表示的化合物为液体的情况下,反应溶液中的浓度成为3~10%,在由通式[1]~[8]表示的化合物为固体的情况下,反应溶液中的浓度成为1~1000mmol/L,在80~100℃的温度条件下加热60~120分钟。通过该反应,基因组DNA成为单链DNA,能够将该单链DNA中的胞嘧啶进行磺酸化的同时,将被磺酸化的胞嘧啶水解。然后,以40:60~60:40比例、优选以40:60~50:50的比例分别添加水解后的溶液的5~10倍的1mol/L的Tris缓冲液(pH7.0~8.0)和异丙醇,使水解后的DNA沉淀。此时,如果添加1~3μL的Ethachinmate、糖原,则容易确认DNA的沉淀。接着,在12000~20000g的条件下进行10~20分钟的离心分离,除去上清液,用乙醇洗涤得到的DNA。由此,能够提取纯化水解后的DNA。进一步地,将得到的DNA1μg溶解在例如灭菌水30~40μL中,在该溶液中添加1~3mol/L的氢氧化钠5~20μL,在30~40℃的温度条件下反应20~60分钟,进行脱磺酸化。接着,如果有需要,采用例如市售的试剂盒等除去低分子量DNA并进行纯化。由此,完成了本发明的亚硫酸氢盐反应,得到基因组DNA中的非甲基化胞嘧啶被高效转化为尿嘧啶的DNA(以下,有时简称为尿嘧啶化DNA)。[具有本发明的目标碱基序列的DNA的取得]作为由进行了亚硫酸氢盐反应的基因组DNA取得具有本发明的目标碱基序列(由序列号1表示的碱基序列中的一部分或全部组成的碱基序列)的DNA的方法,使用设计成对具有本发明目标碱基序列的DNA进行扩增的引物,使上述尿嘧啶化DNA进行PCR反应,通过该方法,能够将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶,能够得到具有目标碱基序列的DNA的扩增产物。上述PCR反应可以按照本领域公知的方法、例如NucleicAcidsResearch,1991,Vol.19,3749,BioTechniques,1994,Vol.16,1134-1137中记载的方法进行,具体如下所述地进行:即,在作为模板的尿嘧啶化DNA的核酸量1~100ng中,分别添加通常为0.1~100pmol、优选为0.1~50pmol的两种引物,并添加通常为1~10U、优选为2.5~5U的DNA聚合酶、以及通常为0.01~20μmol、优选为0.01~10μmol的四种混合脱氧核糖核苷三磷酸(DeoxyribonucleosideTriphosphate,dNTPs),在pH7~9的N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)缓冲液、Tris-盐酸缓冲液等缓冲液中,例如,将(1)93~98℃、1~10分钟→(2)93~98℃、10~30秒→(3)50~60℃、10~30秒→(4)68~72℃、30秒~5分钟作为一次循环,进行20~40次循环,从而能够扩增得到尿嘧啶化DNA。另外,根据所使用的DNA聚合酶,在实施上述循环后,可以在68~72℃的温度条件下加热1~5分钟以附加3’腺嘌呤。在上述PCR反应中,优选在反应后采用本领域中常用的纯化方法、例如利用苯酚/氯仿/异戊醇混合溶液提取、醇沉淀、柱纯化、利用过滤器过滤等方法来纯化得到的DNA。另外,更优选在上述纯化后提取具有目标碱基对(bp)的DNA。作为该提取方法,可举出本领域公知的方法,例如,采用琼脂糖凝胶电泳的方法、采用液相色谱法、采用基因工程实验室手册增订版,1990,27-28中记载的采用聚丙烯酰胺凝胶等电泳的方法等。另外,对于如上所述地采用PCR反应而得到的DNA(PCR产物),为了得到更多的量,进一步地,可以在相同的条件下进行PCR反应。作为上述PCR反应中的两种引物,只要设计成对具有本发明的目标碱基序列的DNA进行扩增的引物即可。核苷酸数通常为20~45,优选为22~40,更优选为25~35。作为两种引物的具体例,例如,可举出以下引物。正向引物GGTTTGGTTAAGTGTTTGGTTAGGGG(序列号4)GTAGTTAGTTTTAGTATTTAGTTTTTGG(序列号5)反向引物CCTAACTACCCCCACTAATTCCCACTC(序列号6)CCCTCTCTACTTCTCTCTCCTACCTTCTC(序列号7)作为上述PCR反应中的DNA聚合酶,可以是本领域中常用的任意DNA聚合酶,优选具有5’→3’聚合酶活性的DNA聚合酶,其中,更优选具有核酸外切酶活性但不具有3’→5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。具体而言,例如,优选KAPA2G聚合酶等突变型TaqDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、TthDNA聚合酶,其中,特别优选KAPA2G聚合酶。只要上述PCR反应中的dNTPs是本领域中常用的四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的混合物,就没有特别限定。下面,说明具有本发明的目标碱基序列的DNA的取得方法的优选具体例。即,首先,如上述[亚硫酸氢盐反应]一项中所述,对基因组DNA进行单链化处理后,进行亚硫酸氢盐反应,得到尿嘧啶化DNA。然后,使用设计成对具有本发明的目标碱基序列的DNA进行扩增的引物,使得到的尿嘧啶化DNA进行PCR反应。具体而言,在含有通过亚硫酸氢盐反应得到的尿嘧啶化DNA1~100ng的溶液1~3μL中,添加作为扩增对象的1~10μmol/L的DNA正向引物(例如,GTAGTTAGTTTTAGTATTTAGTTTTTGG:序列号5)5~10μL、作为扩增对象的1~10μmol/L的DNA反向引物(例如,CCCTCTCTACTTCTCTCTCCTACCTTCTC:序列号7)5~10μL、1~5mmol/L的四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的混合溶液5~10μL、以及1~5U的KAPADNA聚合酶10~20μL,例如,将93~98℃、1~10分钟→93~98℃、10~30秒→50~60℃、10~30秒→68~72℃、68~72℃、30秒~5分钟作为一次循环,进行20~40次循环。由此,尿嘧啶化DNA被扩增,能够得到非甲基化胞嘧啶被转化为尿嘧啶的、具有本发明的目标碱基序列的DNA(以下,有时简称为尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA)。另外,为了使用TA克隆法作为将后述的尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA插入载体的方法,当利用DNA聚合酶在3’末端的腺嘌呤附加活性时,可以在上述循环反应后进一步在68~72℃的温度条件下反应30秒~5分钟。然后,采用例如琼脂糖凝胶或未改性聚丙烯酰胺凝胶将所述被扩增的DNA进行电泳,提取具有目标链长的DNA。需要说明的是,根据需要,可以通过利用例如苯酚/氯仿/异戊醇混合溶液进行提取等方法来纯化得到的DNA。[-CG-序列中胞嘧啶的甲基化率的测定及癌变的判定方法]作为-CG-序列中胞嘧啶的甲基化率的测定,采用测序仪等对尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA进行碱基序列分析后,将得到的碱基序列与正常的碱基序列作比较,测定本发明的目标碱基序列的-CG-序列中的甲基化胞嘧啶数或本发明的目标碱基序列中的特定CG-序列中胞嘧啶的甲基化数,基于所述值计算甲基化率,从而测定了-CG-序列中胞嘧啶的甲基化率。在癌变的判定方法中,如果上述甲基化率为30%以上,优选为40%以上,更优选为50%以上,则判定为细胞癌变。当本发明的目标碱基序列为序列号2所示的碱基序列或序列号3所示的碱基序列时、或者当测定图7中或的-CG-序列中的胞嘧啶的甲基化时,如果甲基化率为40%以上,优选为50%以上,更优选为60%以上,则能够判定为细胞癌变,能够更高精度地判定癌症。作为上述碱基序列的解析,只要采用本领域中常用的碱基序列的分析方法,就没有特别限定,例如,可以按照基因工程实验室手册、基因工程手册等中记载的荧光染料终止法(FluorescenceDyeTerminatorMethod)、桑格双脱氧链终止法(SangerMethod)等常规方法进行。具体而言,例如,将尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA插入载体,将得到的重组载体转化入感受态细胞,培养该感受态细胞,由此提取包含尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA的质粒,使用该质粒,通过例如测序仪等解读,由此进行上述碱基序列的分析。作为将上述尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA插入载体的方法,具体而言,例如,可举出:采用T4DNA聚合酶等将质粒、粘粒、噬菌粒等载体以及被尿嘧啶化的具有目标碱基序列的DNA进行平滑末端化后,采用T4DNA连接酶将尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA插入载体的方法;在尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA中附加腺嘌呤(A),并采用T4DNA连接酶将附加有该腺嘌呤的、尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA插入附加有胸腺嘧啶碱基的载体的TA克隆法等。其中,优选不需要采用限制性酶将插入的DNA与载体切断的简单的TA克隆法。作为该TA克隆法,例如,具体如下所述地进行。即,对PCR反应后的尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA100ng,添加1~5U的TaqDNA聚合酶,在55~75℃的温度条件下反应10~30分钟,在尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA的3’末端附加腺嘌呤。另外,如果进行PCR反应时使用具有在3’末端附加腺嘌呤的活性的DNA聚合酶,则不需要上述附加腺嘌呤的工序。另外,在进行该反应时,对尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA100ng,可以在反应液中添加0.01~20nmol的dATP,而在将PCR反应溶液直接用于TA克隆的情况下,由于残留有dATP,因此,不需要添加dATP。另外,对于附加有腺嘌呤的、尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA,优选在合成反应后通过利用苯酚/氯仿/异戊醇混合溶液提取、醇沉淀、柱纯化、利用过滤器过滤等的方法,对得到的DNA进行纯化。然后,对附加有腺嘌呤的、尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA10~100ng,加入附加有胸腺嘧啶碱基的大肠杆菌转化用载体和T4DNA连接酶300~3000U,在10~40℃的温度条件下反应30~90分钟,从而能够得到插入了尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA的重组载体。作为将上述重组载体转化入感受态细胞的方法,例如,可举出在35~45℃的温度条件下加热20~90秒的热冲击法、施加1.5~2.5kV的电脉冲的电穿孔法等。作为此处所使用的感受态细胞,可以使用通常使用的大肠菌、枯草菌等中的任意细胞,可以将上述用量适当地设定在常用的范围内。作为上述感受态细胞的培养,例如,在含有30~150μg/ml的氨苄西林的LB琼脂培养基、或含有30~150μg/ml的氨苄西林的M9琼脂培养基等培养基上,在30~40℃的温度条件下,培养12~20小时,由此来进行。另外,作为上述培养基,只要含有作为微生物的营养源的碳源、氮源、无机盐类、作为生长因子的酵母膏等,并能有效地进行转化体的培养,就可以使用天然培养基、合成培养基等中的任意培养基。作为上述碳源,可举出葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉等碳水化合物;乙酸、丙酸等有机酸;乙醇、丙醇等醇类。作为该氮源,可举出氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐或其他含氮化合物,除此以外,还可举出蛋白胨、胰蛋白胨、肉提取物、玉米浆等。作为无机盐类,可举出磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。作为从培养的感受态细胞中提取含有尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA的质粒的方法,可以通过下述方式进行,例如,首先采用菌落PCR法,对菌落中的含有尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA的质粒来源的DNA进行扩增,然后,采用例如电泳法确认目标质粒是否在菌落中扩增,并从已确认了目标质粒的插入的菌落中提取目标质粒。作为该菌落PCR法,例如,如下所述地进行。即,在培养的菌落中,分别添加通常为0.1~100pmol、优选为0.1~50pmol的用于检测本发明的目标碱基序列的两种PCR引物,添加通常为0.01~20nmol、优选为0.01~10nmol的四种混合脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、以及通常为1~10U、优选为1~5U的DNA聚合酶,在pH7~9的Tricine缓冲液、Tris-盐酸缓冲液等缓冲液中,例如,将(1)93~98℃、1~10分钟→(2)93~98℃、10~30秒→(3)50~60℃、10~30秒→(4)68~72℃、30秒~5分钟作为一次循环,进行20~40次循环反应,由此进行。作为上述两种引物,可举出设计成能够对目标DNA进行扩增的引物,即,可举出含有尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA的全部或一部分的引物、或者位于被插入的尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA两端的来自载体的序列等,优选位于尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA两端的来自载体的序列。即,在本发明的DNA扩增方法和本发明的甲基化胞嘧啶检测方法中,由于非甲基化胞嘧啶被尿嘧啶化,且在PCR反应时该尿嘧啶被读作胸腺嘧啶,因此,在胞嘧啶全部为非甲基化胞嘧啶的情况下,尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA由三种碱基构成。因此,为了高效地进行PCR反应,优选能够由四种碱基构成的、位于尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA两端的来自载体的序列。上述引物的核苷酸数通常为12~30,优选为15~25、更优选为18~22。作为上述DNA聚合酶,例如,可以是本领域中常用的任意DNA聚合酶,具体而言,例如,可举出TaqDNA聚合酶、TthDNA聚合酶、KODDNA聚合酶等,其中,优选TaqDNA聚合酶、KODDNA聚合酶等。作为在上述菌落PCR反应后进行的电泳法,可以是本领域中常用的、能够根据迁移率求出碱基数的任意凝胶电泳法,优选琼脂糖凝胶电泳法。需要说明的是,对于该电泳法中的电泳条件,可按照公知的方法适当地设定。作为从上述菌落部中提取质粒的方法,例如,可以采用基因工程实验室手册(丸善株式会社)、基因工程手册(羊土社株式会社)等中记载的碱性SDS法等公知的质粒提取方法,在振荡培养后提取质粒。需要说明的是,可以采用市售的试剂盒进行质粒的提取。对于上述振荡培养中的培养基而言,未使用琼脂而使用溶液,除此以外,能够使用与感受态细胞的培养一项中记载的培养基相同的培养基,优选的培养时间、培养温度也与感受态细胞一项中记载的范围相同。通过将由上述碱基序列分析得到的、进行了亚硫酸氢盐反应的碱基序列与胞嘧啶未被甲基化的正常DNA的碱基序列进行比较,能够检测甲基化胞嘧啶。即,由于在本发明的亚硫酸氢盐反应中除了甲基化胞嘧啶以外的全部胞嘧啶(非甲基化胞嘧啶)均被尿嘧啶化,因此,通过在得到的碱基序列中找出未被尿嘧啶化的胞嘧啶,能够检测甲基化胞嘧啶。用本发明的目标碱基序列的-CG-序列中的甲基化胞嘧啶的数量除以-CG-序列中的胞嘧啶的数量,从而计算甲基化率。如果上述甲基化率为30%以上、优选为40%以上、更优选为50%以上,则判定为细胞癌变。另外,当本发明的目标碱基序列为序列号2所示的碱基序列或序列号3所示的碱基序列时、或者当测定图7中或的-CG-序列中的胞嘧啶的甲基化时,如果甲基化率为40%、优选为50%、更优选为60%以上,则能够判定为癌变,能够更高精度地判定癌症。下面,对本发明的癌变的判定方法的优选例进行说明。即,首先,如[亚硫酸氢盐反应]和[具有本发明的目标碱基序列的DNA的取得]的项目中所述,对基因组DNA进行单链化处理,依次进行亚硫酸氢盐反应、PCR反应,得到尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA。在含有所述尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA10~100ng的灭菌水1~5μL等中,加入附加有胸腺嘧啶碱基的10~100ng大肠杆菌转化用载体1~3μL和300~3000U的T4DNA连接酶1~3μL,在10~20℃的温度条件下反应30~240分钟,得到插入有尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA的重组载体。另外,在进行PCR反应时使用不具有腺嘌呤附加活性的聚合酶、例如α-DNA聚合酶时,在插入载体前,在尿嘧啶化后的具有目标碱基序列的DNA中附加腺嘌呤。作为该腺嘌呤附加方法,可以通过下述方式进行,例如,在含有100ng~1μg的具有本发明的目标碱基序列的DNA的PCR反应溶液5~10μL中,添加1~5U的TaqDNA聚合酶0.5~1μL,在55~75℃的温度条件下反应10~30分钟,使腺嘌呤附加在具有本发明的目标碱基序列的DNA的3’末端。另外,优选在腺嘌呤反应后进行纯化操作。在得到重组载体后,在108~109个感受态细胞中添加得到的重组载体10~100ng,在35~45℃的温度条件下加热20~90秒,进行转化。进一步地,例如,在含有30~150μg/ml氨苄西林、1%(w/v)的胰蛋白胨、0.5%(w/v)的酵母提取物、1%(w/v)的氯化钠的琼脂培养基上,在30~40℃的温度条件下培养12~20小时。然后,将得到的培养物进行菌落PCR。具体而言,在溶解了菌落的灭菌水1~10μL中,分别添加1~5μL的设计成能够对目标DNA进行扩增的1~10μmol/L的两种PCR引物,通常添加1~5mmol/L的四种混合脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)1~5μL、以及1~5U的TaqDNA聚合酶0.5~1μL,在pH7~9的Tricine缓冲液、Tris-盐酸缓冲液等缓冲液中,例如,将(1)93~98℃、1~10分钟→(2)93~98℃、10~30秒→(3)50~60℃、10~30秒→(4)68~72℃、30秒~5分钟作为一次循环,进行30~40次循环反应。然后,采用琼脂糖凝胶电泳法,确认菌落中目标DNA的存在,选取已确认了目标DNA的存在的菌落。用LB培养基对选取的菌落进行振荡培养后,使用例如市售的质粒提取试剂盒等从培养液中提取目标DNA,采用测序仪等对DNA的碱基序列进行解读。将得到的碱基序列与胞嘧啶未被甲基化的正常碱基序列进行比较,测定本发明的目标碱基序列中-CG-序列的胞嘧啶的甲基化率。根据上述甲基化率能够判定细胞的癌变率。下面,通过实施例等进一步详细说明本发明,但本发明并不受这些实施例等的任何限定。实施例实施例1正常细胞中的FOXB2基因的甲基化分析(1)基因组DNA的提取使用下述五种细胞,按照试剂盒中所附的说明书,通过QuickGeneSPDNA组织提取试剂盒(仓敷纺织株式会社)提取基因组DNA。人正常皮肤成纤维细胞(hiPS,细胞名称:201B7)人正常皮肤成纤维细胞(HDF)人正常肺成纤维细胞(WI-38)正常人肺二倍体细胞(CCD-8Lu)正常人胚胎细胞(HE23)(2)亚硫酸氢盐反应在(1)中得到的五种基因组DNA和作为来自健康人全血的基因组DNA的人基因组DNA(普洛麦格公司(プロメガ社)制造)各400ng中,加入蒸馏水,配制10μL水溶液。接着,使用EpiSight亚硫酸氢盐转化试剂盒(和光纯药工业株式会社制造),按照说明书分别进行亚硫酸氢盐反应。(3)FOXB2启动子区域的扩增(PCR反应)在(2)中得到的亚硫酸氢盐反应产物1μL中分别加入蒸馏水17.3μL、BlendTaq用10×缓冲液(10×bufferforBlendTaq)(东洋纺公司(東洋紡))2.5μL、2mM的dNTPs(东洋纺公司)2μL、BlendTaq-Plus(东洋纺公司)0.2μL(0.5U)、正向引物(10μM)1μL以及反向引物(10μM)1μL,进行混合,制成反应溶液。各引物的碱基序列如下所示。通过这些引物扩增的链长为493bp。正向引物:GGTTTGGTTAAGTGTTTGGTTAGGGG(序列号4)反向引物:CCTAACTACCCCCACTAATTCCCACTC(序列号6)将上述反应溶液分别设置在热循环仪中,在下述条件下进行反应。94℃2分钟将94℃20秒→55℃20秒→72℃30秒作为一次循环,循环36次72℃2分钟然后,在PCR扩增产物25μL中,分别加入5μL的6×双色上样缓冲液(6×LoadingBufferDoubleDye)(日本基因株式会社(ニッポンジーン)制造),进行混合,采用1.5%琼脂糖凝胶将混合物进行电泳。电泳后用GelRed核酸凝胶染色液(和光纯药工业株式会社制造)染色,使用QIAquick凝胶回收试剂盒(凯杰公司(キアゲン))按照试剂盒中所附的说明书回收PCR扩增产物。(4)用于在PCR扩增产物中附加限制性酶识别位点的PCR反应在(3)中得到的PCR扩增产物1μL中分别加入蒸馏水17.3μL、BlendTaq用10×缓冲液(10×bufferforBlendTaq)(东洋纺公司)2.5μL、2mM的dNTPs(东洋纺公司)2μL、BlendTaq-Plus(东洋纺公司)0.2μL(0.5U)、正向引物(10μM)1μL以及反向引物(10μM)1μL,进行混合。正向引物使用在上述PCR正向引物中附加了限制性酶识别位点(HindIII:序列中的划线部分)而成的下述序列,反向引物使用在上述PCR反向引物中附加了限制性酶识别位点(BamHI:序列中的划线部分)而成的下述序列。正向引物:TTACCATAAGCTTGGTTTGGTTAAGTGTTTGGTTAGGGG(序列号8)反向引物:TAATTAAGGATCCCCTAACTACCCCCACTAATTCCCACTC(序列号9)将上述反应溶液分别设置在热循环仪中,在下述条件下进行反应。94℃2分钟将94℃20秒→55℃20秒→72℃30秒作为一次循环,循环10次72℃2分钟然后,在PCR扩增产物25μL中,分别加入6×双色上样缓冲液(6×LoadingBufferDoubleDye)(日本基因株式会社制造)5μL,进行混合,采用1.5%琼脂糖凝胶将混合物进行电泳。电泳后用GelRed核酸凝胶染色液(和光纯药工业株式会社制造)染色,使用QIAquick凝胶回收试剂盒(凯杰公司制造)按照试剂盒中所附的说明书回收PCR扩增产物。(5)限制性酶的处理在(4)中得到的PCR扩增产物43μL中,分别加入10×缓冲液(日本基因株式会社制造)5μL、HindIII(日本基因株式会社制造)1μL以及BamHI(日本基因株式会社制造)1μL并混合后,在37℃的温度条件下孵育1小时。同样地,在pUC19(日本基因株式会社制造)500ng中加入蒸馏水,配制成43μL,进一步地,加入HindIII(日本基因株式会社制造)1μL和BamHI(日本基因株式会社制造)1μL并混合后,在37℃的温度条件下孵育1小时。然后,加入结合缓冲液(5.5M胍盐酸盐(和光纯药工业株式会社制造)、20mM的Tris-盐酸pH6.6(和光纯药工业株式会社制造))250μL并混合后,转移至EconoSpin(基因设计株式会社(ジーンデザイン)制造)中,在12000×g、室温的条件下,进行1分钟的离心分离,除去管中的溶液。然后,添加洗涤缓冲液(2mM的Tris-盐酸pH7.5(日本基因株式会社制造)、80%乙醇(和光纯药工业株式会社制造))500μL,在12000×g、室温的条件下,进行1分钟的离心分离,除去管中的溶液。进一步地,在12000×g、室温的条件下,进行1分钟的离心分离后,换成新管,添加洗脱缓冲液(10mM的Tris-HClpH8.5)(日本基因株式会社制造)25μL,在12000×g、室温的条件下,进行1分钟的离心分离。由此,回收经限制性酶处理的PCR扩增产物和pUC19。(6)转化在经限制性酶处理的PCR扩增产物1μL中,加入经限制性酶处理的pUC19、DNA连接试剂盒(MightyMix)(宝生物工程株式会社(タカラバイオ)制造)2μL,混合,在16℃的温度条件下孵育1小时。然后,将总量4μL转化入ECOSTM大肠杆菌DH5α感受态细胞(日本基因株式会社制造),涂抹于添加有氨苄西林的LB琼脂培养基上。然后,在37℃的温度条件下,将菌落在添加有氨苄西林的LB琼脂培养基上培养16小时。进一步地,使用质粒试剂盒SII(仓敷纺织株式会社)按照试剂盒中所附的说明书进行质粒的提取。通过宝生物工程株式会社的序列分析委托服务,使用所得到的质粒分析碱基序列。基于碱基序列的解读结果,将表示CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶和甲基化胞嘧啶中的哪一种的图示于图1~6中。需要说明的是,图中的○表示CpG二核苷酸中的胞嘧啶为非甲基化胞嘧啶,●表示CpG二核苷酸中的胞嘧啶为甲基化的胞嘧啶。将附图与所用的细胞或全血的关系示于表1中。表1结果细胞或全血图1人正常皮肤成纤维细胞(hiPS)图2人正常皮肤成纤维细胞(HDF)图3人正常肺成纤维细胞(WI-38)图4正常人肺二倍体细胞(CCD-8Lu)图5正常人胚胎细胞(HE23)图6白细胞(全血)另外,在图7记载的FOXB2启动子区域的碱基序列(PCR扩增区域,基因银行登记号AL353637:106566-107058:序列号10)中记载图1~6中带圈数字的胞嘧啶的位置。将基于图1~6的结果计算的、相当于序列号2的范围(图中的)的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率、相当于序列号1的范围(图中的)的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率与实施例2的结果一同示于表3中。实施例2癌细胞中的FOXB2基因的甲基化分析使用下述表2中的二十五种癌细胞,通过QuickGeneSPDNA组织提取试剂盒(仓敷纺织株式会社)按照试剂盒中所附的说明书提取基因组DNA。与实施例1中(2)~(6)记载的方法同样地进行后续处理,分析各种癌细胞的FOXB2基因的碱基序列。基于碱基序列的解读结果,将表示CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶和甲基化胞嘧啶中的哪一种的图分别示于图8~32中。需要说明的是,图中带圈数字的胞嘧啶的位置如图7所述。另外,○表示CpG二核苷酸中的胞嘧啶为非甲基化胞嘧啶,●表示CpG二核苷酸中的胞嘧啶为甲基化的胞嘧啶。将附图与所用的细胞的关系示于下述表2中。表2将基于图8~32的结果计算的、相当于序列号2的范围(图7中的)的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率、相当于序列号1的范围(图7中的)的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率示于下述表3中。将相当于序列号3的范围(图7中的)的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率示于下述表4中。表3表4根据上述实施例1的结果可知,如果序列号2或序列号3中存在的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率为20%以下,则能够判定为未癌变的正常细胞,另外,如果序列号1中存在的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率为15%以下,则能够判定为未癌变的正常细胞。即,可知如果甲基化率为30%以上,则能够判定为细胞癌变的可能性大。另外,根据实施例2的结果可知,如果序列号2或序列号3中存在的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率为60%以上,则能够判定为癌变细胞,另外,如果序列号1中存在的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率为50%以上,则能够判定为癌变细胞。由此可知,如果考虑正常细胞中的胞嘧啶的甲基化率至少为20%以下,则能够非常高精度地判定癌变。进一步地,对于二十五种不同的细胞而言,可知通过测定FOXB2基因的同一区域的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率,能够高精度地判定各细胞的癌变。即表明了通过本发明的方法,无论何种癌症均能够进行判定。工业实用性使用本发明的癌症标志物或采用本发明的方法,能够对各种细胞判定细胞的癌变。另外,由于测定特定的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率,因此,能够高精度地判定细胞的癌变。即,能够用于癌症的复发、转移的预防性的判定中。序列表<110>和光纯药工业株式会社<120>癌症标志物及癌症的判定方法<130>1961JP<160>9<170>PatentInversion3.5<210>1<211>150<212>DNA<213>人FOXB2<400>1cgggggaagacgcagagaaggcggcggtaaacctggtgcactccgcccgcgactgtgcgc60gccagtcggcaaccgtcggggccagaagttgccagcttccgagagctgagtaggcccgaa120aggccaaggtcggagacaccaggcaattcg150<210>2<211>57<212>DNA<213>人FOXB2<400>2cggcggtaaacctggtgcactccgcccgcgactgtgcgcgccagtcggcaaccgtcg57<210>3<211>21<212>DNA<213>人FOXB2<400>2CGCGCCAGTCGGCAACCGTCG21<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4ggtttggttaagtgtttggttagggg26<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5gtagttagttttagtatttagtttttgg28<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6cctaactacccccactaattcccactc27<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7ccctctctacttctctctcctaccttctc29<210>8<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8ttaccataagcttggtttggttaagtgtttggttagggg39<210>9<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9taattaaggatcccctaactacccccactaattcccactc40<210>10<211>493<212>DNA<213>人FOXB2<400>10ggtctggctaagtgcctggccaggggcctgcgtccagggcactggaagtcctgctgtcac60tggcctccaggacagcaggcgcaaactcagatttaaagggccagagtctctactgcccag120accttcctcccagccatcttggtctgggtttccctcggacctagaaaaagcaaagaggcc180gggaggaaacacggccccttgccactctcctctgcagccagctccagcactcagtctttg240gccacccgggggaagacgcagagaaggcggcggtaaacctggtgcactccgcccgcgact300gtgcgcgccagtcggcaaccgtcggggccagaagttgccagcttccgagagctgagtagg360cccgaaaggccaaggtcggagacaccaggcaattcggagaaggcaggagagagaagcaga420gagggcctggagggcgagagggcaaagtggcgggactggaggggccgagtgggaattagt480gggggcagccagg493当前第1页1 2 3 
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