作为癌症标志的甲基乙二醛的制作方法
【专利说明】作为癌症标志的甲基乙二醛
[0001] 本发明公开了用于人或动物受试者中癌症的新的、可靠的、灵敏的和便利的操作 诊断和预后试验。发明人在本文中首次证实，具有癌症的受试者的生物样品中甲基乙二醛 (methylglyoxal)(MG)的水平增加与具有代谢活性的癌细胞发育和进展高度正相关。这 一结果强调，癌细胞产生和释放显著高于肿瘤和生物体细胞外液中正常细胞的MG的量，因 此，能够从独特的血样中获得癌症的可靠和灵敏的诊断和预后试验。本发明由此涉及用于 早期检测和诊断癌症以及用于在具有癌症的受试者中预后评价、监测和作出治疗决定的体 外方法；其通过测量MG的存在来进行。
【背景技术】
[0002] 随着在全世界被诊断为癌症病例数量的逐步增长和因该疾病晚期发现导致的死 亡数量持续增高，鉴定用于早期检测和靶向治疗干预的新生物标志（biomarker)被广泛接 受为对癌症预防和经治疗的癌症患者中的更好结果是决定性的。癌症是全世界第二位死亡 率最高的原因，其中肺癌、结肠癌、乳腺癌（女性）、胰腺癌和前列腺癌（男性）最常见。
[0003] 目前，最常用的癌症诊断和预后指示剂基于肿瘤的形态和组织学特征，因为没有 可利用的具有足够用于诊断的灵敏度和特异性的血液生物标志；且仅存在少量生物标志用 于癌症的治疗监测和预后评价。
[0004] 美国食品与药品监督管理局（FDA)已经将生物标志定义为分子特征，它被客观测 量和评价并且指示正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理学响应。这样的生物标志 可以由肿瘤自身或身体对正常细胞转化成癌性的恶性压力作出响应而产生。根据美国国立 癌症研宄所（NCI)，生物标志可以用于癌症筛查、风险度评价、疾病的早期诊断、监测、预后 评价、作出治疗决定和预测对疗法的响应。
[0005] 然而，限制这种肿瘤学生物标志潜力的主要挑战在于，癌症发生和加速增长和肿 瘤发展是复杂的过程，其涉及各种异常遗传和外遗传的分子事件和细胞相互作用。
[0006] 恶性转化导致特异性和非特异性表型细胞特征（signature)改变，由此导致生物 体中癌细胞的克隆选择和进展。此外，癌症可以因暴露于多种和不同环境致癌剂，例如化学 物质、福射和/或微生物中导致；尤其是在易感宿主中（Belpomme等人，Environ Res 2007 ; Irigaray 和 Belpomme, Carcinogenesis 2010)〇
[0007] 作为致癌过程的如此复杂性的结果，肿瘤在病因学和发病机制中广泛改变，因此， 癌症由超过200种侵害超过60种人体器官的不同的疾病组成。这种复杂性也是为什么尽 管许多生物测定寻找临床肿瘤终点与生物标志之间的相关性，但是仍然几乎没有临床有用 的生物标志（这些生物标志有助于肿瘤科医生作出决定和患者护理）的原因，和无关键的 可利用的可以检测所有甚至许多类型癌症的单一生物标志的原因。本发明通过提供新的单 一生物标志协调了许多这些局限，所述生物标志允许通过在患者/受试者的生物样品中进 行简单测量来检测许多类型的癌症。这种测量非常具有再现性；以便检测癌症，甚至在早期 阶段。
[0008] 本发明基本上在于测量代谢副产物甲基乙二醛（MG)的产生水平，其通过检测和 定量来自受试者的生物样品中这种分子的量来进行。
[0009] 图1是显示真核细胞中糖酵解代谢过程和甲基乙二醛（MG)形成的示意图。
[0010] 能量的完整糖酵解途径是厌氧的（不使用氧）。需氧条件中的正常细胞进入Krebs 三羧酸（TCA)循环而产生腺苷三磷酸（ATP);而仍然在需氧条件下，Warburg效应引导许多 癌细胞而不是进入Krebs TCA，从而增加糖酵解（即"需氧糖酵解"）。在糖酵解过程中，MG 途径绕过传统的糖酵解恩布顿-迈耶霍夫_帕纳斯途径并且是代谢盲路（cul-de-sac);因 此，这种途径导致作为废物终产物/副产物的MG和D-乳酸盐形成，而糖酵解恩布顿-迈耶 霍夫-帕纳斯途径导致丙酮酸盐形成，然后在需氧条件中导致Krebs TCA或在厌氧条件中 由丙酮酸盐形成L-乳酸盐。作为在许多癌细胞中的情况，Krebs TCA或呼吸链中的任何缺 陷通过二羟丙酮磷酸盐形成增加来增加糖酵解以补偿ATP产生和随后的MG形成。
[0011] 图Ibis显示人癌细胞系（HCT16)的培养基中MG的产生取决于在培养基中存在低 或高葡萄糖浓度。通过使用液相色谱法-串联质谱法（LC-MS/MS)分析对条件培养基（CM) 进行MG定量。相对于在低葡萄糖条件而言，在高葡萄糖条件下，癌细胞产生10倍更高的 MG，发现如下启示，癌细胞的MG合成和释放直接取决于葡萄糖消耗和代谢。
[0012] 图2显示通过使用直接组织分析、用MALDI-T0F/T0F质谱法在恶性PRO细胞克隆 中的MG产生。PRO细胞克隆最初得自由1，2_二甲肼施用诱导的结肠腺癌。在不染色和分 别使用扫描1和2中的苏木精-曙红-Safran(HES)染色后表示肿瘤。用MALDI-T0F/T0F 质谱法的MG瘤内检测表示在分别得自91Da和118Da 2MQX分子碎片分析的扫描3和4中。 注意在坏死区中，在1和2中肿瘤的中部和下部中占优势，3和4中的MG显然较少被检测 到，而显然主要在用HES高度着色的一些区域中检测到。
[0013] 图3显示具有癌症的患者中MG血液水平与肿瘤阶段之间的显著正相关性。无论 癌症阶段如何，大多数MG血液水平值均高于0. 06 y M的MG的正常（非癌性的）对照值（p =0. 0109)，表明血液中的MG的全身测量是诊断癌症的有效工具；关键是能够便利和早期 检测和筛查。
[0014] 图4显示癌症患者与对照组（正常受试者或血糖正常的（经治疗的）2型糖尿病 患者）之间血液MG与血糖比率（MG/G指数）的差异（p〈0. 01)。注意在正常对照组与具有 正常血糖的经治疗的2型糖尿病的受试者之间的MG血液水平无显著性差异。
[0015] 图5公开了植入PRO致瘤的癌性结肠细胞后发育的BD-IX大鼠中MG血液水平与 肿瘤体积之间的显著正相关性（p〈〇. 001)。PRO和REG细胞克隆最初来源于BD-IX大鼠中 1，2-二甲肼诱导的单一结肠腺癌。
[0016] 图6显示当皮下注入同系宿主时，PRO细胞如亲代细胞诱导进行性肿瘤，而REG细 胞诱导在3周后退化的肿瘤。PRO细胞的肿瘤移植物与肿瘤体积的恒定进展相关，因此，注 意到MG血液水平与肿瘤体积之间的正相关性；移植后3周，存在MG血液水平恒定进展。移 植后3周REG癌细胞的肿瘤移植物被排斥，而血液中的MG在整个实验期间保持在低水平。 通过比较使用PRO致瘤的癌细胞克隆得到的结果（图5)，这启示活跃进展的癌症且更具体 地是增殖性致瘤的癌细胞合成大量MG ;而无进展的癌症、更具体地是无增殖性无致瘤的癌 细胞则不能。
[0017] 图7显示在癌症患者（B)中，MG血液水平与体重指数（BMI) (p = 0? 0064)显著成 负相关性；而MG与BMI在正常受试者中不存在相关性（A)。这表明MG由癌细胞产生。
[0018] 图8显示在癌症患者中，胰岛素/葡萄糖比率（I/G)指数与MG血液水平之间存在 显著的负相关性，而在正常健康受试者中的I/G指数保持恒定。因此，2种曲线的交叉点允 许临界点的个体化，此时〇. 2 y M血液MG水平称作"恶病质-相关的对照值"，高于它，胰岛 素抵抗更高，而胰岛素分泌更低（相对于正常受试者而言）；使得癌症患者正在进入恶病质 或严重前-恶病质。
[0019] 表1显示与用作对照组的正常受试者和具有正常血糖的经治疗的2型糖尿病的患 者相比，癌症患者中的MG血液水平平均值（土标准误差和置信区间）（以yM计）。
[0020] 表2显示根据肿瘤类型与用作对照组的正常受试者和具有正常血糖的经治疗的2 型糖尿病的患者相比，癌症患者中的MG血液水平平均值（土标准误差和置信区间）（以yM 计）。
[0021] 表3公开了根据临床响应在治疗的癌症患者中MG血液水平的平均值（土标准误 差）（以UM计）；即，完全响应、部分响应或稳定/进行性疾病，正如通过使用成像技术的 直接临床肿瘤和/或肿瘤测量值确定的。在具有如通过传统成像技术确定的显著完全临床 响应的2位患者中，MG血液水平高于正常值。在这2位患者中，癌症在3和7个月后复发。
[0022] 表4公开了根据其BMI在治疗的不同癌症患者中MG血液水平的平均值（土标准 误差）（y M)。3种BMI类别之间的差异具有高度的统计学显著性，且前-恶病质或恶病质 状态（BMK18)与显著更高的MG血液水平相关（相对于具有超重/肥胖癌症（BMI>25)的 患者而言）。
[0023]生物样品:本文所用的术语"生物样品"是指得自患者或正常个体的各种样品类 型，其用于诊断性监测试验。所述生物样品包括任意的细胞外液，例如血液、血清、血浆、尿 或其它液体样品，例如唾液、腹膜液或胸膜液、脑脊髓液、胃液或结肠直肠流体、淋巴液、滑 液、间隙液、羊膜液、生理分泌物、泪液、粘液、汗液、乳、精液、阴道分泌物和来自溃疡和其它 表面渗出的流体。它们也可以是实体组织，例如肿瘤或器官和例如得自子宫颈、骨髓、淋巴 结等的细胞涂片。术语"生物样品"还包括构成生物体内胞外隔室的胞外基质和细胞外液。 它不仅包括临床样品，而且包括细胞培养物和组织培养物和来源于它们的细胞及其子代。
[0024]甲基乙二醛:在本发明中，"甲基乙二醛"是指如下发现，癌细胞产牛并目.释放显著 高于正常细胞所产生和释放的量的甲基乙二醛（MG)，由此可以在生物体的肿瘤和细胞外液 中（特别是在MG从癌细胞中释放后的外周血液中）测量和定量MG。
[0025] 通过体外测量自然存在于生物体中的游离MG部分或通过测量游离MG的总量证 实样品中的MG，所测得的游离MG总量相当于自然存在于样品中的除可以从通过已使用 与Chaplen类似或相同的技术处理样品后可逆配体结合的MG中回收的MG之外的游离 MG(Chaplen 等人，Anal Biochem 1996 ;Chaplen 等人.，PNAS 1998)。最初研发这样的方法 是为了测量胞内可逆配体-结合的MG。
[0026] 因此，通过本发明方法测量其水平的MG相当于在个体肿瘤或体液中、更特别是在 外周血液中测量的游离MG分子水平，其原因在于，它可以使得临床应用生物标志极为简 便。然而，如上所示，本发明的方法不仅唯一依赖于自然存在于生物体肿瘤或胞外隔室中的 游离MG的测量值，而且还依赖于在体外处理可逆配体-结合的MG之后回收的游离MG的测 量值。然而，当术语"MG"、"MG产生"或"MG产生水平"在本文中未进一步定义使用时，MG 水平相当于被视为自然存在于样品中的游离分子，而不相当于可以从样品中回收的游离MG 总量，不过，其测量值也包括在本发明中。
[0027] 术语"牛物样品"包括其取得后以任意方式操作的样品。
[0028] 可以在MG分析前"处理"所述生物样品，例如通过：由血液制备血浆；从样品中消 除细胞或使得细胞群富集；稀释粘液流体等。本发明的方法可以包括过滤、蒸馏、浓缩、使干 扰化合物失活、细胞裂解；例如通过超声处理、添加试剂、细胞固定或实体组织固定，然后进 行MG分析。所谓MG分析前经处理的样品的实例使用用于回收胞内和/或胞外可逆配体结 合的 MG 的技术（Chaplen 等人，Anal Biochem 1996 ;Chaplen 等人，PNAS 1998)〇
[0029] 受试者、个体、患者:本文所用的术语"受试者"或"个体"是指任意年龄或性别的 无论是健康的还是患有疾病的人（或动物）；而术语"患者"是指具有疾病的受试者或个体， 例如具有癌症或糖尿病的患者。
[0030] 术语'健康#试者'和'健康个体'是指已经通过使用常规的医学检验证实无任 何可检测到的疾病的无症状受试者或个体。更精确地，这些术语是指已经证实无癌症、糖尿 病、慢性尿毒症、动脉高血压和阿尔茨海默病的人。
[0031] 癌症或白血病:这@术语是指肿瘤，其细朐存在异常恶件表塑，其特征在于在牛物 体中主要包括自主生长和细胞增殖调节缺失的严格公认和经验证的标志。近来更精确地综 述和分析了这些标志（Hanahan和Weinberg, Cell 2011)。相反，术语"肿瘤"是指可以存在 恶性或非恶性表型的细胞。术语"良性肿瘤"用于表征这样的肿瘤，其增殖能力保持受限， 因为细胞不包含恶性表型。
[0032] 对有关通过本发明方法鉴定的癌症类型没有特别限制；它们包括实体癌和非实体 癌，包括上皮或非上皮类型。
[0033] 上皮来源的癌症包括所有组织学类型，例如腺癌和鳞状细胞癌；和所有局部化癌， 例如头颈癌（即口腔、舌、口咽、BB、喉等）、支气管和肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺 癌、肝癌（和所有其它消化道类型）、宫颈和子宫内膜癌、卵巢癌、泌尿生殖器癌（前列腺癌、 膀胱癌、肾癌）等。非上皮癌主要在于任意类型的白血病、淋巴瘤、黑素瘤或肉瘤。
[0034] 通过本发明也可以鉴定其它癌症。例如，睾丸癌症、无性细胞瘤、胶质母细胞瘤、星 形细胞瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、儿童癌症和HIV-相关肿瘤等。
[0035] 所谓癌症的"早期检测"在本文中应理解为是指无症状受试者中确定的亚临床的 (无明显可诊断的）显微镜可见的已经具有代谢活性的癌症的检测或鉴定。
[0036] 所谓癌症的"篮查"应理解为是指在无症状个体群体中具有代谢活性的癌症或癌 前期病变的全身检测。
[0037] 所谓癌症的"途逝"应理解为是指在有症状患者中已经具有肉眼可见的进行性癌 症的检测。本发明的检测/诊断方法由此专用于检测所谓的癌前期病变，这些病变可以在 组织活检中证实，但可能不一定发展至确切的具有代谢活性的显微镜可见的癌症。而本发 明易于且可靠地检测到确切增殖和进行性癌症。这可能以亚临床的显微镜可见的病变的形 式发生在无症状受试者中或以更晚期的病变的形式发生在有症状受试者中，然后可以通过 通常可利用的临床诊断工具所证实。由于MG水平涉及发展中的癌细胞的代谢活性，所以本 发明的检测/诊断方法不仅可以用于在无症状受试者中筛查具有代谢活性的癌症，而且可 以用于在有症状受试者中的增殖性癌症的发展，且由此在这样的受试者中评估癌症将临床 进展的可能性；然后可以通过通常可利用的临床工具证实癌症进展。
[0038] 本f所用的术语"MG iH常对照倌"或"MG参比倌"是