筛选分子群的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种筛选分子群的方法。更具体说来，本发明涉及一种筛选分子群的 方法，所述分子对某些令人感兴趣的标记具有高选择性。
【背景技术】
[0002] 所有的生物反应都需要分子间的相互作用。抗体与抗原间以及配体与受体间的相 互作用对于因外在刺激而起始一连串的路径十分关键。辨识相互作用中所涉及的特异分子 对于研宄及制药发展非常重要。
[0003] 举例来说，在人类基因组计划完成后，大多数人类表达基因已得到辨识。然而，在 新兴的蛋白质组学纪元中，蛋白质在这些所揭露的基因中起重要作用。为了可有效地破解 这些蛋白质的谜团，已做了许多努力以产生针对人类基因组中的每一种人类表达基因的至 少一种抗体。抗体因其固有的敏感性及特异性，而成为研宄其一对一关系的标靶蛋白质时 最多功能的工具。然而，错综复杂的其中一个原因在于，当放置于不同的细胞（如癌细胞） 中时，这些蛋白质并非永远以相同的方式表达。许多蛋白质已知在不同的细胞环境中具有 易位能力，因此，其对应的抗体在给定的细胞中可辨识独特的位置。此外，在许多情况下，蛋 白质易位与癌细胞的活化相关。在未来，检测这些活动可能帮助诊断癌症的类型与阶段。在 细胞膜上直接筛选抗原的高通量方法可能发现潜在的治疗标靶以及新的疾病标记。
[0004] 然而，即使已生成了许多有用的抗体，仍有两方面的主要限制，即（1)如何在给定 的细胞中直接发现特异性抗原（如膜或表面标记），及（2)如何快速地识别可识别这些抗原 的有用的抗体。
[0005] 以膜结合蛋白为例，许多膜结合蛋白与特定的疾病状态（如肺癌）相关联，且 常成为引人注意的治疗标靶。膜结合蛋白的系统性与定量分析可增进我们了解其在不 同的疾病状态中，调控生物程序所扮演的角色。在最常被定序的基因组中，估计约有20 到30%的开放阅读框架编码完整的膜结合蛋白（布朗德J. (Blonder，J.)等人，富集完 整膜蛋白以使用液相色谱-串联质谱法进行蛋白质组学分析（Enrichment of integral membrane proteins for proteomic analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry).蛋白质组学研宄杂志（Journal ofProteome Research)，2002. 1(4): 第351-360页；韩D. K. (Han，D. K.)等人，使用同位素编码的亲和标签和质谱法对分化诱导 的微粒体蛋白进行定量图谱化（Quantitative profiling of differentiation-induced microsomal proteins using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry). 自然生物技术（Nature Biotechnology)，2001. 19(10):第946-951页）。然而，由于少量的 膜结合蛋白，膜结合蛋白质组尚未被图谱化且仍具实验挑战性。此外，利用高通量的蛋白质 组学以及以基因芯片为基础的筛选研宄，所辨识出的新颖标靶常常缺乏抗体来确立其位置 及功能，进一步阻碍了研宄者研宄潜在的膜结合蛋白。直接表达分析方法来识别抗体及辨 识受体（表面标记或膜结合蛋白）为必要的。
[0006] 因生理条件的不同，造成随机筛选很耗时且常常不可行。使用单独抗体来筛选新 的受体也不可能，因为其必须要有超过25000种抗体来适用整个基因组。此外，癌细胞常常 具有多种过度表达的受体且同样的标靶蛋白在不同的细胞类型可能有不同的位置布置。因 此，有必要开发一种快速且有效的方法，在同一时间中解决这些问题。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种小群体表达筛选以筛选对令人感兴趣的特定生物标记具高度 选择性的分子群。
[0008] 本发明提供了一种筛选分子群的方法，包含检测所述分子群是否对介质具有结合 特异性。
[0009] 本发明另外提供一种筛选细胞内或细胞上的生物标记群的方法，其包含上述的方 法，其中所述分子群为所述生物标记群。
[0010] 本发明另外提供一种组合物，其包含由上述方法所筛选出的一群分子。
[0011] 本发明另外提供一种递送治疗剂的方法，包含投与上述组合物至细胞或个体。
[0012] 本发明另外提供一种诊断个体状态的方法，其包含提供生物样本；使上述组合物 与所述生物样本接触；和辨识所述组合物是否与所述生物样本结合，其中所述结合的存在 意指所述个体患有所述状态。
[0013] 本发明将在以下段落中详细描述，本发明的其它特征、目的和优点可由以下实施 方式和权利要求书显而易见。
【附图说明】
[0014] 图1 :脂质体/PEI/PEG复合物（LPPC)吸附抗体-标祀癌细胞的示意图。抗体与 DiO-标记的LPPC混合，接着以PEG1500阻断。PEG-阻断LPPC/抗体复合物是与细胞培育 (如A549)，且接着以FACScan流式细胞仪分析以测定其结合至细胞表面的效能。每个样本 的荧光平均值以阳性对照组（细胞上有100% DiO-标记LPPC)及阴性对照组（未结合抗 体）标准化。每个样本的荧光平均值先除以阳性对照组的荧光平均值，接着，所述标准化的 值再除以阴性对照组的荧光平均值。
[0015] 图2 :以抗体为基础的脂质体用于药物筛选的示意图。总计450种抗体分为50个 群，以用于形成脂质体/抗体（LPPC/抗体）复合物。为了筛选抗体结合至细胞表面的效 能，50个LPPC/抗体复合物在4°C下与不同的癌细胞系培育。与细胞表面具有高结合效能 的LPPC/抗体复合物优先以FACScan流式细胞仪进行分析。自选定群（如3A群）中的单 独抗体，接着LPPC培育并继以FACScan分析，以测定其结合至细胞表面的效能。免疫荧光 法则做为二级筛选以确定选定标祀的亚细胞（subcellular)定位。
[0016] 图3:脂质体-调节抗体群的筛选以辨识不同癌细胞系内特异性受体。50个单独抗 体群与DiO-标记LPPC混合，接着以三种不同细胞系（A549、HT29和MCF7)培育并以FACScan 流式细胞仪分析。5个群（26、21、3八、38和￥1(：群）相较于其它抗体群展现了优选的结合效 能。这些群再次分为单独抗体以测试它们对LPPC的结合效能，如图4到7所示。所述"细 胞"意指未受DiO染色的单独细胞，"NC Ab"意指LPPC上的未结合抗体。
[0017] 图4 :确认在3B群中优先蛋白的亚细胞定位。（A)使用LPPC/抗体复合物系统，以 三种不同的癌细胞测试3B群中的单独抗体。这些所选择的抗体中有许多经进一步以免疫 荧光法确认其亚细胞定位。（B) 3B-4 (MAPK8,红色）位于HT29细胞（结肠癌细胞）的细胞 膜上，但在A549细胞（肺癌细胞）中并无。
[0018] 图5 :确认在2G群中优先蛋白的亚细胞定位。（A)使用LPPC/抗体复合物系统，以 三种不同的癌细胞测试2G群中的单独抗体。这些所选择的抗体中有许多经进一步以免疫 荧光法确认其亚细胞定位。（B) 2G-4 (NU98,红色）位于A549细胞的细胞膜上，2G-7 (MAG1A9， 红色）位于A549和HT29细胞的细胞膜上。
[0019] 图6 :确认在21群中优先蛋白的亚细胞定位。（A)使用LPPC/抗体复合物系统，以 三种不同的癌细胞测试21群中的单独抗体。这些所选择的抗体中的两个（21-3及21-6) 进一步以免疫荧光法确认其亚细胞定位。（B) 21-3 (PIK3R4,红色）和（C)2I-6 (NPR2,红色） 位于MCF7细胞的细胞膜上。
[0020] 图7 :确认在Y1C群中优先蛋白的亚细胞定位。（A)使用LPPC/抗体复合物系统， 以六种不同的癌细胞测试Y1C群中的单独抗体。这些所选择的抗体中有许多经进一步以免 疫荧光法确认其亚细胞定位。（B)Y1C-4(SPAG5,红色）位于Mahlavu (肝细胞癌细胞）和 MCF7 (乳腺癌细胞系）的细胞膜上，但在A549细胞（肺癌细胞系）、肝细胞和Huh7 (肝细胞 癌细胞）中并无。（C) Y1C-5 (P0LR2A，红色）位于A549细胞的细胞膜上。
【具体实施方式】
[0021] 本发明提供了一种筛选分子群的方法，所述方法包含检测所述分子群是否对介质 具有结合特异性。
[0022] 本文中术语"分子"意指一种涉及生物化学反应的小分子或大分子。优选地，所述 分子为大分子，如蛋白质、肽、核酸、寡核苷酸或多核苷酸。所述分子可为天然或人造分子。 另一方面，所述分子可经纯化或与其它成分混合。在本发明的一个优选实施例中，所述分子 在正常状态和非正常状态（如疾病）下有不同的表达型态。在本发明的另一优选实施例中， 所述分子在不同的细胞型态下有不同的表达型态。在本发明的又一优选实施例中，所述分 子为抗体、抗原、酶、底物、配体、受体、膜结合蛋白或细胞表面标记。在本发明的其它优选实 施例中，所述分子为抗体。
[0023] 本发明中术语"分子群"意指分子的群组，其中所述分子可为相同或不同的。
[0024] 本发明中术语"介质"意指一种涉及生物化学反应的小分子或大分子。优选地，所 述介质为大分子，如蛋白质、肽、核酸、寡核苷酸或多核苷酸。所述介质可为天然或人造介 质。另一方面，所述介质可经纯化或与其它成分混合。优选地，所述介质位于细胞内或细胞 上。在本发明的一个优选实施例中，所述分子在正常状态和非正常状态（如疾病）下有不 同的表达型态。在本发明的另一优选实施例中，所述分子在