专利名称：新的肽以及使用该肽的筛选方法
技术领域：
本发明涉及新的肽、用该肽的筛选方法以及该筛选方法获得的抗体。具体地说，本发明涉及与人型抗人IgE单克隆抗体结合的新肽、使用该肽筛选人型抗人IgE单克隆抗体的方法，以及用该筛选方法获得的人型抗人IgE单克隆抗体。
另外，本发明还涉及以该人型抗人IgE单克隆抗体为有效成分的预防和/或治疗过敏症的药物。
背景技术：
以往抗体不仅被用来测定抗原和诊断疾病，而且还用来治疗疾病。然而，由于抗体有多克隆性等原因，抗体作为治疗剂的使用直到最近还受到限制。因此，找到了有特异性的单克隆抗体(MAb)的生产方法(Koehler和Milstein，Nature，(1975)265，295-497)，从而使抗体作为治疗药的使用更可能实现。
许多MAb是通过小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤产生的，所以是小鼠蛋白质。然而，关于从人衍生的MAb的生产的报告却很少。由于可获得的MAb几乎都来自小鼠，所以它们对人显示出抗原性。因此，在给予人的场合，这些MAb引起了称为人抗小鼠抗体(HAMA)反应的免疫应答。即，人对小鼠MAb应答产生抗体，完全排除了小鼠MAb或至少降低了其效果，所以小鼠MAb作为人用治疗药实质上受到限制。在实践中，衍生自小鼠的MAb不能用来治疗几次以上。因此，建议制备出对人抗原性降低的非人抗体。这样的技术通常称为“人化”。在该技术中，采用了对编码抗体分子多肽序列的DNA序列操作的重组DNA技术。
MAb人化的最初方法涉及将小鼠抗体的全部可变区与人抗体的恒定区融合，制成嵌合抗体。这样的嵌合操作实施方法在欧洲专利0120694(Celltech，Inc)、欧洲专利0012023(Genentech，Inc)、欧洲专利公开公报0171496(科学技术振兴股份有限公司；日本专利公开公报59-169370)、欧洲专利公开公报0173493(Stanford University)或欧洲专利公开公报0194276(Celltech，Inc)等中报道。此后，公开了更多关于嵌合抗体的专利申请，其中报道了肿瘤特异性嵌合抗体(欧洲专利0256654，Centocor，Inc)、抗癌胎儿抗原嵌合抗体(欧洲专利公开公报0125023，Genentech，Inc.；欧洲专利0332424，Hybritech，Inc.)等。
然而，由于这样的人化嵌合抗体仍然含有相当部分的非人氨基酸序列，即含有来自小鼠的可变区，所以在长期给药的场合，这样的人化抗体诱发了某种HAMA反应(Begent，等人，Br.J.Cancer，(1990)62，487)。Winter报道了通过用长的寡核苷酸进行定点诱变将小鼠MAb的互补决定区(CDR)移植到人免疫球蛋白可变区的构架区(FR)内(欧洲专利公开公报0239400)。该报道还提到了改变构架区部分氨基酸序列的可能性。现已报道了通过移植来自识别溶菌酶的小鼠MAb和识别人T细胞上抗原的小鼠MAb的CDR来制备人MAb(Verhoeyen，等人，Science，(1988)239，1534；Riechmann，等人，Nature，(1988)332，323)。这样的CDR移植人化抗体中含有的非人氨基酸序列比例较低，因此认为嵌合抗体诱发的HAMA应答少。
在抗体作为疾病诊断药和治疗药的应用中，为了构建高度敏感的测定系统和进行有效的治疗，使用的抗体需要有高的抗原亲和性(结合性)。然而，Riechmann等人指出，单独移入CDR不足以提供CDR移植抗体能满足的抗原结合活性，毗邻CDR区域的构架区部分的氨基酸残基变化对于保持抗原结合活性是必要的。制得的大多数CDR移植抗体的亲和性比显著低于原来的小鼠MAb。另外，Queen等人描述了将小鼠MAb(抗Tac抗体)的CDR移植到人免疫球蛋白可变区的FR中，通过使所得产物与恒定区结合，制得与白介素2受体结合的抗体(Queen，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA(1989)86，10029和WO90/07861)。为使与小鼠抗Tac抗体的序列相同性最高，选择人的FR区，另外用计算机模型鉴定出容易与CDR或抗原相互作用的FR氨基酸残基，用来自小鼠抗体的氨基酸代替人化抗体中的这些氨基酸位置。然而，如此变化得到的抗Tac抗体只有小鼠型抗体的约1/3的亲和性。从该例知道，制造保持亲和性的CDR移植抗体是不容易的。即，仅仅将供应抗体的CDR移植到接受抗体的FR中是不充分的，为了保持亲和性，需要对接受抗体的FR中的残基加以变化。然而，根据能利用的现有技术，目前不可能预计哪个残基应当变化。
另一方面，作为人抗体的制备方法，报道了用制备小鼠MAb常用的杂交瘤方法来制备与特定抗原结合的人MAb的方法。然而，很少有成功的例子。例如，可列举Carrol，W.L.等人(Carrol，W.L.，等人，J.Immunol.Methods，(1986)89，61)和Strike，L.E.等人(Strike，L.E.，等人，J.Immuno.，(1984)132，1788)等的报告。在这种情况下，为了建立人杂交瘤细胞，进行各种改良，使得人型单克隆抗体的制备成为可能。然而，目前得到的人型抗体所识别的抗原是外来异种蛋白质，而识别人源蛋白质的很少。另外，使用体外致敏方法，目前只能得到对抗原亲和性低的抗体。即，如上所述，目前制备人型单克隆抗体不象小鼠MAb那样容易，需要对制备方法加以改进。
本发明者设计了获得特异性高的人型抗人IgE单克隆自身抗体的方法，成功地用基因工程方法制得了重组抗体。认为用该方法制得的重组人抗人IgE抗体可用来治疗I型过敏症。过敏症是由对过敏原的免疫应答引起的疾病状态，它包括以变应原侵入体内后立即产生过敏症为特征的立即型(I型)过敏症和基于T细胞介导的细胞性免疫反应的延迟型过敏症。近年来，术语“过敏症”用来表示1型过敏症。I型变应原由变应原性刺激引起分化的B细胞(浆细胞)所产生的变应原特异性IgE抗体引起。分泌的IgE抗体与体内循环的嗜碱细胞以及组织中存在的肥大细胞细胞膜中存在的Fcε受体(FcεR)结合。如果变应原与结合受体的IgE结合，则产生由该过敏原介导的FcεR交联。结果，引起细胞的脱颗粒反应，释放出各种化学传递物质，例如组胺、前列腺素和白细胞三烯等化学介体。已知这些物质是引起I性过敏症的典型临床症状的原因物质。
现在的过敏症治疗方法主要采用两种方法。一种方法是采用抗组胺药这样的阻碍化学介体的药物或细胞增殖抑制剂或用皮质醇等免疫抑制剂对过敏症症状进行对症治疗。该方法需要反复给药，通常伴有不希望的副作用。另一种治疗方法是脱敏疗法，通过定期给予引起该疾病的变应原，以使患者获得针对特定变应原的免疫耐受性。然而，由于不能始终确定特异性变应原，该治疗在很多情况下没有效果。而且，该治疗方法伴有相当的痛苦和不舒服，该方法本身并不是没有危险。上述任何一种方法均不能预防过敏性症状的发生。
由于已知I型过敏症是由IgE增加引起的，因此，尝试用阻碍变应原性反应诱发的初期阶段中IgE产生和IgE与嗜碱细胞和肥大细胞的结合的物质(尤其是抗体)来预防和治疗I型过敏症。日本专利公开公报1986-289100或1991-127977中揭示了用针对FcεR抗体来阻碍嗜碱细胞和肥大细胞与IgE的结合，从而来进行预防和治疗。另外，关于用针对IgE的抗体来预防和治疗过敏症，已经公开了已知IgE抗体产生应答的方法(日本专利公开公报1991-72500)，以及用与细胞毒素结合的抗IgE抗体选择性地杀伤生产IgE的B细胞，通过除去IgE产生细胞来进行治疗的方法(日本专利公开公报1989-102032和1991-501927)。然而，这些例子中采用的抗人IgE抗体是来自山羊或小鼠的抗体或小鼠人嵌合抗体。在治疗中使用来自人以外动物的抗体的场合，其在血中的半衰期比人抗体短，而且，由于异源抗体有抗原性，产生了针对该抗体的抗体，因此治疗效果减弱或消失。根据这些原因，治疗过敏症中所用的抗人IgE抗体宜是人型抗体。另外，能适用于过敏症治疗的抗IgE抗体必须识别IgE的Fc部分以至于不引起副作用，而且，为了与血清中仅微量存在的lgE结合，它必须要有高的亲和性。
发明揭示为了提供识别人IgE的高亲和性人MAb且是过敏症的根本治疗药，需要人型抗体具有以下特征。
(1)有对人IgE的特异性。
(2)有对人IgE的高亲和性。
(3)不诱导有FcεR的细胞释放化学介体。
(4)与人IgE产生细胞选择性地结合。
认为具有这些特性的人型抗体在血液中与分泌的IgE结合，或能阻止IgE与FcεR的结合。另外，认为该抗体与细胞增殖抑制物质或细胞毒性物质的结合物有效地损伤IgE产生细胞，从而能抑制IgE的产生。因此，认为具有这些特征的抗体在过敏症的基本治疗和预防上非常有用。
鉴于上述情况，本发明者为获得副作用少、与IgE特异性结合的人型抗人IgE单克隆抗体进行了深入地研究，结果发现了可用作获得这样的抗体的工具的18个氨基酸组成的新的肽。另外还发现用该肽可得到具有上述性质的人型抗人IgE单克隆抗体。因此，本发明的课题是提供被人型抗人IgE单克隆抗体识别的新的肽、用该肽来筛选人型抗人IgE单克隆抗体的方法、该筛选方法得到的人型抗人IgE单克隆抗体以及采用该单克隆抗体的过敏症疾病治疗药。
本发明涉及新的肽，具体地说，涉及与人型抗人IgE单克隆抗体结合的新的肽。本发明的新的肽可用作筛选高特异性人型抗人IgE单克隆抗体的工具。
另外，本发明还涉及使用该肽的筛选方法，具体地说，使用该肽来筛选人型抗人IgE单克隆抗体的方法。根据本发明的方法，可以有效地得到高特异性人型抗人IgE单克隆抗体。
本发明还涉及用该筛选方法得到的抗体，具体地说，涉及用该筛选方法获得的人型抗人IgE单克隆抗体。
另外，本发明还涉及以如此得到的抗体作为有效成分的预防和/或治疗过敏症疾病的药物。为了预防和/或治疗过敏症疾病，本发明的太可作为疫苗与其它佐剂并用。
本发明的新肽(下文称本发明肽)是根据人IgE(Elvin A.Kabat，等人，“免疫学上感兴趣的蛋白质的序列”第1卷，第5版(1991)，美国国立卫生研究院出版)设计的肽。它是由人IgE的CH2-CH3区域的18个氨基酸组成的部分肽(F349-A369)，具有序列表中SEQ ID NO1所示的序列。对本发明肽序列有特异性的抗体能识别可溶性IgE(分泌型IgE)和IgE产生细胞表面存在的IgE(膜结合IgE)的任何一种。本发明肽很容易用市售的肽合成装置来合成。例如，可用肽合成仪(Applied Biosystems Inc.；431A型)合成该肽。即，使活性基团受保护的氨基酸吸附在树脂上，加入去保护溶液除去保护基团，再加入活性基团受保护的氨基酸，使两者反应，合成肽。通过重复该操作，合成得到具有目的序列的肽。肽的保护基团可通过在除去溶液(Applied Biosystems Inc.)中反应数小时来除去，在所得滤液中加入冷的二乙醚，回收得到肽沉淀物。将该肽溶解在2N乙酸中，然后冻干，得到粗制的肽。所得肽粗品可用反相色谱等方法来纯化。目标肽具有特定的洗脱位置。另外，如此得到的肽的氨基酸序列可用蛋白质测序仪进行序列分析，用氨基酸分析仪进行氨基酸分析来确定。该肽的特征是对与IgE抗体的Fcε有亲和性的抗体有高亲和性。本发明肽可用作以预防和/或治疗过敏症为目的的疫苗。
利用本发明的肽可以筛选得到人型抗人IgE单克隆抗体。即，为了制备针对IgE的人抗体，通过杂交瘤方法从体外致敏的人淋巴细胞建立自身抗体产生细胞。用所建立细胞所产生的人型抗人IgE单克隆抗体与本发明肽的结合性作为指标，可以得到有望作为过敏症治疗药、具有上述特征、特异性高的人型抗人IgE单克隆抗体。针对本发明肽的结合活性可以如下测定将本发明肽制备在固相化板上，在其中加入抗体产生细胞的培养上清，用EIA法或RIA法等方法测定。通过使用该方法，可以选出产生对人IgE特异性高、有望作为过敏症治疗药、具有上述特征的人型抗人IgE单克隆抗体的细胞。
从如此选出的细胞克隆出编码抗体可变区(VH和VL)的基因。利用编码该抗体可变区的DNA，通过基因工程方法可以制得人型抗人IgE单克隆抗体作为重组蛋白质。另外，根据需要，为了制备亲和性更高的抗体，用基因工程手段在VH和VL区的CDR部分中导入随机突变，制得抗体DNA文库，然后使该抗体基因表达，用淘选法选出亲和性高的噬菌体抗体，从而可制得表现出高亲和性的人型抗人IgE单克隆抗体。
本发明的人型抗人IgE单克隆抗体可如下制得。
(1)抗原宜用纯化的人源IgE作为免疫原。它可从正常人或骨髓瘤患者的血清或人IgE产生细胞的培养上清纯化得到。
(2)杂交瘤细胞的制备在体外用人IgE作为免疫原对淋巴细胞进行敏化。用聚乙二醇将该致敏(敏化)的淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合。骨髓瘤细胞可列举来自人的LICR-LON-HMy2、WI-L2/729HF2、8226AR/NIP4-l和K6H6/B5等。
(3)杂交瘤细胞的选择产生人MAb抗体的杂交瘤细胞可用denovo DNA复制抑制剂来选择。在本发明实施例所示用K6H6/B5细胞作为骨髓瘤细胞的场合，用含有重氮丝氨酸的培养基来选择。另外，通过分析培养上清，可以仅选出产生目标抗体的细胞作为杂交瘤细胞。培养上清可通过ELISA法或与IgE产生细胞的结合反应等来分析。
(4)杂交瘤细胞的培养选出的杂交瘤细胞可用含有胎牛血清的RPMI-1640培养基或无血清培养基来培养。另外，也可根据常规方法培养已导入抗体基因的大肠杆菌等微生物或CHO细胞等动物细胞。可从这些菌体或培养上清纯化得到抗体。
(5)抗体的纯化来自所得培养上清的抗体可用常规方法进行纯化。例如，可使用硫酸铵盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、疏水层析等方法，或者根据需要将这些方法作适当组合。
(6)抗体的特性鉴定本发明的人型抗人IgE单克隆抗体不仅对本发明肽有高度亲和性，而且还具有以下特性。
(i)对人IgE有特异性。
(ii)对IgE有高亲和性。
(iii)不诱导有FcεRI的细胞释放出化学介体。
(iv)与人IgE产生细胞选择性地结合。
本发明的人型抗人IgE单克隆抗体在血液中与分泌的IgE结合，又能阻止IgE与FcεR的结合。另外，认为该抗体与细胞增殖抑制物质或细胞毒性物质的结合物有效地损伤IgE产生细胞，从而能抑制IgE的产生。
本发明的人型抗人IgE单克隆抗体可用以下所示的方法来确认。
(a)对IgE的结合型和特异性该抗体与IgE的结合性(1)和特异性(2)例如可通过采用固定了人IgE的膜或固定了来自人IgE的肽的微量板的ELISA法、或用人IgE进行竞争抑制来确认。另外，与IgE产生细胞的结合(4)可以这样来证明用产生人IgE的骨髓瘤细胞(例如SKO-007或U266Bl等)，使这些细胞与该抗体反应后，用ELISA法或流式细胞计数法检测与细胞结合的抗体。抗体处理诱发的化学介体的释放(3)可用以下方法来确定，例如，在IgE致敏的周围血单核细胞中加入抗体进行培育，然后用RIA法或ELISA法定量测定从细胞中释放出的组胺等化学传递物质。
(b)IgE产生抑制活性由于单独的人MAb或人MAb与增殖抑制物质或毒性物质的结合物预计能通过选择性地损伤人IgE产生细胞来抑制IgE的产生，因此这些物质可能适合治疗过敏症。合适的细胞增殖抑制物质是环磷酰胺等烷基化剂、氨甲喋呤和氟尿嘧啶等代谢拮抗剂以及阿霉素等抗生素等。另外，细胞毒性物质可以是细胞毒素(例如蓖麻毒素和白喉毒素等)和其A链。IgE产生抑制活性可如下确定在单独的抗体或其与增殖抑制物质或毒性物质的结合物的存在下培养标的细胞IgE产生细胞后，测定残存的活细胞数，或用ELISA方法定量测定IgE产生量。
如此得到的高特异性人型抗人IgE单克隆抗体可列举本发明公开的抗体，具体是序列表中SEQ ID NO10(H链)和11(L链)中所示的抗体。这些抗体可用作以预防和/或治疗过敏症疾病为目的的医药组合物，或用来建立免疫学诊断的试剂等。
本发明的人型抗人IgE单克隆抗体可以安全地给予人和灵长动物。本发明蛋白质可制成制剂来经口或非经口给药。作为医药组合物的形态可列举注射用组合物、点滴用组合物、栓剂、经鼻剂、舌下剂、经皮吸收剂等。这些制剂可根据公知的制剂学方法来制成制剂，通过使用药理学上容许的载体、赋形剂、稳定剂、着色剂、表面活性剂和/或其它添加剂等，制成目标制剂。在注射用组合物场合，宜将药理学有效量的本发明人型抗人IgE单克隆抗体与制药学上容许的赋形剂/活化剂(如氨基酸、糖类、纤维素衍生物和其它有机/无机化合物等)混合。另外，在用本发明抗体和这些赋形剂/活化剂来配制注射剂的场合，可根据需要通过常规方法添加pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、增溶剂等，制成各种注射剂。
另外，本发明的抗体也可用作免疫毒素。免疫毒素最初是制成抗体分子与毒素化学结合而成的嵌合分子(Vietta等人.Cell，41653-654(1985)；Pastan等人，Ann.Rev.Biochem.61331-354(1992))。在这些分子中，抗体部分参与选择性结合目标细胞，而毒素部分则参与导入细胞质，随后使细胞死亡。几种毒素已被用来制备免疫毒素。例如，已知有蓖麻毒素A链、封闭的蓖麻毒素、皂草素、美洲商陆抗病毒蛋白、白喉毒素和假单胞菌外毒素A(Pastan等人，Science 2541173-77(1991)；Vietta等人，Semin.Cell Biol.247-58(1991)；Tazzari等人，Br.J.Hematol.81203-211(1992)；Uckun等人，Blood，792201-14(1992)等。这些毒素是从植物或细菌得到的蛋白质，一般由A链和B链通过二硫键结合而成。该A链有阻碍蛋白质合成，在导入细胞质后使细胞死亡的活性。B链介导A链导入细胞内。利用比完全毒素相比副作用少的单单A链或A链突变体，可制成免疫毒素和抗体或抗体一部分结合的分子。该免疫毒素的制备可以是将毒素与抗体化学结合，也可以是作为基因重组体在大肠杆菌等宿主产生融合蛋白质。由于产生IgE的淋巴细胞是导致过敏症，因此本发明抗体或其片段与毒素的制得的免疫毒素可用来除去产生IgE的淋巴细胞，从而能预防和治疗过敏症病发。
附图简单说明
图1显示了用EIA测定的纯化的人型抗人IgE单克隆抗体与P18肽的结合结果。
□本发明抗体1012G◆本发明抗体72D○本发明抗体611B▲本发明抗体46E图2显示了表达抗体H链的载体pCISRα/H的图谱。
图3显示了表达抗体L链的载体pCISRα/L的图谱。
图4显示了表达抗体H+L链的质粒pCISRα-HL的图谱。
图5显示了用于通过MTX来基因扩增的质粒pUCDHFR的图谱。
图6显示了用EIA测定本发明抗体在体外形成免疫复合体的能力的结果。
□本发明抗体72D○小鼠嵌合抗体(M#9Ch)图7显示了用EIA测定本发明抗体直接固定化在IgE上时在体外形成免疫复合体的能力的结果。
□本发明抗体72D○小鼠嵌合抗体(M#9Ch)图8显示了用EIA测定本发明抗体在体外与IgE产生细胞的结合活性的结果。
图9显示了本发明抗体在体内使游离IgE浓度降低的作用随时间推移的测定结果。
(1)用溶剂和小鼠嵌合抗体的结果◆小鼠嵌合抗体(M#9Ch)，以10微克/千克给药■小鼠嵌合抗体(M#9Ch)，以100微克/千克给药▲小鼠嵌合抗体(M#9Ch)，以1000微克/千克给药●给予溶剂(2)用溶剂和本发明抗体的结果◆本发明抗体72D，以100微克/千克给药■本发明抗体72D，以300微克/千克给药▲本发明抗体72D，以1000微克/千克给药●给予溶剂图10显示了本发明抗体对于IgE处理的嗜碱细胞的反应性。(A)是添加0微克/毫升本发明抗体时的结果。(B)是添加1微克/毫升本发明抗体时的结果。(C)是添加10微克/毫升本发明抗体时的结果。
实施发明的最佳方式实施例用下面实施例来更详细地说明本发明，但给予这些实施例只是为了说明，本发明不局限于这些实施例。
实施例1产生人型抗人IgE单克隆抗体的杂交瘤细胞的建立(1)体外抗原致敏将从同种异型不同的二个健康人得到的周围淋巴细胞在37℃下融化，用RPMI-1640培养基(Gibco BRL Co.)离心洗涤2次(250xg下10分钟)。混合相同数量的淋巴细胞，悬浮于含2.5mM亮氨酸-O-甲酯(Aldrich Co.)的培养基中，室温下处理40分钟。用RPMI-1640培养基洗净细胞，以107个/毫升悬浮于RPMI-1640培养基中。在其中添加胞壁酰二肽(40微克/毫升；Sigma)、人IL-4(100U/ml；Peprotech Co.)和人IL-6(10ng/ml；R & D Systems，Inc.)，分注入6孔板内，每个孔2.5毫升。加入不同量(0.1-10微克)的致敏抗原(人IgE；Scripps Research Institute)，在室温下放置15分钟，然后每个混合物内各添加含40％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基2.5毫升，在37℃、5％CO2的培养箱内培育3-5天。作为细胞培养用培养基(CRPMI)，在含10％FCS的RPMI-1640培养基中添加25mM HEPES、100U/ml青霉素、100微克/毫升链霉素、2mM丙酮酸钠、2mM非必需氨基酸和5×10-5M 2-巯基乙醇。250xg下离心5分钟来回收淋巴细胞，洗涤2次，悬浮于细胞培养用培养基中。
(2)细胞融合通过250xg下离心5分钟来回收对数生长期的K6H6/B5异杂交瘤细胞(ATCCCRLl832)。用RPMI-1640培养基洗净细胞，计数细胞数。将致敏淋巴细胞与K6H6/B5细胞以2∶1至4∶1的比例加入50毫升锥形管内并混合。将该混合物250xg下离心5分钟，完全除去培养基后，轻轻振摇细胞，使沉淀松开。在转动试管的同时，将1毫升42％(w/v)聚乙二醇3350(Merck Co.)-17％(v/v)二甲基亚砜-RPMll640溶液缓慢地在1分钟内加入细胞中。将10毫升无血清RPMI-1640培养基缓缓加入并同时搅拌。细胞在250xg下离心5分钟，除去培养基。然后，将K6H6/B5细胞重悬于HAzT培养基(含有次黄嘌呤(0.1mM)、重氮丝氨酸(1微克/毫升，Sigma Corp.)、胸苷(16μM)和Human IL-6(1ng/ml)的CRPMI培养基)中至浓度为2.5×105个/毫升。将融合的细胞接种到96孔微量滴定板中，每孔0.2毫升，在37℃、5％CO2培养箱内培养。4日后，在各孔内加入50微升新鲜的HAzT培养基。此后每5日除去孔中50微升培养基，换成新的培养基。
实施例2产生人型抗人IgE单克隆抗体的杂交瘤的选择和克隆在确认细胞增殖的孔内，用ELISA方法测定杂交瘤产生的抗体的抗原特异性。在每个孔内加入100微升溶解在0.1M NaHCO3(pH9.6)的人IgE(2微克/毫升)，通过吸引将抗原固定在膜(BiodyneA；German Science Co.)上。然后，在各孔内加入200微升含2％牛血清白蛋白(BSA)/10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)-0.15M NaCl(PBS)，将残余的结合部位封闭。加入100微升培养上清，在室温下反应2小时。用PBS-0.05％吐温20(PBST)吸引洗净4次后，为了检测结合的抗体，每孔加入0.5％BSA/PBS稀释10000倍的碱性磷酸酶(AP)标记的山羊抗人IgG抗体(Capel Corp.)100微升，室温下反应2小时。用PBST吸引洗净4次后，加入100微升AP底物溶液，室温下发色，然后转移至96孔微量滴定板，用微量滴定板读数仪(ImmunoReader NJ-2000；Nalge NuncInternational)测定405nm下的吸光度。用有限稀释法(0.3个/孔)进行3次克隆，使产生抗原特异性抗体的细胞单克隆化。
(1)P18的合成和纯化用0.25毫摩尔HMP树脂(Applied Biosystems Inc.)和1毫摩尔Fmoc氨基酸(Applied Biosystems Inc.)通过Fmoc法用肽合成仪(431A型，Applied Biosystems Inc.)合成P18(根据来自人IgE的CH2-CH3区域的18个氨基酸设计的本发明肽)。在所得肽树脂(1047毫克)中加入10毫升除去溶液(Applied Biosystems Inc.)，4℃下反应1小时，然后在室温下反应1.5小时，从树脂上除去肽。浓缩通过玻璃滤膜所得的溶液，然后，加入冷的二乙醚使肽沉淀，用玻璃滤膜回收沉淀。将该肽溶解在2N乙酸溶液中，然后冷冻干燥，得到392毫克粗制肽。取150毫克进行反相HPLC(capsule pack C18；资生堂社)纯化，得到纯度为98％的P18(94毫克)。
(2)抗体与P18的结合活性用EIA方法，以与根据人IgE的CH2-CH3区域的18个氨基酸设计的本发明肽(P18；序列表中SEQ ID NO1)的结合性为指标，从所建立的杂交瘤细胞产生的人型抗人IgE单克隆抗体中选择。作为AP底物溶液，采用对硝基苯基磷酸钠(Sigma 104；Sigma Co.)在1M二乙醇胺/0.5mM氯化镁中的溶液(pH9.8)(浓度为1毫克/毫升)。在用PBST将添加2％BSA于4℃包被过夜的96孔微量滴定板洗净后，在每个孔内加入P18(10微克/毫升)/戊二醛(0.25％；Sigma Co.)/PBS(10毫克/毫升)，室温下反应1小时。用PBST洗净后，添加含0.02％NaN3的40mM Tris盐酸缓冲液(pH7.4)，4℃下封闭过夜，制成P18固定化板。加入细胞培养上清100微升，室温下反应2小时。用PBST洗净3次后，加入用1％BSA/PBS稀释1000倍的AP标记的抗人IgG抗体(CapelCo.)100微升，室温下反应2小时。洗净后，加入100微升AP底物溶液，室温下发色，用微量滴定板读数仪测定405nm下的吸光度。利用该方法从约2000孔(估计200000个克隆)中选出有与P18结合活性的4种抗体(1012G、72D、611B和46E)。结果示于表1。
表1抗体 吸光度1012G 0.601611B 0.07346B 0.04672D 0.045实施例3本发明抗体的制备和纯化将含5％FCS的RPMI-1640培养基中生长的产生4种抗体的杂交瘤分别用PBS洗净3次，然后悬于不含血清的RPMI-1640培养基中至106个/毫升，在37℃下5％CO2培养箱内培养3日。在离心分离的培养上清中加入硫酸铵(Nacalai Tesque Co.)至最终浓度为40％，调节pH至中性，4℃下放置1小时，进行盐析。将离心(7000xg，20分钟)所得沉淀溶解在少量PBS中，4℃下对PBS透析，除去硫酸铵。最后，用20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)透析后，离心除去不溶物，过滤样品，加入NaN3至最终浓度为0.02％。将样品加入经20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)平衡的蛋白G-Sepharose 4B柱(Zymed Laboratories，Inc.；2毫升)中，用30毫升平衡缓冲液洗净。用冰冷的0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)8毫升将抗体洗脱，立即用0.4毫升1.5Mtris-HCl缓冲液(pH8.9)中和。在4℃下用PBS透析该抗体溶液后，测定280nm下的吸光度，算出抗体浓度(E1％13.5)。结果示于表2。用ELISA法测定所得抗体的同种型，结果表明4种抗体分类均为IgG1(λ)。
表2抗体 无血清培养量(毫升) 纯化抗体量(毫克)1012G 400 2.93611B 450 2.1446B450 5.6372D300 2.26实施例4本发明抗体的抗原识别(1)对P18的结合性用与实施例2相同的方法测定经1％BSA/PBS系列稀释的4种纯化的人型抗人IgE单克隆抗体与P18肽的结合活性。结果如图1所示。结果确认，所有四种抗体均具有P18结合性。
(2)通过人IgE的结合抑制活性用竞争抑制法检查人IgE对于本发明抗体与P18的结合抑制活性。将0.2毫克抗体与不同量的人IgE混合，37℃下反应1小时后，加入P18固定化微量滴定板中，室温下培育2小时。洗净后，加入1％BSA/PBS稀释1000倍的AP标记的抗人IgG抗体(Capel Co.)100微升，室温下反应2小时。洗净后，加入100微升AP底物溶液，在室温下发色，测定405纳米下的吸光度。结果示于表3。该结果确认，4种抗体通过人IgE预处理与P18的结合受到抑制，从而确认抗体与人IgE结合。
表3加入的人IgE(微克/毫升 结合抑制(％)46E611B72D1012G0 0 0 0 022.5 46 32 17 444566 33 51 659076 72 74 85(3)本发明抗体与人IgE产生细胞的结合活性将产生人IgE的骨髓瘤细胞(SKO-007；ATCC CRL-803 3-1)悬于PBS-0.02％NaN3中至2.5×106个/毫升，将其与相同量的溶解在2％BSA/PBS中的本发明抗体(20微克/毫升)混合，在37℃下反应1小时。洗净细胞后，将其悬于1000倍稀释的AP标记的抗人IgG抗体(Capel Corp.)，在室温下反应2小时。用PBST洗净后，在每个样品中加入AP底物溶液(对硝基苯基磷酸二钠(2毫克/毫升))0.5毫升，在室温下反应后，测定取样上清的405纳米吸光度。结果示于表4。结果确认，4种本发明抗体全部与人IgE-产生细胞结合。另外，用同样方法确认这些抗体不与IgG产生细胞IM-9(ATCCCCL-159)和IgM产生细胞RPMI-1788(ATCC CCL-156)结合。
表4抗体吸光度(405纳米)实验1 实验2正常IgE 0.060 0.0371012GND0.795611B 0.861 1.09046E 0.186 ND72D 0.626 ND(ND表示未实施)实施例5本发明抗体的周围单核细胞的组胺释放用IgE使用Ficoll-Conray(Lymphosepar I；免疫生物研究所社)从人周围血液分离的单核细胞(1.6×106个/毫升)致敏，然后加入本发明抗体(0.1微克)，37℃下反应30分钟。然后用HRT试剂盒(Miles Corp.)根据标准程序定量测定单核细胞释放的组胺。结果示于表5。结果，经本发明抗体处理的周围血单核细胞组胺释放以抗体72D为最少。
表5抗体 释放的组胺浓度(nM)1012G 2.09611B 3.1146E 4.5172D 1.5实施例6抗体cDNA的克隆(1)抗体库的制备用mRNA分离试剂盒(Invitrogen Inc.)从108个杂交瘤细胞(72D)得到poly(A)+RNA 32.8微克。用5微克该mRNA作为模板，用cDNA合成试剂盒(AmarshamCo.)合成双链cDNA。用所得cDNA(1.86微克)的一半量，在其两端加EcoRI-NotI-BamHI衔接子(宝酒造社)，然后用sepharose为载体进行凝胶层析，分离出含cDNA的级分。根据Huynh，T.V.的方法(《DNA克隆实验方法》，48-78页，Glover，D.M.编辑(1985)，IRL Press出版)，通过将cDNA插入噬菌体载体λgt10的EcoRI臂中，制得cDNA文厍。
(2)cDNA文库的筛选用Gigapack Gold(Stratagene Co.)将上述制得的重组噬菌体DNA体外包装，感染大肠杆菌，得到1.7×104个噬斑。将该噬斑吸附在Hybond-N滤膜(Amarsham Co.)上，获得复制滤膜。然后，以编码32P标记的抗体基因的恒定区的DNA片段作为探针进行噬斑杂交方法，分别筛选出含有抗体H链和L链cDNA的噬斑。结果，识别出数十个对H链和L链的阳性噬斑。将这些阳性噬斑个别收集在500微升SM缓冲液中，作为噬菌体原液。从该原液回收噬菌体DNA，用限制性内切酶NotI消化，进行凝胶电泳，确认DNA片段的长度，纯化得到估计含有cDNA全长的DNA片段。从所选噬菌体原液H53和L5分别得到约1.7kb的H链cDNA和0.9kb的L链cDNA。
(3)cDNA碱基序列的决定用连接试剂盒(宝酒造社)将上述所得的全长cDNA插入经限制性内切酶NotI消化的质粒载体pBLUE SCRIOT II SK+(东洋纺社)中，然后转化大肠杆菌。结果分别得到含有1拷贝H链cDNA和L链cDNA的亚克隆。从该亚克隆回收重组质粒，作为测序用模板。在测序中，使用DNA测序试剂盒(PerkinElmer Co.)依照其程序进行反应，用自动化DNA测序仪(PRISM模型377；ABI社)对其产物进行测序，确定全部碱基序列。测得的碱基序列显示在序列表中SEQ ID NO2(H链)和SEQ ID NO3(L链)中，从这些序列翻译出的氨基酸序列分别显示在序列表中SEQ ID NO10(H链)和11(L链)中。
另外，根据同样的方法，测定所得其它三种抗体(1012G、611B和46E)的全部碱基序列。抗体1012G所测得的碱基序列显示在序列表中SEQ ID NO4(H链)和SEQ IDNO5(L链)中，从这些序列翻译得到的氨基酸序列显示在SEQ ID NO12(H链)和SEQID NO13(L链)中。抗体611B所测得的碱基序列显示在序列表中SEQ ID NO6(H链)和SEQ ID NO7(L链)中，从这些序列翻译得到的氨基酸序列显示在SEQ ID NO14(H链)和SEQ ID NO15(L链)中。抗体46E所测得的碱基序列显示在序列表中SEQ ID NO8(H链)和SEQ ID NO9(L链)中，从这些序列翻译得到的氨基酸序列显示在SEQ IDNO16(H链)和SEQ ID NO17(L链)中。
实施例7(1)抗体表达用载体的构建用表达载体pcDL-SRα296(Takebe，Y.，等人.Mol.and Cell.Biol.，(1988)466-472)的含有16S剪接点的SRα启动子区域代替哺乳动物表达载体(pCI；Promega Co.)的CMV/IE增强子/启动子区域，制得表达载体。根据它构建抗体表达载体。即，用BgIII消化哺乳动物表达载体-pCI，用DNA钝化试剂盒(宝酒造社)将末端变平，然后用苯酚/氯仿萃取，乙醇沉淀纯化。用PstI消化，凝胶纯化不含CMV/IE增强子/启动子区域的载体。用HindIII消化表达载体pcDL-SRα296，同样进行平头化后，用PstI消化。对其进行琼脂糖凝胶电泳，纯化得到含有16S剪接点的SRα启动子区域。用DNA连接试剂盒(宝酒造社)将其与不含CMV/IE增强子/启动子区域的pCI载体相连，制得抗体H链表达用载体(pCISRα)。
另外，将ClaI磷酸化连接序列(Nippon Gene Co.)导入表达载体pCI的Bgl II位点，用BalI消化所得载体(pCICIa)，平头化后，用苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀来纯化。纯化载体用PstI消化，凝胶纯化得到不含CMV/IE增强子/启动子区域的载体。将其与含有16S剪接点的SRα启动子区域DNA按照上述同样方法连接，获得表达抗体L链用的载体(pCICIaSRα).
(2)抗体H链表达载体的构建将通过产生本发明抗体的杂交瘤(72D)得到抗体H链cDNA作为模板，用SalIsigVH1F(SEQ ID NO18)和HFR4CH1A palR(SEQ ID NO19)作为引物，进行PCR(25轮；94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟)，得到含有信号序列、VH和CH1的一部分的DNA片段(SigVHCH1)。另外，用ApaICH1F(SEQ ID NO20)和CH4Eco52IR(SEQID NO21)作为引物，通过PCR得到CH片段。
PCR条件宝酒造社ExTaq(5U/微升) 0.5微升10x ExTaq缓冲液10微升dNTP混合物(各2.5mM)8微升模板 约100微克引物(2-型) 各0.2μM加入无菌蒸馏水至100微升用pT7Blue T-载体试剂盒(Novaken Co.，Ltd.)克隆所得PCR产物。即，在含有凝胶纯化的各PCR产物约20毫微克与经限制性内切酶(ApaI和Eco52I)消化的pT7BlueT载体50毫微克的连接酶反应缓冲液中加入T4 DNA连接酶(4U)，在16℃下保温2小时。然后，将2微升上述连接酶反应液与加入了0.5M 2-巯基乙醇2微升的感受态大肠杆菌(DH5α)50微升混合，在冰上静置30分钟，然后在42℃下加热40秒，再于冰上静置2分钟。然后加入0.5毫升SOC培养基，37℃下振摇培养1小时。将该培养肉汤散布在含有0.1毫克/毫升氨苄青霉素的LB平板上，37℃培育过夜。挑取板上出现的单菌落，在含有0.1毫克/毫升氨苄青霉素的LB培养基(LB-Amp)1毫升中37℃培养过夜。从该培养液回收细胞，根据碱法制得质粒DNA。进行DNA序列分析，得到携带具有正确核苷酸序列的质粒的转化的大肠杆菌。从培养过夜的培养液(5毫升)纯化质粒DNA，用限制性内切酶(ApaI和Eco52I)消化含有SigVHCH1的载体，用苯酚/氯仿抽提后通过乙醇沉淀来纯化。用限制性内切酶(ApaI和Eco52I)消化含有CH片段的载体，凝胶纯化，制得经限制性内切酶处理过的片段。将8微升CH片段(约20毫微克)加入1微升(约50毫微克)经酶处理过的载体中，在其中加入DNA连接试剂盒Ver.2I溶液(宝酒造社)10微升，16℃下连接2小时。将反应产物加入感受态TG1(500微升)中，0℃下静置45分钟后，施加热休克(42℃，2分钟)进行转化。将100微升所得产物悬浮于900微升的LB/20mM葡萄糖(LBG)培养基中，37℃下振摇培养1小时。将经LBG阶段稀释的转化细胞悬浮液涂布在SOBAG板上，37℃培育过夜。挑取出现的单菌落，悬浮于1毫升LB-Amp培养基中，37℃下培养16小时。从该培养液回收细胞，用碱法制得质粒DNA。进行碱基序列分析，结果得到携带具有正确抗体cDNA碱基序列的质粒(pT7Blue/H-72D)的转化的大肠杆菌。从该过夜的培养液纯化质粒DNA，用限制性内切酶(SalI和Eco52I)消化后，进行纯化。将其与经限制性内切酶(SalI和Eco52I)消化的上述H链表达用质粒载体(pCISRα)相连接，获得抗体H链表达载体(pCISRα/H)。图2显示了抗体H链表达载体的图谱。
(3)抗体L链表达载体的构建以用产生本发明抗体的杂交瘤(72D)得到的抗体L链cDNA作为模板，以SalIsigVL1F(SEQ ID NO22)和CLNotIR(SEQ ID NO23)作为引物，通过PCR得到含有信号序列、VL和CL的DNA片段(SigVLCL)。所得PCR产物用上述同样的方法克隆到pT7Blue载体中，转化大肠杆菌。得到导入了显示行正确碱基序列的抗体L链的质粒(pT7Blue/L-72D)的大肠杆菌。
从该过夜的培养液纯化质粒DNA，用限制性内切酶(SalI和NotI)消化，纯化得到抗体L链DNA。将抗体L链DNA与同样经酶消化的上述L链表达用质粒载体(pCIClaSRα)相连接，获得抗体L链表达载体(pCISRα/L)。图3显示了抗体L链表达载体的图谱。
(4)抗体(H+L)表达载体的构建用限制性内切酶(AatII和SalI)消化抗体L链表达质粒(pCIClaSRα/L)，凝胶纯化得到含抗体L链DNA的片段(SalI/AatII)。剩余的载体片段用ClaI进一步消化，用同样方法纯化得到含启动子区域的DNA片段(ClaI/SalI)。用限制性内切酶(AatII和ClaI)消化抗体H链表达质粒(pCISRα/H)，凝胶纯化含抗体H链DNA的载体片段(ClaI/AatII)。将其与对应的来自抗体L链表达质粒的Sall/AatII片段和ClaI/SalI片段相连接，转化大肠杆菌(DH5α)，得到携带抗体H+L链表达质粒(p-CISRα-HL；图4)的大肠杆菌。该大肠杆菌命名为DH5a/pWT-Z，于1999年1月27日保藏于国立生命科学和人体技术研究所(日本茨城县Tsukuba市东一区1番3号(邮编305-3566))(保藏号FERM BP-7344，由1999年1月27日的P-17l73移管)。
实施例15质粒大规模制备和电穿孔将抗体表达载体转化的大肠杆菌的甘油原液在含有氨苄青霉素的LB平板上划线，将出现的单菌落接种于20毫升含氨苄青霉素的terrific肉汤(AT-Amp)中，37℃振摇培养过夜。在4个加入了400毫升TB-Amp的2升有挡板的锥形瓶中各加入5毫升大肠杆菌培养液，37℃、160rpm下旋转培养，在600nm下的吸光度为0.8-1.0时，添加大观霉素(Sigma Co.；最终浓度为0.17毫克/毫升)，再培养约20小时。从培养液离心(4000xg，10分钟，4℃)收集大肠杆菌，用大型质粒Plasmid Mega试剂盒(QiagenCompany)纯化得到9.0毫克质粒DNA。
用限制性内切酶AatII(2000U)在37℃下对所得的最终量为3毫升的1毫克质粒DNA消化过夜。然后用苯酚抽提、用氯仿抽提、乙醇沉淀，在溶解于TE中。将200微克抗体表达载体和经AatII消化的pUCDHFR(20微克；图5)混合后，再次进行无菌乙醇沉淀。将其溶解在20微升TE中，添加80微升含10％FCS的IMDM培养基(IMDM-10)。
将浮游的CHO细胞(dhfr-)2×107个悬浮于700微升IMDM-10中，加入上述DNA溶液混合后，转移至比色杯(基因脉冲仪比色杯；0.4厘米电极；Biorad Co.)。在330V、960μF的条件下通过电穿孔导入基因。静置10分钟后，将其悬浮于添加了HT(GibcoBRL Co.)的PF325培养基(JRH Bioscience Corp.)中，37℃下培养2日。将细胞悬浮在PF325培养基中至104个/毫升，然后在96孔微量滴定板(Nunc Co.；MaxiSorp)中每孔内加入200微升，37℃、CO2培养箱内培养。
实施例16抗体表达细胞的检测在固定有1微克抗人IgG(Fc)抗体(Capel Corp.)的96孔板上加入100微升培养上清，在室温下静置2小时后，用PBS T洗净6次。每孔内加入溶解在25％Block Ace(BA；雪印乳业社)/PBS中的AP标记的抗人λ链抗体(Bio Source Co.；2000倍稀释)各100微升，在室温下放置2小时。洗净后，各加入100微升AP底物溶液，在室温下反应。用3N-NaOH溶液终止反应，然后用微量滴定板读数仪(NJ-2000；Japan Intermed Co.，Ltd.)测定405nm下的吸光度。根据结果，选出显示出高吸光度的几个孔中的细胞。
实施例17基因扩增和克隆使所选抗体表达细胞增殖后，将其悬浮于含有20nM氨甲喋呤(MTX；Sigma Co.)的PF325培养基中，接种入96孔板内，每个孔接种104细胞/0.2毫升，在37℃CO2培养箱内培育。选择MTX耐受性细胞，以25×104细胞/毫升的浓度接种入12孔板中，培养4日。测定培养上清的抗体浓度，选出产量高的细胞。另外，用纯化的人IgG(λ)(Nordic Immunology Co.，Ltd.)作为标准品。将该细胞以100个/孔接种到96孔微量滴定板中，进行克隆，同样选出产量高的细胞。用依次阶段性增加MTX浓度的培养基反复进行基因扩增和克隆，建立高产细胞株。
实施例18重组抗体的生产和纯化将上述获得的高产细胞株悬浮于含有MTX的ExCell 301培养基(Nichirei Corp.)中至25×104个/毫升，在37℃CO2培养箱内培养3日。无菌分离培养液和细胞，将回收的细胞悬浮于新的培养基中至25×104个/毫升，再培养3日。反复进行这样的培养，得到92.3升含抗体的培养液。用6N-NaOH将含抗体培养液的pH调节至7.4，过滤(millipack 0.22μm；Millipore Co.)。将其施加到经PBS平衡的HiTrap rProtein A(5毫升；Pharmacia Biotech Inc.)上，使抗体吸附。用PBS洗柱后，用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)洗脱抗体，立即用1.5M Tris-HCl缓冲液(pH8.7)中利，获得纯化的重组抗体。结果从含有1.86毫克抗体72D的培养液得到1.70毫克纯化抗体。
实施例19通过体外试验评价本发明抗体
(1)免疫复合体的形成能力使人IgE(Scripps Research Institute；最终浓度为0.5微克/毫升)和各种量的抗人IgE抗体(72D)在25％BA/PBS中37℃下反应2小时。另外，用小鼠抗人IgE抗体嵌合化获得的重组抗体(M#9Ch；日本专利公开公报1993-199895号)作为对照阳性对照。在固定了100毫微克山羊抗人IgE抗体(Capel Corp.)且用25％BA/PBS封闭的96孔板上，使上述反应液在室温下培育2小时。用PBST洗净4次后，添加25％BA/PBS稀释1000倍的AP标记的抗人IgE(Fc)抗体(Capel Corp.)，在室温下培育2小时。用PBST洗净4次后，每孔各添加100微升AP底物溶液，在室温下反应。用3N-NaOH终止反应，用微量滴定板读数仪(NJ-2000；Japan Intermed Co.，Ltd.)测定405nm下的吸光度。结果示于图6。结果确认抗体72D能形成免疫复合体。
另外，将人IgE(100ng)添加到96孔微量滴定板(Nunc Co.；MaxiSorp)的各孔内、4℃过夜固定后，添加25％BA/PBS，在室温下静置2小时，进行封闭。用PBST洗净4次后，加入不同量的本发明抗体(72D)或上述嵌合重组抗体(M#9Ch)，在室温下培育2小时。用PBST洗净4次后，添加25％BA/PBS稀释1000倍的AP标记的抗人IgE(Fc)抗体(Capel Corp.)，在室温下培育2小时。用PBST洗净4次后，每孔各添加100微升AP底物溶液，在室温下反应。用3N-NaOH终止反应，用微量滴定板读数仪(NJ-2000；Japan Intermed Co.，Ltd.)测定405nm下的吸光度。结果示于图7。结果发现，本发明的抗体不与直接固定在微量滴定板上的IgE结合。
(2)与产生IgE的细胞的结合离心(100xg，10分钟)收集在含10％FCS的RPMI-1640培养基中生长的产生IgE的骨髓瘤细胞株U266B1(ATCC TIB-196)，悬浮于ExCell 301培养基中至5×106个/毫升。在1.5毫升微量离心管中加入100微升细胞悬液、400微升抗体(72D或M#9Ch)溶液、50微升1％BSA/PBS/0.02％NaN3，在室温下培育2小时并不时地混合。用PBS离心洗净2次后，添加100微升1％BSA/PBS/0.02％NaN3稀释1000倍的AP标记的抗人IgG(Fc)抗体(Capel Corp.)，在室温下反应2小时并不时地混合。用PBS离心洗净3次后，加入200微升对硝基苯基磷酸二钠盐至浓度为3毫克/毫升AP基质溶液，在室温下反应15分钟并不时地混合。将离心(10000xg，5分钟，4℃)所得的上清150微升转移至96孔微量滴定板中，用微量滴定板读数仪测定405nm下的吸光度。结果示于图8。
实施例20本发明抗体引起血中游离IgE浓度降低(体内药效试验)
将纯化的人IgE(Scripps Inc.)静脉内(50微克/千克)给予雄性Wistar大鼠(9周龄；Japan Charlesriver Co.，Ltd.)。5分钟后从眼窝收集的血液制得抗人IgE抗体给药前的血清。给予IgE的10分钟后，静脉内给予溶解在0.1％BSA/PBS中的本发明抗体(72D)和赋形剂(0.1％BSA/PBS)。另外，用小鼠抗人IgE抗体嵌合化获得的重组抗体(M#9Ch；日本专利公开公报1993-199895号中揭示)作为对照阳性对照。本发明抗体在100、300、1000微克/千克的用量下、作为阳性细胞使用的M#9ch在10、100、1000微克/千克的用量下进行试验。在IgE给药后、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、24小时时从眼窝中取血。离心分离制得的血清保藏于-30℃直至测定。游离IgE浓度的测定根据下述反复进行。即，在96孔微量滴定板中加入溶解在50mM NaHCO3(pH9.6)至2微克/毫升的待测抗人IgE抗体和多克隆抗人IgE抗体(Dako Japan，Co.，Ltd.)作为固定化抗体，4℃下静置过夜，使抗体固定。在各孔内加入300微升的2％BSA/PBS后，在室温下放置1小时后封闭。然后加入100微升25％BA/PBS稀释的血清样品，在室温下培育2小时。同时，为了制作标定曲线，还制备添加已知浓度的标准IgE的孔。用PBST洗净6次后，在各孔内加入100微升5000倍稀释的AP标记的山羊抗人IgE抗体(Capel Corp.)，室温下静置2小时，作为二次抗体。用PBST洗净6次后，各孔内添加100微升AP底物溶液，室温下反应。用3N-NaOH终止反应，用微量滴定板读数仪(NJ-2000；Japan Intermed Co.，Ltd.)测定405nm下的吸光度，根据制得的标定曲线定量测定血清中存在的游离IgE浓度。结果示于表6和图9。结果确认通过给予本发明抗体72D使血中IgE浓度依赖于剂量地降低，1000微克/千克给药使血中IgE完全消失。
表6抗体(微克/千克) 血清IgE AUC(ng·ml-1·hr)赋形剂 5307±574M#9Ch(10)2536±577M#9Ch(100) 2128±193M#9Ch(1000) 1009±27972D(10) 1695±22172D(300) 289±25572D(1000)0±0(数据用平均值±标准偏差(n＝3)表示)实施例21
血清素释放试验将40×105个大鼠嗜碱性白血病细胞(RBL-1；ATCC CRL-1378)悬浮于4毫升0.1％BSA/PBS/0.02％NaN3中，添加人IgE至1微克/毫升后，4℃下培育30分钟。用0.1％BSA/PBS/0.02％NaN3洗净后，悬浮于8毫升试剂盒所附的稀释液中。将该悬浮液以0.5毫升的用量分别注入每个微量离心管内。在每个管内加入10微克/毫升人正常抗体(Capel Corp.)或本发明抗体(72D)，37℃下培育30分钟。然后，离心(100G，5分钟)，获得上清作为检测样品。用血清素测定试剂盒(Immunotech Co.)定量测定游离的血清素。结果示于表7。与不添加抗体时相比，添加正常人IgG和本发明抗体引起的血清素释放方面没有统计学上的差别(t-检验)。因此表明本发明抗体(72D)不诱发IgE致敏的嗜碱细胞的脱颗粒。
表7抗体 释放的血清素(nM)赋形剂 91.50±11.02正常IgE(10微克/毫升)99.49±9.3872D(10微克/毫升)104.97+11.22(数据用平均值±标准偏差(n＝4)表示)实施例22本发明抗体对于IgE处理的嗜碱细胞的反应性将2.52×107个大鼠嗜碱性白血病细胞(RBL-1；ATCC CRL-1378)悬浮于12.6毫升的0.1％BSA/PBS/0.02％NaN3中，使细胞浓度为2×106个/毫升。将其以0.5毫升分注到微量离心管内。在其中添加人IgE(Scripps Research Institute)至最终浓度为1微克/毫升，4℃下培育30分钟，用鞘(sheath)溶液(IsoFlo；Beckman Coulter，Inc.)洗净3次后，重悬于0.2毫升鞘溶液中。在管内加入本发明抗体(72D)至最终浓度为0、1或10微克/毫升，4℃下培育30分钟。用鞘溶液洗净3次后，将其悬浮于0.5毫升1000倍稀释的FITC标记的抗IgG抗体(荧光素偶联的山羊F(ab′)2片段抗人IgGFc；CapelCorp.)中，4℃下培育30分钟。用鞘溶液洗净3次后，重悬于1毫升相同溶液中，用流式细胞仪(EPICSXL；Beckman Coulter，Inc.)分析。结果示于图10。结果确认本发明抗体与经IgE预处理的RBL-1细胞剂量依赖性地结合。
产业上利用的可能性本发明提供了与人型抗人IgE单克隆抗体结合的新的肽、用该肽筛选人型抗人IgE单克隆抗体的方法以及该筛选方法获得的人型抗人lgE单克隆抗体。本发明的新的肽可用作筛选高特异性人型抗人IgE单克隆抗体的工具以及过敏症疾病的治疗药。另外，本发明的筛选方法可用作获得高特异性人型抗人lgE单克隆抗体的方法。本发明获得的抗体可用作过敏症疾病的预防药和/或治疗药。
保藏的生物材料的信息A.保藏该生物材料的保藏机构的名称和地址名称国立生命科学和人体技术研究所地址日本茨城县Tsukuba市东一区1番3号(邮编305-3566)B.交机构保藏A的日期 1999年1月27日C.保藏机构A给予的保藏号 FERM BP-7344
序列表<110> 雪印乳业株式会社<120> 新的肽以及使用该肽的筛选方法<130> SNOW-134<150> JP7061-2000<151> 2000-1-14<160> 23<170> PatentIn Ver.2.0<210> 1<211> 18<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述合成的肽<400> 1Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val1 5 10 15Ser Ala<210>2<211>1422<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>2atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctacaggtgt ccagtcgcag 60gagcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagcagactg ggtcctcagt gagagtctcc 120tgcaaagctt ctggaggcac cttcagcaga tacgccatca actgggtgcg acaggtccct 180ggacaagggc ttgagtggat ggcagggatc atccctatct ttggtccacc aaagtatgca 240cagaaattcc agggcagagt ctccctgacc gcggacagat ccacgaacac agcctacatg 300gagatggccc gcctgaggtc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag acgggtggct 360aggcggttgc gtgctggggc tagtgggttt gactactggg gccagggaac accggtcgcc 420gtctcctcgg cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1320agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422<210>3<211>708<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>3atgacctgct cccctctcct cctcaccctt ctcattcact gcacagggtc gtgggcccag 60tctgtgttga cgcagccgcc ctcagtgtct gcggccccag gacagaaggt caccatctcc 120tgctctggaa ggagctccac cattgcagtt aattctgttt cctggtacca gctgctccca 180ggatcagccc ccaaactcct catttatgac actactaagc gaccctcagg gattcctgac 240cgattctctg ggtccaagtc tggcacgtcg gccaccctgg gcatcaccgg actccggact 300ggggacgagg ccgtttatta ctgcagtgtg gtgcggtata attatgtgcg gctgcggttc 360ggaggaggca cccacctgac cgtcctcggt cagcccaagg cggcgccctc ggtcactctg 420ttcccaccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 480gacttctacc ctggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg 540ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac 600ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacaaaagct acagctgcca ggtcacgcat 660gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gctcatag 708<210>4<211>1422<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>4atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctacaggtgt ccagtcgcag 60gagcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagcagactg ggtcctcagt gagagtctcc 120tgcaaagctt ctggaggcac cttcagcaga tacgccatca actgggtgcg acaggtccct 180ggacaagggc ttgagtggat ggcagggatc atccctatct ttggtccacc aaagtatgca 240cagaaattcc agggcagagt ctccctgacc gcggacagat ccacgaacac agcctacatg 300gagatggccc gcctgaggtc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag accggggagg 360tttccgttgt atagggattg gcctgggttt gactactggg gccagggaac accggtcgcc 420gtctcctcgg cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1320agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422<210>5<211>1422<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>5atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctacaggtgt ccagtcgcag 60gagcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagcagactg ggtcctcagt gagagtctcc 120tgcaaagctt ctggaggcac cttcagcaga tacgccatca actgggtgcg acaggtccct 180ggacaagggc ttgagtggat ggcagggatc atccctatct ttggtccacc aaagtatgca 240cagaaattcc agggcagagt ctccctgacc gcggacagat ccacgaacac agcctacatg 300gagatggccc gcctgaggtc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag accggggagg 360tttccgttgt atagggattg gcctgggttt gactactggg gccagggaac accggtcgcc 420gtctcctcgg cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1320agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422<210>6<211>1422<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>6atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctacaggtgt ccagtcgcag 60gagcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagcagactg ggtcctcagt gagagtctcc 120tgcaaagctt ctggaggcac cttcagcaga tacgccatca actgggtgcg acaggtccct 180ggacaagggc ttgagtggat ggcagggatc atccctatct ttggtccacc aaagtatgca 240cagaaattcc agggcagagt ctccctgacc gcggacagat ccacgaacac agcctacatg 300gagatggccc gcctgaggtc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag agctccgact 360cctttgtatg atacggagac ggggccgtgg ggccagggaa caccggtcgc ctttgactac 420gtctcctcgg cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1320agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 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ctacaggtgt ccagtcgcag 60gagcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagcagactg ggtcctcagt gagagtctcc 120tgcaaagctt ctggaggcac cttcagcaga tacgccatca actgggtgcg acaggtccct 180ggacaagggc ttgagtggat ggcagggatc atccctatct ttggtccacc aaagtatgca 240cagaaattcc agggcagagt ctccctgacc gcggacagat ccacgaacac agcctacatg 300gagatggccc gcctgaggtc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag accggtgcct 360gcgacttatg agtctactgc tggttatttt gactactggg gccagggaac accggtcgcc 420gtctcctcgg cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1320agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422<210>9<211>708<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>9atgacctgct cccctctcct cctcaccctt ctcattcact gcacagggtc gtgggcccag 60tctgtgttga cgcagccgcc ctcagtgtct gcggccccag gacagaaggt caccatctcc 120tgctctggaa ggagctccac cattgcagtt aattctgttt cctggtacca gctgctccca 180ggatcagccc ccaaactcct catttatgac actactaagc gaccctcagg gattcctgac 240cgattctctg ggtccaagtc tggcacgtcg gccaccctgg gcatcaccgg 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权利要求
1.一种肽，它具有序列表中SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
2.一种人型抗人IgE单克隆抗体的筛选方法，其特征在于，该方法使用了权利要求1所述的肽。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，在用IgE体外致敏淋巴细胞，通过杂交瘤方法建立人型抗人IgE抗体产生细胞，然后检查细胞与具有序列表中SEQID NO1所示氨基酸序列的肽的结合活性，选出产生高抗原特异性抗体的细胞，得到人型抗人IgE单克隆抗体。
4.一种人型抗人IgE单克隆抗体，它具有以下性质(a)与权利要求1所述的肽结合，(b)与人IgE特异性结合，(c)与产生人IgE的细胞选择性结合，(d)与IgE致敏的肥大细胞或嗜碱细胞有结合性，且不诱导嗜碱细胞释放出血清素。
5.一种DNA，它编码权利要求4所述的人型抗人IgE单克隆抗体的H链或L链。
6.一种表达产物，它通过权利要求5所述的DNA经基因工程技术表达得到。
7.根据权利要求6所述的人型抗人IgE单克隆抗体，它有序列表中SEQ IDNO10(H链)和11(L链)记载的氨基酸序列。
8.一种DNA，它编码权利要求7所述的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的DNA，它具有序列表中SEQ ID NO2(H链)和3(L链)所示的核苷酸序列。
10.一种细胞，它被权利要求5、8或9所述的DNA转染。
11.一种微生物，它被权利要求5、8或9所述的DNA转染。
12.根据权利要求11所述的微生物，它是FERM P-17173。
13.一种药物，它含有权利要求4或7所述的人型抗人IgE单克隆抗体作为有效成分。
14.一种过敏症疾病治疗药，它含有权利要求4或7所述的人型抗人IgE单克隆抗体作为有效成分。
全文摘要
本发明提供了新的肽、用该肽的筛选方法以及该筛选方法获得的抗体。序列表中SEQ ID NO1记载的18个氨基酸组成的新的肽、用该肽筛选人型抗人IgE单克隆抗体的方法、该筛选方法得到的人型抗人IgE单克隆抗体。得到的抗体可用作过敏症疾病的预防和/或治疗药。
文档编号C07K7/08GK1418222SQ01806679
公开日2003年5月14日 申请日期2001年1月15日 优先权日2000年1月14日
发明者鹫田尚洋, 高桥研, 佐竹纪子, 藤濑畅彰, 田中秀树, 栗山昌之 申请人:第一制药株式会社