专利名称：羊胚胎体外培养液及其配制方法和羊胚胎体外培养方法
技术领域：
本发明公开了一种含鹿茸提取物的羊胚胎体外培养液及其配制方法，属家畜胚胎培养方法技术领域。
背景技术：
胚胎移植是一种应用于哺乳动物的繁殖新技术，是胚胎工程的重要组成部分，目前已成为一项比较成熟的生物技术通过胚胎移植可使优秀母畜最大限度地发挥在品种改良和育种工作中的良好作用。而胚胎的体外培养通常是成功进行胚胎移植的前序程序，如通过对胚胎的体外培养可以促进胚胎的发育以及寻求合适的移植培养液。胚胎切割是胚胎移植常用的辅助技术，通过对早期胚胎的切割，一方面可以增多胚胎数目，另一方面可以为胚胎早期性别鉴定提供材料。但胚胎切割对胚胎损伤较大，这些受损的胚胎需要在胚胎专用培养液中培养一段时间得到恢复，才能保证正常的发育。无论是全胚还是切割后的半胚(通常，对未经切割的完整胚胎称为全胚，对经切割而受损的非完整胚胎称为半胚)，在胚胎移植时都需要胚胎移植液。在实际应用中，国内使用的胚胎培养液及胚胎移植液大多依赖进口，且培养液与移植液采用不同的配方，移植成功率不高。
发明内容
本发明首先要解决的技术问题和提出的技术任务是克服利用现有胚胎培养液移植成功率不高的缺陷，提供一种可以兼做移植液的羊胚胎体外培养液；其次是提供这种羊胚胎体外培养液的配制方法；再次是提供一种羊胚胎体外培养的方法。为此，本发明采取以下技术方案一种羊胚胎体外培养液，是以常规胚胎培养液为基础培养液，其特征是其内还含有10～30μg/mL的鹿茸提取物以及体积百分含量为8％～20％的血清。
所述鹿茸提取物的含量为15μg/mL；所述血清的体积百分含量为10％。
一种羊胚胎体外培养液的配制方法，是以常规胚胎培养液为基础培养液，其特征是向其内溶入10～30μg/mL的鹿茸提取物以及体积百分含量为8％～20％的血清。
所述的鹿茸提取物是将鹿茸粉碎后经水煮、过滤、弃沉淀、上清液冷冻烘干并在～2～～6℃保存所得的冻干粉。
一种羊胚胎体外培养方法，其特征是以常规胚胎培养液为基础培养液，再加入10～30μg/mL的鹿茸提取物和体积百分含量为8％～20％的血清作为培养液并做成培养小滴在38～39℃环境中预热；获取怀孕5～6天的母羊桑葚期胚胎，用常规胚胎培养液冲洗后将胚胎放入培养小滴，在38～39℃、5％CO2的环境内进行培养，至囊胚期用以胚胎移植。
获取的桑葚期胚胎为全胚胎，培养1～3天，观察胚胎发育情况，记录发育到囊胚期胚胎的数目并进行胚胎移植。通过对全胚胎的培养，检验培养液对胚胎的适用性，进一步用于胚胎移植。
对获取的桑葚期胚胎进行切割成为半胚胎，于培养的第1天观察半胚恢复情况，记录恢复胚胎的数目；第2～3天，观察并统计发育到囊胚期胚胎的数目。以在具有全胚胎培养的目的外，经切割进行分别培养用于鉴定性别以确定移植的必要性。
于培养前两小时，在6cm培养皿中，用上述含鹿茸提取物的培养液做成50～100μL的培养小滴。
前述的常规胚胎培养液为磷酸盐缓冲液；所述的血清为小牛血清、胎牛血清或者新生牛血清。
鹿茸为梅花鹿或马鹿的尚未骨化的幼角。几千年来，鹿茸都被认为是一种名贵的滋补品，本草纲目记载鹿茸“生精补髓，养血益阳，强筋健骨，治一切虚损”。现代医学证明，鹿茸的药理作用非常广泛，对神经系统、心血管系统、性功能、血液等方面的疾病都有良好的治疗作用。另外，鹿茸中有些有效成分具有抗衰老作用、抗氧化作用、增强胃肠蠕动和促进分泌功能、增强机体的免疫功能等。
鹿茸的化学成分比较复杂，含下列5大类物质①骨质，胶质，磷酸钙；②蛋白质，多肽，氨基酸；③卵磷脂.脑磷脂，亚油酸等脂类物质；④RNA，DNA，ATP等核酸及其降解产物；⑤钙、磷、铁、锌等二十多种矿物元素。
本发明将中药中常用的鹿茸提取物应用到羊胚胎体外培养领域，解决了目前羊全胚体外发育率、胚胎移植怀孕率、切割后的胚胎体外发育率较低的问题。其经济成本较低，便于在生产中推广应用。本发明以鹿茸提取物作为培养液的组成成份，可使波尔山羊全胚体外发育率提高7％，移植受体妊娠率提高10％；山羊切割后胚胎发育率提高8％。湖羊全胚体外发育率提高9％，移植受体妊娠率提高13％；湖羊切割后胚胎发育率提高9％；大大提高山羊全胚胚胎移植产羔率和切割后半胚体外发育率。
以下通过具体实施方式
对本发明做进一步的说明。
具体实施例方式
实施例1(1)提取鹿茸提取物将梅花鹿茸去垢除血，用电烧水锅沸水炸煮鹿茸，远红外烤箱50～60℃烘烤鹿茸2～6小时。用半自动切片机切成0.35～0.50毫米厚的片状，加入到粉碎机使鹿茸粉碎成400目大小的颗粒，水煮2～4小时，过滤，弃沉淀，上清液用冷冻干燥仪干燥10～25小时，制成冻干粉，称重、分装。
(2)制作含鹿茸的培养液将鹿茸冻干粉1毫克、小牛血清(FCS)8毫升加入量筒，再向量筒内缓慢加入磷酸盐缓冲液(PBS)至100毫升，其间令鹿茸冻干粉、小牛血清充分溶入磷酸盐缓冲液，即配成含鹿茸提取物10μg/mL、小牛血清8％(体积百分含量)的胚胎培养液。(备注磷酸盐缓冲液为胚胎工程常用溶液其配方为1000ml中含34.0g无水磷酸二氢钾和35.5g无水磷酸氢二钠，PH值为6.85。)(3)山羊全胚及半胚体外培养全胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物10μg/mL、含血清8％的培养液做成50～100μL的培养小滴，置入38～39℃培养箱中预热。对怀孕5～6天的波尔山羊，手术法获取桑葚期胚胎200枚，用含8％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸提取物的培养滴中，另100枚放入对照组仅含10％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，在38～39℃、5％CO2培养箱中进行培养，1～3天后，观察胚胎发育情况，记录对照组和试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为65，72。并用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清8％的培养液作为移植液进行胚胎移植，两组受体妊娠头数分别为68和78。
半胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物10μg/mL、含血清8％的培养液做成50～100μL的培养小滴，置入38～39℃培养箱中预热。将桑葚期切割后的波尔山羊胚胎200枚，用含10％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含10％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培养箱中培养1～3天，于培养的第2～3天观察并统计对照组及试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为63和71。并用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清8％的培养液作为移植液进行胚胎移植，两组受体妊娠头数分别为42和51。
(4)湖羊全胚及半胚体外培养全胚培养培养前两小时，用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清8％的培养液作为移植液做成50～100μL的培养小滴，置38～39℃培养箱中预热。对怀孕5～6天的湖羊，手术法获取桑葚期胚胎200枚，用含8％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含8％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培养箱中进行培养，1～3天后，观察胚胎发育情况，记录对照组和试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为63和72，并用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清8％的培养液作为移植液进行胚胎移植，受体妊娠头数分别为68和81。
半胚培养培养前两小时，用上述含鹿茸提取物10μg/mL的培养液和含10％血清的对照组培养液做成50～100μL的培养小滴，置38～39℃培养箱中预热。将桑葚期切割后的湖羊胚胎用含10％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含10％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培养箱中培养1～3天，于培养的第2～3天，观察并统计对照组和试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为61和70。并用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清8％的培养液作为移植液进行胚胎移植，受体妊娠头数分别为39和52。
(5)检测结果经上述在产业中试水平上进行的具体实施，对其结果进行综合检测，其结果如下对100枚波尔山羊全胚、100枚波尔山羊切割后的半胚、100枚湖羊全胚、100枚湖羊半胚进行处理，另各选100枚波尔山羊及湖羊胚胎为对照。在波尔山羊方面，对照组全胚体外发育率为65％，胚胎移植受体妊娠率68％，半胚体外发育率为63％，半胚移植受体妊娠率为42％；而实验组全胚体外发育率为72％，比对照组提高7％，胚胎移植受体妊娠率78％，比对照组提高10％，半胚体外发育率为71％，比对照组提高8％，半胚移植受体妊娠率为51％，比对照组提高9％。在湖羊方面，对照组全胚体外发育率为63％，胚胎移植受体妊娠率68％，半胚体外发育率为61％，半胚移植受体妊娠率为39％；而实验组全胚体外发育率为72％，比对照组提高9％，胚胎移植受体妊娠率81％，比对照组提高13％，半胚体外发育率为70％，半胚移植受体妊娠率为52％，比对照组提高13％。
实施例2(1)提取鹿茸提取物将梅花鹿茸去垢除血，用电烧水锅炸煮鹿茸，远红外烤箱50～60℃烘烤鹿茸2～6小时。用半自动切片机切成0.35～0.50毫米厚的片状，加入到粉碎机使鹿茸粉碎成400目大小的颗粒，水煮2～4小时，过滤，弃沉淀，上清液用冷冻干燥仪干燥10～25小时，制成冻干粉，称重、分装。
(2)制作含鹿茸的培养液将鹿茸冻干粉3毫克、小牛血清(FCS)8毫升加入量筒，再向量筒内缓慢加入磷酸盐缓冲液(PBS)至100毫升，其间令鹿茸冻干粉、小牛血清充分溶入磷酸盐缓冲液，即配成含鹿茸提取物30μg/mL、小牛血清8％(体积百分含量)的胚胎培养液。
(3)山羊全胚及半胚体外培养全胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物30μg/mL、含血清8％的培养液做成50～100μL的培养小滴，置入38～39℃培养箱中预热。对怀孕5～6天的波尔山羊，手术法获取桑葚期胚胎200枚，用含8％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含8％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，在38～39℃、5％CO2培养箱中进行培养，1～3天后，观察胚胎发育情况，记录对照组和试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为65和72。并用上述含鹿茸提取物30μg/mL、含小牛血清8％的培养液作为移植液进行胚胎移植，两组受体妊娠头数分别为68和78。
半胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物30μg/mL、含血清8％的培养液做成50～100μL的培养小滴，置入38～39℃培养箱中预热。将桑葚期切割后的波尔山羊胚胎200枚，用含8％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含8％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培养箱中培养1～3天，于培养的第2～3天观察并统计对照组及试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为63和71。并用上述含鹿茸提取物30μg/mL、含小牛血清8％的培养液作为移植液进行胚胎移植，两组受体妊娠头数分别为42和51。
(4)湖羊全胚及半胚体外培养全胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物30μg/mL、含血清8％的培养液做成50～100μL的培养小滴，置入38～39℃培养箱中预热。对怀孕5～6天的湖羊，手术法获取桑葚期胚胎200枚，用含8％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含8％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培养箱中进行培养，1～3天后，观察胚胎发育情况，记录对照组和试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为63和72，并用上述含鹿茸提取物30μg/mL、含小牛血清8％的培养液作为移植液进行胚胎移植，受体妊娠头数分别为68和81。
半胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物30μg/mL、含血清8％的培养液做成50～100μL的培养小滴，置入38～39℃培养箱中预热。将桑葚期切割后的湖羊胚胎用含8％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含8％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培养箱中培养1-3天，于培养的第2-3天，观察并统计对照组和试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为61和70。并用上述含鹿茸提取物30μg/mL、含小牛血清8％的培养液作为移植液进行胚胎移植，两组受体妊娠头数分别为39和52。
其检测结果同实施例1。
(5)检测结果经上述在产业中试水平上进行的具体实施，对其结果进行综合检测，其结果如下对100枚波尔山羊全胚、100枚波尔山羊切割后的半胚、100枚湖羊全胚、100枚湖羊半胚进行处理，另各选100枚波尔山羊及湖羊胚胎为对照。在波尔山羊方面，对照组全胚体外发育率为65％，胚胎移植受体妊娠率68％，半胚体外发育率为63％，半胚移植受体妊娠率为42％；而实验组全胚体外发育率为72％，比对照组提高7％，胚胎移植受体妊娠率78％，比对照组提高10％，半胚体外发育率为71％，比对照组提高8％，半胚移植受体妊娠率为51％，比对照组提高9％。在湖羊方面，对照组全胚体外发育率为63％，胚胎移植受体妊娠率68％，半胚体外发育率为61％，半胚移植受体妊娠率为39％；而实验组全胚体外发育率为72％，比对照组提高9％，胚胎移植受体妊娠率81％，比对照组提高13％，半胚体外发育率为70％，比对照组提高9％，半胚移植受体妊娠率为52％，比对照组提高13％。
实施例3(1)提取鹿茸提取物同实施例一。
(2)制作含鹿茸的培养液将鹿茸冻干粉1毫克、小牛血清(FCS)20毫升加入量筒，再向量筒内缓慢加入磷酸盐缓冲液(PBS)至100毫升，其间令鹿茸冻干粉、小牛血清充分溶入磷酸盐缓冲液，即配成含鹿茸提取物10μg/mL、小牛血清20％(体积百分含量)的胚胎培养液。
(3)山羊全胚及半胚体外培养全胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物10μg/mL、小牛血清20％(体积百分含量)的胚胎培养液做成50～100μL的培养小滴，置38～39℃培养箱中预热。对怀孕5～6天的波尔山羊，手术法获取桑葚期胚胎200枚，用含20％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含20％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，在38～39℃、5％CO2培养箱进行培养，1～3天后，观察胚胎发育情况，记录对照组和试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为65，72。并用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清20％的培养液作为移植液进行胚胎移植，两组受体妊娠头数分别为68和78。
半胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物10μg/mL、小牛血清20％(体积百分含量)的胚胎培养液做成50～100μL的培养小滴，置38～39℃培养箱中预热。将桑葚期切割后的波尔山羊胚胎200枚，用含10％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含20％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培养箱中培养1～3天，于培养的第2～3天观察并统计对照组及试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为63和71。并用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清20％的培养液作为移植液进行胚胎移植，两组受体妊娠头数分别为42和51。
(4)湖羊全胚及半胚体外培养全胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物10μg/mL、小牛血清20％(体积百分含量)的胚胎培养液做成50～100μL的培养小滴，置38～39℃培养箱中预热。对怀孕5～6天的湖羊，手术法获取桑葚期胚胎200枚，用含20％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含10％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培养箱中进行培养，1～3天后，观察胚胎发育情况，记录对照组和试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为63和72，并用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清20％的培养液作为移植液进行胚胎移植，受体妊娠头数分别为68和81。
半胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物10μg/mL、小牛血清20％(体积百分含量)的胚胎培养液做成50～100μL的培养小滴，置38～39℃培养箱中预热。将桑葚期切割后的湖羊胚胎用含10％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含20％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培养箱中培养1～3天，于培养的第2～3天，观察并统计对照组和试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为61和70。并用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清20％的培养液作为移植液进行胚胎移植，两组受体妊娠头数分别为39和52。
(5)检测结果经上述在产业中试水平上进行的具体实施，对其结果进行综合检测，其结果如下对100枚波尔山羊全胚、100枚波尔山羊切割后的半胚、100枚湖羊全胚、100枚湖羊半胚进行处理，另各选100枚波尔山羊及湖羊胚胎为对照。在波尔山羊方面，对照组全胚体外发育率为65％，胚胎移植受体妊娠率68％，半胚体外发育率为63％，半胚移植受体妊娠率为42％；而实验组全胚体外发育率为72％，比对照组提高7％，胚胎移植受体妊娠率78％，比对照组提高10％，半胚体外发育率为71％，比对照组提高8％，半胚移植受体妊娠率为51％，比对照组提高9％。在湖羊方面，对照组全胚体外发育率为63％，胚胎移植受体妊娠率68％，半胚体外发育率为61％，半胚移植受体妊娠率为39％；而实验组全胚体外发育率为72％，比对照组提高9％，胚胎移植受体妊娠率81％，比对照组提高13％，半胚体外发育率为70％，半胚移植受体妊娠率为52％，比对照组提高13％。
实施例4(1)提取鹿茸提取物同实施例一。
(2)制作含鹿茸的培养液将鹿茸冻干粉3毫克、小牛血清(FCS)20毫升加入量筒，再向量筒内缓慢加入磷酸盐缓冲液(PBS)至100毫升，其间令鹿茸冻干粉、小牛血清充分溶入磷酸盐缓冲液，即配成含鹿茸提取物30μg/mL、小牛血清20％(体积百分含量)的胚胎培养液。
(3)山羊全胚及半胚体外培养全胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物30μg/mL、小牛血清20％(体积百分含量)的胚胎培养液做成50～100μL的培养小滴，置38～39℃培养箱中预热。对怀孕5～6天的波尔山羊，手术法获取桑葚期胚胎200枚，用含20％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含20％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，在38～39℃、5％CO2培养箱进行培养，1～3天后，观察胚胎发育情况，记录对照组和试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为65，72。并用上述含鹿茸提取物30μg/mL、含小牛血清20％的培养液作为移植液进行胚胎移植，两组受体妊娠头数分别为66和78。
半胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物30μg/mL、小牛血清20％(体积百分含量)的胚胎培养液做成50～100μL的培养小滴，置38～39℃培养箱中预热。将桑葚期切割后的波尔山羊胚胎200枚，用含20％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含20％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培养箱中培养1～3天，于培养的第2～3天观察并统计对照组及试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为63和72。并用上述含鹿茸提取物30μg/mL、含小牛血清20％的培养液作为移植液进行胚胎移植，两组受体妊娠头数分别为42和51。
(4)湖羊全胚及半胚体外培养全胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物30μg/mL、小牛血清20％(体积百分含量)的胚胎培养液做成50～100μL的培养小滴，置38～39℃培养箱中预热。对怀孕5～6天的湖羊，手术法获取桑葚期胚胎200枚，用含20％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含20％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培养箱中进行培养，1～3天后，观察胚胎发育情况，记录对照组和试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为63和72，并用上述含鹿茸提取物30μg/mL、含小牛血清20％的培养液作为移植液进行胚胎移植，受体妊娠头数分别为67和80。
半胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物30μg/mL、小牛血清20％(体积百分含量)的胚胎培养液做成50～100μL的培养小滴，置38～39℃培养箱中预热。将桑葚期切割后的湖羊胚胎用含20％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含20％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培养箱中培养1～3天，于培养的第2～3天，观察并统计对照组和试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为61和70。并用上述含鹿茸提取物30μg/mL、含小牛血清20％的培养液作为移植液进行胚胎移植，两组受体妊娠头数分别为39和52。
(5)检测结果经上述在产业中试水平上进行的具体实施，对其结果进行综合检测，其结果如下对100枚波尔山羊全胚、100枚波尔山羊切割后的半胚、100枚湖羊全胚、100枚湖羊半胚进行处理，另各选100枚波尔山羊及湖羊胚胎为对照。在波尔山羊方面，对照组全胚体外发育率为65％，胚胎移植受体妊娠率68％，半胚体外发育率为63％，半胚移植受体妊娠率为42％；而实验组全胚体外发育率为72％，比对照组提高7％，胚胎移植受体妊娠率78％，比对照组提高10％，半胚体外发育率为71％，比对照组提高8％，半胚移植受体妊娠率为51％，比对照组提高9％。在湖羊方面，对照组全胚体外发育率为63％，胚胎移植受体妊娠率68％，半胚体外发育率为61％，半胚移植受体妊娠率为39％；而实验组全胚体外发育率为72％，比对照组提高9％，胚胎移植受体妊娠率81％，比对照组提高13％，半胚体外发育率为70％，半胚移植受体妊娠率为52％，比对照组提高13％。
实施例5(1)提取鹿茸提取物同实施例一。
(2)制作含鹿茸的培养液将鹿茸冻干粉2毫克、小牛血清(FCS)10毫升加入量筒，再向量筒内缓慢加入磷酸盐缓冲液(PBS)至100毫升，其间令鹿茸冻干粉、小牛血清充分溶入磷酸盐缓冲液，即配成含鹿茸提取物20μg/mL、小牛血清10％(体积百分含量)的胚胎培养液。
(3)山羊全胚及半胚体外培养全胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物20μg/mL、小牛血清10％(体积百分含量)的胚胎培养液做成50～100μL的培养小滴，置38～39℃培养箱中预热。对怀孕5～6天的波尔山羊，手术法获取桑葚期胚胎200枚，用含10％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含10％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，在38～39℃、5％CO2培养箱进行培养，1～3天后，观察胚胎发育情况，记录对照组和试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为65，72。并用上述含鹿茸提取物20μg/mL、含小牛血清10％的培养液作为移植液进行胚胎移植，两组受体妊娠头数分别为68和78。
半胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物20μg/mL、小牛血清10％(体积百分含量)的胚胎培养液做成50～100μL的培养小滴，置38～39℃培养箱中预热。将桑葚期切割后的波尔山羊胚胎200枚，用含10％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含10％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培养箱中培养1～3天，于培养的第2～3天观察并统计对照组及试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为63和71。并用上述含鹿茸提取物20μg/mL、含小牛血清10％的培养液作为移植液进行胚胎移植，两组受体妊娠头数分别为42和51。
(4)湖羊全胚及半胚体外培养全胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物20μg/mL、小牛血清10％(体积百分含量)的胚胎培养液做成50～100μL的培养小滴，置38～39℃培养箱中预热。对怀孕5～6天的湖羊，手术法获取桑葚期胚胎200枚，用含10％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含10％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培养箱中进行培养，1～3天后，观察胚胎发育情况，记录对照组和试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为63和72，并用上述含鹿茸提取物20μg/mL、含小牛血清10％的培养液作为移植液进行胚胎移植，受体妊娠头数分别为68和81。
半胚培养培养前两小时，在6cm培养皿中，用100μl的移液器将上述含鹿茸提取物20μg/mL、小牛血清10％(体积百分含量)的胚胎培养液做成50～100μL的培养小滴，置38～39℃培养箱中预热。将桑葚期切割后的湖羊胚胎用含10％FCS的PBS冲洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培养滴中，另100枚放入对照组含10％血清的培养滴中，每滴培养液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培养箱中培养1～3天，于培养的第2～3天，观察并统计对照组和试验组发育到囊胚期胚胎的数目分别为61和70。并用上述含鹿茸提取物20μg/mL、含小牛血清10％的培养液作为移植液进行胚胎移植，两组受体妊娠头数分别为39和52。
(5)检测结果经上述在产业中试水平上进行的具体实施，对其结果进行综合检测，其结果如下对100枚波尔山羊全胚、100枚波尔山羊切割后的半胚、100枚湖羊全胚、100枚湖羊半胚进行处理，另各选100枚波尔山羊及湖羊胚胎为对照。在波尔山羊方面，对照组全胚体外发育率为65％，胚胎移植受体妊娠率68％，半胚体外发育率为63％，半胚移植受体妊娠率为42％；而实验组全胚体外发育率为72％，比对照组提高7％，胚胎移植受体妊娠率78％，比对照组提高10％，半胚体外发育率为71％，比对照组提高8％，半胚移植受体妊娠率为51％，比对照组提高9％。在湖羊方面，对照组全胚体外发育率为63％，胚胎移植受体妊娠率68％，半胚体外发育率为61％，半胚移植受体妊娠率为39％；而实验组全胚体外发育率为72％，比对照组提高9％，胚胎移植受体妊娠率81％，比对照组提高13％，半胚体外发育率为70％，半胚移植受体妊娠率为52％，比对照组提高13％。
权利要求
1.一种羊胚胎体外培养液，是以常规胚胎培养液为基础培养液，其特征是其内还含有10～30μg/mL的鹿茸提取物以及体积百分含量为8％～20％的血清。
2.根据权利要求1所述的羊胚胎体外培养液，其特征是所述的常规胚胎培养液为磷酸盐缓冲液；所述的血清为小牛血清、胎牛血清或者新生牛血清。
3.根据权利要求1或2所述的羊胚胎体外培养液，其特征是所述鹿茸提取物的含量为15μg/mL；所述血清的体积百分含量为10％。
4.一种羊胚胎体外培养液的配制方法，是以常规胚胎培养液为基础培养液，其特征是向其内溶入10～30μg/mL的鹿茸提取物以及体积百分含量为8％～20％的血清。
5.根据权利要求4所述的羊胚胎体外培养液的配制方法，其特征是所述的常规胚胎培养液为磷酸盐缓冲液；所述的血清为小牛血清、胎牛血清或者新生牛血清。
6.根据权利要求4或5所述的羊胚胎体外培养液的配制方法，其特征是所述的鹿茸提取物是将鹿茸粉碎后经水煮、过滤、弃沉淀、上清液冷冻烘干并在～2～～6℃保存所得的冻干粉。
7.一种羊胚胎体外培养方法，其特征是以常规胚胎培养液为基础培养液，再加入10～30μg/mL的鹿茸提取物和体积百分含量为8％～20％的血清作为培养液并做成培养小滴在38～39℃环境中预热；获取怀孕5～6天的母羊桑葚期胚胎，用常规胚胎培养液冲洗后将胚胎放入培养小滴，在38～39℃、5％CO2的环境内进行培养，至囊胚期用以胚胎移植。
8.根据权利要求7所述的羊胚胎体外培养方法，其特征是获取的桑葚期胚胎为全胚胎，培养1～3天，观察胚胎发育情况，记录发育到囊胚期胚胎的数目并进行胚胎移植。
9.根据权利要求7所述的羊胚胎体外培养方法，其特征是对获取的桑葚期胚胎进行切割成为半胚胎，于培养的第1天观察半胚恢复情况，记录恢复胚胎的数目；第2～3天，观察并统计发育到囊胚期胚胎的数目。
10.根据权利要求7、8或9所述的羊胚胎体外培养方法，其特征是于培养前两小时，在6cm培养皿中，用上述含鹿茸提取物的培养液做成50～100μL的培养小滴。
全文摘要
本发明属家畜胚胎培养方法技术领域，公开了一种含鹿茸提取物的羊胚胎体外培养液及其配制方法和胚胎的体外培养方法，它主要是从鹿茸中提取鹿茸提取物，并加入常规胚胎培养液，进行羊全胚及切割后的胚胎进行体外培养，并利用该培养液进行羊全胚移植。本发明将中药中常用的鹿茸提取物应用到羊胚胎体外培养领域，解决了目前羊全胚体外发育率、胚胎移植怀孕率、切割后的胚胎体外发育率较低的问题。其经济成本较低，便于在生产中推广应用。
文档编号C12N5/073GK1978633SQ20051006175
公开日2007年6月13日 申请日期2005年12月1日 优先权日2005年12月1日
发明者徐雪明, 俞颂东, 王争光, 王锡炉, 张锐 申请人:新昌县大东种畜发展有限公司