专利名称：具有t细胞辅助活性的肽类的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及能够刺激T细胞辅助活性的合成肽类。更具体地说，本发明的肽类是以胸脾素(thysplenin)分子为基础的四肽和五肽。
现已分别从牛和人的胸腺和脾脏分离出了两种免疫调节蛋白胸腺生成素和胸脾素(以前称为“脾素”)。此外，用化学方法还合成了一些具有胸腺生成素生物活性的小肽·并进一步进行了修饰使其具有诸如对酶作用具有抗性等性质。参见例如美国专利4，505，853。
现已发表了大量有关这类蛋白和合成肽类的文章和专利。美国专利4，190，646公开了一种叫做胸腺五肽(thymopentin)的五肽·它是胸腺生成素的活性部位，其顺序为Arg-Lys-Asp-Val-Tyr;该专利还公开了一些肽组合物，其中这个五肽的氨基末端和/或羧基末端被各种不同的基团取代。胸腺生成素和胸腺五肽都能在两个人T细胞系，即CEM和MOLT-4中诱导生物学变化，从而表明它们具有刺激T细胞生物活性的作用。没有发现任何比五肽(即5个氨基酸顺序)短的胸腺五肽类似物对CEM细胞具有活性。
申请人的共同未决美国专利申请53186公开了一种自人脾分离的48个氨基酸的免疫调节蛋白脾素(以下称作“胸脾素”)。牛胸脾素在小鼠体内能刺激T细胞辅助活性。因此预计人胸脾素在人体内具有类似的生物活性。上述专利申请叙述了人胸脾素在人T细胞系MOLT-4中能诱导细胞内cGMP升高。牛胸脾素的活性部位(称为Sp-5)跨过该分子的32-36位氨基酸残基，其顺序为Arg-Lys-Glu-Val-Tyr。在56，186号申请中，所公开的人胸脾素活性部位的顺序为Arg-Lys-Ala-Val-Tyr。
胸脾素不同于胸腺生成素，它不使CEM细胞的生物活性发生变化。因此胸脾素是刺激T细胞辅助活性，而不是刺激T细胞抑制活性。可参阅例如 Goldstein，G.Nature(London)24711-14(1974);Basch，R.S.and Goldstein，G.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，711474-1478(1974);Scheld，M.P.et al J.Exp.Med.，1471727-1743(1978);Scheid，M.P.et al Science，1901211-1213(1975);Ranges，G.E.et al，J.Exp.Med.，1561057-1064(1982);T.Audhya et al.，Biochem，206195-6200(1981);Venkatasubramanian，K.，et al，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，833171-3174(1986);Malaise M.G.et al，in "Immunoregulatory UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology"，eds.Goldstein，G.，et al (Liss，New York)(1986);Sunshine，G.H.et al，J.Immunol.，1201594-1599(1978);E.Rentz et al，Arch.Geschwulstforsch，54(2)113-118(1948)。还可参阅美国专利4，190，646;4，261，886;4，361，673;4，420，424;4，629，723。参考上述专利、申请和论文是为了讨论本发明所涉及的其它背景材料和生物学过程。
1984年1月31日颁发的Kisfaludy等人的美国专利4，428，938，公开了某些影响免疫调节的肽，其中包括下列四肽
Arg-Lys-Asp-ValArg-Lys-Asn-ValArg-Lys-Ala-ValArg-Lys-Asp-AlaArg-Lys-Asp-IleArg-Lys-Glu-ValGlp-Arg-Lys-Asp4，428，938号专利一般包括这些顺序的盐、酰胺、低级烷基酯和被保护的衍生物，以及用这些顺序治疗由胸腺缺损造成的免疫失调症的方法。在该专利中，用体外E玫瑰花试验测试了这些肽的活性。
这些研究人员还在另一篇论文中报导了上述四肽(Kisfaludy et al，Hoppe-Seyler′s Z， Physiol，Chem.B.D.364，S.933-940，1983)。该文报导了Arg-Lys-Glu-Val顺序是一种在体外E玫瑰花试验中具有高度活性的类似物，而Arg-Ala-Asp-Val和Arg-Lys-Ala-Val顺序的活性剧烈下降。
本领域内仍然需要另一些可用来刺激人的免疫系统的肽类，用于治疗各种T细胞缺损症。
本发明描述了一组在MOLT-4T细胞系中能够诱导生物活性的胸脾素肽类似物。与以前报导的胸腺五肽类似物不同的是，与胸脾素有关的，长度短于5个氨基酸的肽类，与此处所述的胸脾素五肽类似物一样，在MOLT-4细胞中具有诱导T细胞辅助活性的作用。
一方面，本发明涉及具有下式的新的四肽或其药学上可接受的酸加成盐或碱加成盐
其中R为H、低级烷基、乙酰基、甲酰基、低级链烷酰基;
X为Pro、脱氢-Pro、羟基-Pro、D-Lys、α-甲基丙氨酸(Aib)或Lys;
Y为选自Ala、Asp、Glu、Gln、Asn、β-Asp、Val、Leu或Ile的D或L氨基酸;
Z为Gly或选自Val、Ala、Leu或Ile的D或L氨基酸;
R1为OH或NR2R3，其中R2和R3为H或含1至6个碳原子的直链或支链烷基或烯基，视需要可被一个芳基或带有取代基的芳基取代，所述取代基或者是一个卤素，或者是一个含1-6个碳原子的直链或支链烷基或烯基;或者，R2和R3一起构成一个有3至7个碳原子的环亚甲基;
条件是，当X为Lys，Z为Val时，Y不为Asp、Asn、Ala、Asu或Glu;当X为Lys时，Y不为Asp;当X为Ala，Z为Val时，Y不为Asp。
另一方面本发明涉及具有下式的新的五肽或其药学上可接受的酸加成盐或碱加成盐，其特征是在人T细胞系MOLT-4中能够增强cGMP活性。
其中R2为H、低级烷基、乙酰基、甲酰基、低级链、烷酰基或脱氨基;
X′为Pro、脱氢-Pro、羟基-Pro、D-Lys、Aib或Lys;
Y′为选自Val、Ile、Leu、Lys、Ala、Asp、Glu、Gln的D或L氨基酸;
Z′为选自Tyr、Val、Leu、His、Ala或Trp的D或L氨基酸;
R3为OH或NR4R5，其中R4和R5为H或一个含1-6个碳原子的直链或支链烷基或烯基，视需要可被一个芳基或带取代基的芳基取代，所述取代基或者是一个卤素、或者是一个含1至6个碳原子的直链或支链烷基或烯基;或者，R4和R5一起构成一个有3至7个碳原子的环亚甲基。
这些肽和含有这些肽的组合物令人惊奇地保留了人胸脾素的生物活性。这些肽中有许多还具有如下特征，即它们在消化道和血清中对内肽酶、外肽酶和胰蛋白酶样酶作用的抗性增强。因此，这些肽治疗免疫缺陷具有显著优点。特别是，其中X或X′为Pro或Aib的目的四肽或五肽对诸如血清肽酶等酶的降解作用具有令人惊奇的抗性。
又一方面本发明包括含有这些肽的治疗组合物和用这些肽治疗各种需要免疫调节的病症的方法。
下面详细叙述包括优选实施方案的实例，公开本发明的其它方面和优点。
图1是MOLT-4 cGMP测定的图示，将肽浓度(μg/ml)对cGMP浓度(微微克/ml)作图，其中比较了胸腺五肽(TP-5)和本发明肽相对于对照的活性。
图2是MOLT-4 cGMP测定的图示，将肽浓度(μg/ml)对cGMP浓度(微微克/ml)作图，其中比较了胸腺五肽(TP-5)和本发明的一种肽Ac-Arg-Pro-Val-Ala-NH2的活性。
本发明提供一组具有下式的四肽或其药学上可接受的酸加成盐或碱加成盐
其中，R、X、Y、Z和R1如上所限定，条件是，当X为Lys，Z为Val时，Y不为Asp、Asn、Ala、Asu或Glu;当X为Lys时，Y不为Asp;当X为Ala，Z为Val时，Y不为Asp。本发明还提供一组具有下式的五肽或其药学上可接受的酸加成盐或碱加成盐，其特征是在MOLT-4细胞中能够诱导活性。
其中R2、X′、Y′、Z′和R3如上所限定。
此处所用的术语“低级烷基”包括含1至6个碳原子的支链或直链饱和烃基，例如甲基、乙基。丙基、异丙基、戊基、己基等，而术语“低级链烷酰基”指低级烷基 为方便起见，在整个本公开中，肽的氨基酸成分和某些用于制备肽的物质用缩写表示。多数用三字母缩写的氨基酸是熟悉的。几个不常见缩写是Asu，代表氨基琥珀酰亚胺基;Glp，代表焦谷氨酰基(也写作p-Glu)。除非另外指出，所有氨基酸都是L-异构体构型。如果有D-异构体构型，则将以“D-”标明。
本发明的某些优选的四肽是上述式I中X为Pro或Aib的四肽。更为优选的肽是式I中X为Pro，Y为Val，Z为Ala或X为Pro，Y为Ala，Z为Val的肽。一些优选的四肽为下列肽乙酰基-Arg-Pro-Val-Ala-NH2Arg-Pro-Asp-ValArg-Pro-Asp-Val-NH2甲酰基-Arg-Pro-Asp-Val乙酰基-Arg-Pro-Asp-Val乙酰基-Arg-Pro-Asp-Val-NH2乙酰基-Arg-Pro-Ala-Val-NH2乙酰基-Arg-Pro-D-β-Asp-Val-NH2乙酰基-Arg-Pro-Glu-Val-NH2乙酰基-Arg-Pro-Glu-Val乙酰基-Arg-Aib-Ala-Val-NH2乙酰基-Arg-Aib-Glu-Val-NH2乙酰基-Arg-Pro-β-Asp-Gly-NH2本发明的某些优选的五肽是式Ⅱ中X′为Pro或Aib的五肽。更为优选的肽是上式Ⅱ中X′为Pro，Y′为Val，Z′为Tyr的肽。更为优选的五肽是下列肽
Arg-Pro-Ala-Val-TyrArg-Pro-Ala-Val-Tyr-NH2乙酰基-Arg-Lys-Ala-Val-Tyr-NH2能与这些肽形成盐的酸包括(但不限于)无机酸，例如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸等。也可以应用有机酸来形成本发明的盐，例如可以应用甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、氨茴酸、肉桂酸、萘磺酸、磺胺酸等。
能与具有酸性基团的肽形成盐的碱包括(但不限于)无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾等。可作此用的有机碱包括(但不限于)单二和三烷基和芳基胺(例如三乙胺、二异丙胺、甲胺、二甲胺)及取代和未取代的乙醇胺(例如乙醇胺、二乙醇胺)。
本发明的肽一般可按照已知技术制备。可以方便地按固相合成法(Merrifield，J.A.C.S.852149-2154，1963)制备本发明的多肽。此技术是十分熟悉的制备肽的通用方法。固相合成法包括向以共价键结合在固体树脂颗粒上的正在增长的肽链中，分步加入被保护的氨基酸。进行这一操作时，利用过滤可除去各种试剂和副产物，因而中间体无需纯化。此方法的一般概念取决于该链的第一个氨基酸通过共价键与一种固体聚合物连接。以分步方式依次加入被保护的氨基酸，一次加入一种氨基酸或分批加入(in blocks)，直到所要的顺序组合。最后，从固体树脂载体上分离出被保护的肽，并脱去保护基。
氨基酸可以连接到任何适于作树脂的聚合物上。该树脂必须含有一个官能团，第一个被保护的氨基酸能以共价键牢固地连接在该官能团上。各种聚合物都适于此目的，例如纤维素、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯。可用于这类合成的适当保护基包括叔丁氧羰基(BOC)、苄基(BZL)、叔戊氧羰基(AOC)、甲苯磺酰基(TOS)、邻溴苯基甲氧羰基(BrZ)、2，6-二氯苄基(BZLCl2)和苯基甲氧羰基(Y或CBZ)在上述文献及J.F.W.McOmie.“Protective Groups in Organic Chemistry”，Plenum Press，New York，1973中确定了另一些保护基。这两本书在此都列为参考文献。
制备本发明肽的一般步骤包括先使被保护的C末端氨基酸与树脂连接。连接后滤出树脂，洗涤，并脱去C末端氨基酸的α氨基上的保护基(最好是叔丁氧羰基)。当然，脱去这个保护基时，必须不断裂该氨基酸和树脂间的连键。然后在所得的树脂肽上偶联倒数第二个C末端被保护的氨基酸。进行这一偶联时，在第二个氨基酸的游离羧基和连在树脂上的第一个氨基酸的氨基之间形成一个酰胺键。用顺序的氨基酸重复这一反应过程，直到所有氨基酸都连到树脂上。最后，从树脂上切落被保护的肽，脱去保护基，得到所要的肽。用来从树脂中分离肽的切落技术和脱去保护基的技术，取决于选择的树脂和保护基，这些技术对熟悉肽合成领域的人来说是已知的。
另一些肽合成技术见Bodanszky等“Peptide Synthesis”，第2版，John Wiley and Sons，1976。例如，本发明的肽也可以用标准的溶液肽合成法来合成，该方法包括，利用形成酰胺键的化学或酶方法分步或封闭偶联氨基酸或肽片段。这些溶液合成法在本领域内是已知的。
本发明的肽还可以利用本领域专业人员已知的其它技术，如基因工程技术来制备(参见例如T.Maniatis et al.，Molecular Cloning.a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1982)。
现已发现，本发明的肽与上面引用的美国专利申请和论文中所公开的人胸脾素具有相似的生物活性。这种生物活性主要是通过一种试验来证实的，这一试验测定了在人T细胞系MOLT-4中诱导生成的cGMP，并与人胸脾素和人胸腺五肽进行比较。在本试验中由本发明的一种肽诱导生成的cGMP表明，该肽能够与人细胞上胸脾素受体部位结合，并诱导人胸脾素样生物活性。
许多目的四肽和五肽比人胸脾素具有更显著的优点。本发明的许多肽都具有抵抗由消化酶或血清酶引起的降解的特征。因此当给生物学实验对象注射它们时，其体内半寿期延长。其中许多肽的另一个优点是能够口服给药。人胸脾素本身分子太大，不能有效地口服给药，而且会在胃肠道内被消化。
在对本发明肽进行测试之前，并没有预料能得到与人胸脾素具有相同生物特异性的四肽或五肽类似物，因为人的牛五肽Sp-5(Arg-Lys-Glu-Val-Tyr)类似物Arg-Lys-Ala-Val-Tyr对MOLT-4细胞没有活性。因而，具有与完整的人胸脾素分子相同生物活性的人胸脾素五肽类似物和四肽类似物的发现是出人意料的。
由于目的肽具有免疫调节特性，所以它们可用于人体的治疗，也可能用于动物的治疗，因为它们具有诱导T细胞分化和成熟的能力，而这些T细胞能够参与机体的免疫反应。因而，认为这些目的肽具有多种治疗用途。
本发明的肽被认为可用来辅助机体的集合免疫(collectiveimmunity)，因为它们能增强或辅助对细胞免疫的治疗性刺激。从而它们可用于治疗与慢性感染有关的疾病，如真菌或支原体感染，结核，麻风、急性和慢性病毒感染等。
一般认为，目的肽或含有这些肽或其酸式盐或碱式盐的药物组合物，可用于任例需要细胞免疫，特别是有免疫缺陷的方面。这样，如果由于T细胞不平衡而有过量抗体产生，则目的肽可通过刺激T细胞功能而矫正这一症状。因此预计这些肽对某些产生有害抗体的自动免疫疾病具有治疗作用，这些疾病有系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等。
目的肽或含有目的肽的药物组合物，就其最广泛的应用来说，可用于免疫系统需要调节的患者(人或动物)。此处所用的术语“调节”指目的组合物使免疫系统从异常的疾病状态恢复到正常的平衡状态。虽然这种调节作用在免疫缺陷(例如Di George综合症)的矫正上有广泛的应用，但它也适用于矫正免疫活性过剩症(例如自动免疫疾病)。
因此，本发明包括对免疫系统需要调节的人或动物进行调节的方法及实施这些方法所用的药物组合物。所述方法包括，以能有效调节免疫系统的量，给所述人或动物服用至少一种肽。
本发明还提供一种由于患者免疫系统(特别是T细胞辅助功能)的相对或绝对缺陷所造成症状的治疗方法，该方法包括，给所述患者服用有效治疗量的至少一种本发明的肽。
此处所用的术语“有效治疗量”指能有效地治疗上述症状的量。本发明还提供一种诱导T细胞分化和成熟的方法，该方法包括，给患者服用有效诱导量的至少一种本发明的肽。
本发明还提供用于实施这些方法的药物组合物。为制备本发明的药物组合物，按照常规药物配制的技术，将作为有效成分的本发明的一种肽与一种药用载体混合成为均匀的混合物。根据给药(例如口服给药、舌下给药、直肠给药、经鼻给药或肠胃外给药)时所要求的剂型，可以广泛地改变所述的载体。
在制备较好的口服剂型的组合物时，可以使用任何常用药用介质。对口服液体制剂(例如悬浮液、酏剂和溶液剂)，所用的介质有例如水、油、醇类、调味剂、防腐剂、着色剂等。可用来制备口服固体(例如粉剂、胶囊剂和片剂)的载体有淀粉、糖类、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。也可以采用控释剂型。由于片剂和胶囊剂易于服用，因而是最有利的口服单位剂量形式，很明显，在这种情况下采用固体药用载体。如果需要，可利用标准技术将片剂进行糖包衣或肠包衣。
对非肠胃道给药的产品来说，载体通常是无菌水，但也可以包括其它成分，例如有助于溶解或防腐的成分。也可以制备注射用悬浮液，在这种情况下可以采用适当的液体载体、悬浮剂等。
本发明的四肽或五肽，在以约1μg/kg体重以上，最好是约0.001至10mg/kg体重的量服用时，一般是有效的。通常可以用同样的剂量范围治疗上述免疫缺陷疾病或症状。较大的量(例如约10-100mg/kg体重)用于抑制免疫活性过剩。
给出下列实施例以说明本发明，但并不具体限制本发明。在实例和整个说明书中，各份额按重量计，除非特别说明。这些实例中采用了下列缩写TFA，三氟乙酸;HOAC，乙酸;CH2Cl2，二氯甲烷;CH3CN，乙腈;DMF，二甲基甲酰胺;NH4OAc，乙酸铵NH4OH，氢氧化铵;n-PrOH，正丙醇;n-BuOH，正丁醇;Pyr，吡啶;DCC，二环已基碳二亚胺;HOBt，1-羟基苯并三唑;DMAP，二甲氨基吡啶;HF，氟化氢;TCA，三氯乙酸;BHA，二苯甲基胺;MeOH，甲醇。
实例1四肽乙酰基-Arg-Pro-Ala-Val-NH2的合成利用固相合成法通过分步偶联合成上述四肽。所有氨基酸的α-氨基都用叔丁氧羰基(BOC)保护。用甲苯磺酰基(TOS)保护Arg的侧链。与每当量树脂的取代作用相比，所用被保护的氨基酸过量2.5当量。所有偶联操作都用DCC/HOBt并以等当量被保护的氨基酸进行。所有氨基酸都是溶解在CH2Cl2中，但Arg是溶解在DMF中。
洗涤，脱去保护和偶联步骤如下1，CH2Cl22×3分钟2，50% TFA-CH2Cl21×3分钟3，50%TFA-CH2Cl21×30分钟4，CH2Cl21×3分钟5，40%异丙醇-CH2Cl22×3分钟6，CH2Cl22×3分钟7，10%二异丙基乙基胺 2×10分钟
8，CH2Cl21×3分钟9，氨基酸 1×3分钟10，HOBt 1×3分钟11，DCC 1×120分钟12，CH2Cl22×3分钟13，40%异丙醇-CH2Cl22×3分钟14，DMF 1×3分钟15，CH2Cl22×3分钟a，合成利用Beckman 990型肽合成仪合成被保护的肽。所得四肽树脂为0.67meg/g，用5.0g(3.35毫摩尔)树脂开始合成。然后使所得四肽乙酰化，方法是用以下试剂处理树脂1，CH2Cl22×3分钟2，50%TFA-CH2Cl21×3分钟3，50%TFA-CH2Cl21×30分钟4，CH2Cl21×3分钟5，40%异丙醇-CH2Cl22×3分钟6，CH2Cl22×3分钟7，10%二异丙基乙基胺 2×10分钟8，CH2Cl21×3分钟9，50%乙酸酐-CH2Cl2与 1×120分钟催化量的DMAP10，CH2Cl22×3分钟11，40%异丙醇-CH2Cl22×3分钟
12，DMF 1×3分钟13，CH2Cl22×3分钟用乙醇(2×50ml)洗涤后，减压干燥肽树脂。
b，HF 切落于0℃下用HF(25ml)和苯甲醚(25ml)切落树脂-肽4小时，得到粗制四肽。减压除去HF。向该混合物中加入乙醚(150ml)。搅拌该溶液并移至一个烧结玻璃漏斗中，再另外用乙醚(3×100ml)洗涤。用10%HOAc(3×100ml)从树脂中萃取肽，将水溶液冰冻干燥，得1.20g产物。
c.纯化利用制备高效液相层析法(HPLC)纯化产物，层析条件如下Whatman Column Partisil M20 10/50 ODS3;300mg样品，采用15%CH3CN/0.01MNH4OAc恒溶剂系统(用HOAc调节到pH5);流速为15ml/分;检测波长为220nm。收集所有纯部分。蒸去有机溶剂，将水溶液冰冻干燥，得258mg白色固体。
氨基酸分析Pro，1.00;Ala，1.00;Val，1.00;Arg，1.01;83%肽。
薄层层析(Silica 60/Analtech)Rf(Ⅰ)＝0.50(丁醇乙酸水/3∶1∶1)Rf(Ⅱ)＝0.59(丁醇吡啶乙酸水/4∶1∶1∶2)Rf(Ⅲ)＝0.29(丁醇乙酸水乙酸乙酯/1∶1∶1∶1)实例2四肽乙酰基-Arg-Pro-Val-Ala-NH2的合成
a.合成在Applied Biosystems 430A型肽合成仪上制备该四肽。利用Std1循环法(制造厂家的Version 1.40)将每个氨基酸偶联一次，但BOC-Tos-Arg偶联两次。合成中使用下列预先制好的原料反应物 来源 毫摩尔数 量对甲基-BHA-树脂 ABI 0.50 760mgBOC-Tos-Arg ABI 2.0 857mgBOC-Pro ABI 2.0 430mgBOC-Val ABI 2.0 434mgBOC-Ala ABI 2.0 378mg脱去精氨酸的BOC基团后，中和肽树脂并洗涤。在4-二甲氨基吡啶(20mg)存在下，用10%乙酸酐的CH2Cl2溶液(15ml)使该化合物乙酰化。60分钟后，用印三酮试验对肽进行检测，以确保完全乙酰化。用CH2Cl2(3×15ml)洗涤肽树脂并真空干燥(室温)，得1.0g物质。
b.HF切落在1.5ml苯甲醚存在下，用10ml HF从树脂上切下该肽。将混合物于0℃下搅拌1.5小时，然后减压除去HF。用乙醚(3×50ml)洗涤该混合物并空气干燥。用25%HOAc水溶液(3×50ml)萃取肽/树脂混合物。
c.纯化将水性滤液冰冻干燥，得240mg粗品。将该物质溶于水并使其通过Amberlite IRA 68(乙酸盐型)离子交换树脂。合并含肽部分并冰冻干燥(220mg)。
在Whatman Partisil 20M 10 ODS-3(22mm×50cm)柱上纯化该肽，用15%乙腈(0.1%三氟乙酸)和0.1%三氟乙酸水溶液作洗脱溶剂(10.0ml/分)。利用HPLC监测洗脱过程，合并适当的部分并减压除去溶剂。将残余物溶于H2O中并冰冻干燥两次，得167mg产物，总产率为50%。
氨基酸分析Arg，1.04;Pro，1.02;Val，1.00;Ala，1.01;72%肽。
薄层层析(硅胶GF250μm板)Rf(Ⅰ)＝0.37(n-BuOH∶HOAC∶H2O/3∶1∶1)Rf(Ⅱ)＝0.15(CHCl3∶MeOH∶HOAC/60∶35∶5)Rf(Ⅲ)＝0.48(n-BuOH∶HOAC∶H2O∶EtOAc/1∶1∶1∶1)实例3四肽乙酰基-Arg-Pro-Asp-Val-NH2的合成a.合成利用Beckman 990型自动合成仪以标准固相合成法合成标题化合物。用5.0g BHA树脂(0.67meg/g)开始合成。在BOC-Arg(Tos)的偶联完全后，用50%TFA的CH2Cl2溶液脱去叔丁氧羰基保护基。在催化量的DMAP存在下，用50%乙酸酐的CH2Cl2溶液使树脂肽乙酰化。用乙醇(2×50ml)洗涤肽树脂，减压干燥过夜，然后进行HF切落。干燥的肽树脂重6.5克。
b.HF切落于0℃下用HF(25ml)和苯甲醚(25ml)切落6.5g树脂肽4小时，得到粗制的四肽。减压蒸发HF，向反应混合物中加入乙醚(150ml)。将粗制的肽和树脂转移到一个烧结玻璃漏斗中，用乙醚(3×100ml)洗涤。用10%HOAc(3×100ml)萃取肽，将水溶液冰冻干燥，得900mg白色固体。
c.纯化将粗产物(经HPLC测定纯度为98%)在Sephadex LH-20柱(100g，2.5cm×89cm)上脱盐，用10%HOAc作洗脱剂。冰冻干燥后，产物重800mg，为白色绒状固体。
氮基酸分析Arg，0.99;Val，1.00;Pro，1.05;Asp，1.01。
薄层层析(Silica 60/Merck，250F)Rf(Ⅰ)＝0.51(n-BuOH∶HOAc∶H2O/3∶1∶1)Rf(Ⅱ)＝0.60(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶EtOAc/1∶1∶1∶1)Rf(Ⅲ)＝0.59(n-BuOH∶吡啶∶HOAc∶H2O/4∶1∶1∶2)实例4N-α-甲酰基-Arg-Pro-Asp-Val的合成a.N-叔丁氧羰基-β-苄基-天冬氨酰-缬氨酸苄基酯在80ml CH2Cl2中溶解3.23g N-叔丁氧羰基-β-苄基-Asp和3.97g Val-苄基酯对甲苯磺酸盐。加入二异丙基乙基胺(1.74ml)，将该溶液冷却至5℃。向该混合物中加入2.06g DCC。于5℃下搅拌该混合物30分钟，然后再在室温下搅拌2小时。滤出沉淀，滤液用水，10%柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液萃取。除去溶剂后得到油状物，在硅胶60上进行层析纯化，用97∶3 CH2Cl2-MeOH作为洗脱剂。产物重3.46g，为油状物。
b.N-叔丁氧羰基-脯氨酰-β-苄基-天冬氨酰-缬氨酸苄基酯将3.41g上述产物用60ml 21 CH2Cl2-TFA脱去保护30分钟，得油状的三氟乙酸盐。用饱和碳酸钠溶液中和并用CH2Cl2萃取，得到游离胺。蒸发萃取液使其体积减少，然后加到1.05g N-叔丁氧羰基-Pro中。加入0.73gHOBt在2ml DMF中的溶液，而后加入0.99g DCC。搅拌该混合物2.5小时，然后过滤。滤液用水、10%柠檬酸溶液萃取，再用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。干燥后，除去溶剂而留下油状物。产物在硅胶60上进行快速层析纯化，用9∶1 CH2Cl2-CH3CN作为洗脱剂。含主要成分的部分得到2.31g无色油状物。IR光谱1740cm-1，1695cm-1，1675cm-1。
c.N-α-甲酰基-Ng-硝基-精氨酰-脯氨酰-β-苄基-天冬氨酰-缬氨酸苄基酯在2.23g上述产物中加入60ml 1∶2 TFA-CH2Cl2。将该溶液搅拌30分钟，然后减压除去溶剂，留下蜡状固体，用石油醚洗涤该固体。在15ml DMF中溶解0.72gN-α-甲酰基-Ng-硝基-精氨酸和0.33ml N-甲基吗啉。将该溶液冷却至-20℃，向其中滴加0.40g氯甲酸异丁酯。将该混合物于-20°至-10℃下搅拌20分钟，然后加入脯氨酰-β-苄基-天冬氨酰-缬氨酸苄基酯三氟乙酸盐在20ml DMF和0.33ml N-甲基吗啉中的冷却溶液。该混合物于-15℃下搅拌20分钟，然后移走冷却浴，在室温下继续搅拌2小时。减压除去大部分溶剂。将残余物溶于50ml CH2Cl2中，用水、10%柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液萃取。干燥有机层并蒸发溶剂，得2.08g产物。
薄层层析(硅胶GF)Rf(Ⅰ)＝0.56(CH2Cl2∶MeOH/9∶1)Rf(Ⅱ)＝0.72(CHCl3∶MeOH∶HOAc/8∶1∶1)d.N-α-甲酰基-精氨酰-脯氨酰-天冬氨酰-缬氨酸以钯黑作催化剂，用30ml 5%甲酸-甲酸铵进行转移氢化而脱去保护。将反应混合物在具塞圆底烧瓶中搅拌18小时。用硅藻土过滤该混合物后，减压除去溶剂。将残余物溶于水中并进行冰冻干燥。产物在1.6×60cm DEAE-Sephadex柱上进行纯化。用0.02M碳酸氢铵(pH8.5)开始洗脱，收集150滴为一份。收集52份后，开始用2升以上的0.02-0.20M碳酸氢铵进行梯度洗脱。层析图中洗脱出的最大峰集中在第88份。合并第75-100份并冰冻干燥，得到绒状无定形固体。HPLC用10%MeOH-0.01N NH4OAc(pH5)在Bondapak-C18柱上以1.5ml/分的流速洗脱，保留时间＝9.4分。
薄层层析(硅胶60)Rf(Ⅰ)＝0.16(n-BuOH∶HOAc∶H2O/3∶1∶1)Rf(Ⅱ)＝0.27(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶Pyr/15∶3∶12∶10)Rf(Ⅲ)＝0.42(EtOAc∶Pyr∶HOAc∶H2O/5∶5∶1∶3)氨基酸分析Asp，0.99;Pro，0.97;Val，1.05;Arg1.00;38%肽。
实例5五肽Arg-Pro-Ala-Val-Tyr的合成用固相法合成该肽，用BOC-(BZLCl2)-Tyr树脂酯(4.4g，0.40meg/g)为起始原料。将该树脂依次用各3当量的BOC-Val、BOC-Ala、BOC-Pro和CBZ3-Arg偶联。偶联剂为DCC和HOBt在4∶1 CH2Cl2∶DMF中的溶液。于0℃下将该树脂用HF(40ml)在苯甲醚(5ml)中的溶液切落45分钟。固体残渣用10%HOAc萃取，过滤，将水溶液冰冻干燥，得1.56g粗制肽。
通过Sephadex SPC 25层析(2.6×90cm柱)进行纯化，用NH4OAc进行阶式梯度洗脱0.05M，pH5(2升)，0.15M，pH5(1升)，0.15M，pH6.7(2升);流速为100ml/小时，以12.5ml为一份，280nm检测。分离第198-207份，得标题肽，为1.13g无色固体。
薄层层析(硅胶G250)
Rf＝0.24(n-PrOH∶NH4OH/84∶37)Rf＝0.64(三氟乙醇∶NH4OH/78∶22)Rf＝0.58(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶pyr/15∶3∶12∶10)氨基酸分析Arg，1.00;Ala，0.96;Pro，0.97;Val，1.03;Tyr，1.01;67%肽。
实例6生物活性cGMP试验按测定人胸脾素和胸腺五肽生物活性的方法，本试验测定了本发明的肽与完整MOLT-4细胞的细胞膜受体结合并选择性地刺激cGMP生成的能力。
MOLT-4细胞系得自美国马里兰州诺克维尔典型培养物收藏处(American Type Culture Collection of Rockville，Md.)如T，Audhya等人所述(Arch，Biochem，Biophys，234167-177，1984)，新接种MOLT-4细胞后，培养3天并收集之。细胞用PBS洗3次，以1.0×107个细胞/ml的浓度再悬浮于RPMI 1640中，使其在37℃下平衡30分钟，然后加入试验四肽和五肽(25μl)及对照肽。在振荡水浴中继续培养4-5分钟，然后加入1ml冰冷的TCA(10%)停止培养。
将TCA中的细胞匀浆并进行超声处理，释放出环核苷酸。将该悬浮液于4℃下以3000×g离心20分钟。将所得沉淀溶解于0.1NNaOH中以测定蛋白含量。用5ml水饱和的乙醚萃取4次，从上清液部分中除去TCA。最后一次萃取后，在50℃水浴中加热10分钟而除去残留的少量乙醚。冰冻干燥后，将样品溶解于50mM乙酸缓冲液(pH6.2)中进行cGMP的放射免疫测定。
图1显示了活性肽乙酰基-Arg-Pro-β-D-Asp-Val-NH2、Arg-Pro-Ala-Val-Tyr和乙酰基-Arg-Pro-Ala-Val-NH2在MOLT-4细胞中的典型剂量-反应曲线，并与胸腺五肽和非活性肽乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-NH2、Ala-Lys-Asp-Val和Lys-Lys-Asp-Val-NH2作了比较，所测浓度为1000μg/ml。图2显示了MOLT-4细胞中活性肽乙酰基-Arg-Pro-Val-Ala-NH2的剂量反应曲线，并与胸腺五肽标准物进行了比较，所测浓度为1～100μg/ml。
测定了每个受试肽的阈活性。阈活性定义为诱导出比对照高两个以上标准差的细胞内cGMP水平的最低试验肽浓度。对照组的细胞内cGMP水平小于0.5微微摩尔/ml(平均值±标准差)。如果cGMP水平比平行阴性对照所测水平高2倍(2个标准差)以上，则认为试验结果为阳性。
cGMP试验结果示于图1及其相应的表Ⅰ、图2及其相应的表Ⅱ，在这些试验中测定了本发明的具有代表性的肽，并与胸腺五肽和对照肽作了比较。将这些结果与胸腺五肽(Arg-Lys-Asp-Val-Tyr)对MOLT-4的作用作比较是因为人胸脾素五肽“Sp-5”(Arg-Lys-Ala-Val-Tyr)对MOLT-4无活性。这些结果证实了本发明肽的生物活性，即在MOLT-4细胞中刺激T细胞辅助活性。
表ⅠcGMP浓度(微微克/ml)肽浓度 (μg/ml): 1 10 100 1000Arg-Lys-Asp-Val-Tyr 6.4 18.3 20.8 21.9Arg-Pro-Asp-Val-NH20.1 17.1 19.3 24.8乙酰基-Arg-Pro-Asp-Val-NH24.55 8.99 19.62 24.09乙酰基-Arg-Pro-Glu-Val-NH24.7 9.41 16.76 25.00乙酰基-Arg-Pro-Ala-Val-NH27.1 14.6 19.1 24.5乙酰基-Arg-Aib-Glu-Val-NH23.7 11.0 17.7 24.9乙酰基-Arg-Pro-Gln-Val-NH218.75 29.68 34.98 40.23乙酰基-Arg-Pro-Glu-Val 4.1 11.9 7.9 30.8乙酰基-Arg-Aib-Ala-Val-NH218.78 30.45 36.17 39.48乙酰基-Arg-Pro-B-D-Asp-Val-NH26.6 14.3 20.5 25.0乙酰基-Arg-Pro-B-Asp-Gly-NH220.56 31.83 36.66 34.95Lys-Lys-Asp-Val-NH20.33 0.31 0.34 0.33Lys-Arg-Asp-Val 0.44 0.43 0.44 0.39Arg-Gly-Asp-Ser 0.71 0.50 0.68 0.58Arg-Pro-Ala-Val-Tyr 0.09 16.41 27.90 37.14Arg-Pro-Ala-Val-Tyr-NH23.71 14.15 12.83 12.57乙酰基-Arg-Lys-Ala-Val-Tyr-NH23.00 8.86 12.83 18.43肽浓度为0的对照实验结果在0-0.3微微克/ml间变化。
表ⅡcGMP浓度(微微克/ml)肽浓度 (μg/ml): 1 10 100 1000Arg-Lys-Asp-Val-Tyr 3.55 13.56 18.70 24.85乙酰基-Arg-Pro-Val-Ala-NH27.77 17.39 24.47 --注意本底为0.19微微摩尔cGMP/ml。
实例7酶稳定性为说明本发明肽对肠道和血清酶降解作用的稳定性，将示例性肽乙酰基-Arg-Pro-Asp-Val-NH2放在大鼠肠液和人血清中于37℃下保温120分钟。作为比较，将四肽Arg-Lys-Asp-Val和胸腺五肽作同样处理。HPLC表明，25秒后，Arg-Lys-Asp-Val即完全消化。在约20秒时，胸腺五肽降解50%。本发明肽则至少在120秒内，在血清和肠液中基本上都未降解。
提出上述实例仅为说明目的，并不限制如权利要求书中所述的本发明范围。
权利要求
1.具有下式的四肽或其药学上可接受的酸或碱加成盐在制备用于调节感染患者免疫系统的药物组合物中的应用其中R为H、低级烷基、乙酰基、甲酰基、或低级链烷酰基；X为Pro、脱氢-Pro或羟基-Pro；Y为选自Ala、Asp、β-Asp或Val的D或L型氨基酸；Z为选自Val或Ala的D或L型氨基酸；R1为NR2R3，其中R2和R3为H或直链或支链含1至6个碳原子的烷基或含2至6个碳原子的烯基，任选被一个芳基或带有取代基的芳基取代，所述取代基或者是一个卤素，或者是一个直链或支链含1至6个碳原子的烷基或含2至6个碳原子的烯基；或者，R2和R3一起构成一个有3至7个碳原子的环亚甲基。
2.具有下式的四肽或其药学上可接受的酸或碱加成盐在制备用于调节患者体内T细胞功能缺损或过剩的药物组合物中的应用其中R为H、低级烷基、乙酰基、甲酰基、或低级链烷酰基;X为Pro、脱氢-Pro或羟基-Pro;Y为选自Ala、Asp、β-Asp或Val的D或L型氨基酸;Z为选自Val或Ala的D或L型氨基酸;R1为NR2R3，其中R2和R3为H或直链或支链含1至6个碳原子的烷基或含2至6个碳原子的烯基，任选被一个芳基或带有取代基的芳基取代，所述取代基或者是一个囟素，或者是一个直链或支链含1至6个碳原子的烷基或含2至6个碳原子的烯基;或者，R2和R3一起构成一个有3至7个碳原子的环亚甲基。
3.具有下式的五肽或其药学上可接受的酸或碱加成盐在制备用于调节感染患者免疫系统的药物组合物中的应用其中R2为H、低级烷基、乙酰基、甲酰基、低级链烷酰基或脱氨基;X′为Pro、脱氢-Pro或羟基-Pro;Y′为D-Val或L-Val;Z′为D-Tyr或L-Tyr;R3为OH或NR4R5，其中R4和R5为H或一个含1至6个碳原子的直链或支链烷基或烯基，任选被一个芳基或带取代基的芳基取代，所述取代基或者是一个囟素，或者是一个含1至6个碳原子的直链或支链烷基或烯基;或者，R4和R5一起构成一个有3至7个碳原子的环亚甲基。
4.具有下式的五肽或其药学上可接受的酸或碱加成盐在制备用于调节患者体内T细胞功能缺损或过剩的药物组合物中的应用其中R2为H、低级烷基、乙酰基、甲酰基、低级链烷酰基或脱氨基;X′为Pro、脱氢-Pro或羟基-Pro;Y′为D-Val或L-Val;Z′为D-Tyr或L-Tyr;R3为OH或NR4R5，其中R4和R5为H或一个含1至6个碳原子的直链或支链烷基或烯基，任选被一个芳基或带取代基的芳基取代，所述取代基或者是一个囟素，或者是一个含1至6个碳原子的直链或支链烷基或烯基;或者，R4和R5一起构成一个有3至7个碳原子的环亚甲基。
全文摘要
公开了具有人胸脾素分子的生物活性的四肽和五肽。还提供了含有这些肽的药物组合物及其使用方法。
文档编号G01N33/50GK1104217SQ9410815
公开日1995年6月28日 申请日期1994年7月21日 优先权日1988年5月19日
发明者塔彭·奥德雅, 吉迪安·戈尔茨坦, 乔治·希夫纳 申请人:免疫生物学研究所有限公司