肝干细胞的特异性表面分子标志物cd63及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药生物工程技术领域，提供了肝干细胞的特异性表面分子标志物CD63及其应用，并通过该表面标志物从肝脏中快速分离和培养扩增肝干细胞的方法。具体涉及应用肝干细胞的表面特异性标志物，通过流式分选的方法从肝脏细胞悬液中快速分离出肝干细胞，并实现肝干细胞在体外的扩增和双向分化，以及在肝脏疾病动物模型肝脏内的再植。
【背景技术】
[0002]组织干细胞是指存在于个体已经分化的组织中的未分化细胞，这种细胞具有自我更新和特化形成该组织的细胞的能力。组织干细胞存在于机体的各种组织器官中，是组织器官稳态维持的结构和功能基础。成年个体组织中的组织干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，只有在病理状态或在外界因素的作用下才能被激活增殖并向该组织的细胞类型分化。肝脏中的肝干细胞被认为存在于Hering’ s管和胆管腺中，具有产生肝细胞和胆管上皮细胞的双向分化潜能。在正常肝组织中，肝干细胞的数量极少，只有当肝脏受损并且肝细胞的增殖受到抑制或是肝脏受到持续的大规模慢性损伤时，肝脏中的肝干细胞才能被激活，即所谓的“胆管反应”。在动物模型中常联合应用能够抑制肝细胞增殖的药物(如倒千里光碱、对乙酰氨基酚等)和三分之二肝切来诱导胆管反应，而在人类的慢性肝病中(如慢性病毒性肝炎、原发性胆汁性肝硬化等)常到观察到胆管反应的存在。
[0003]肝干细胞的分离培养及其深入研宄对于肝脏发育，肝脏损伤后再生、肝脏肿瘤的发生的机理以及各种原因导致的终末期肝脏疾病的细胞治疗都具有十分重要的研宄意义和应用价值。由于肝干细胞在肝脏中存在的数量极少，目前报道肝干细胞的分离的方法尚不完善。Li等通过千里光碱联合2/3肝切诱导胆管反应后，将肝脏制备成细胞悬液，经过分级离心去除肝实质细胞后，再通过差速贴壁的方法将肝干细胞纯化(Li WL, SuJ, Yao YC, Tao XR, Yan YB, Yu HY, Wang XM, Li JX, Yang YJ, Lau JT, Hu YP, Isolat1n andcharacterizat1n of bipotent liver progenitor cells from adult mouse,StemCells, 24(2)，322-332)，该种分离纯化肝干细胞的方法比较繁琐，且不易从正常肝组织中分离出肝干细胞。近年来，通过Foxll，⑶133和Lgr5等肝干细胞的表面标志物结合流式或磁珠分选的方法从正常肝脏或诱导胆管反应的肝脏中分离出肝干细胞(ShinSj Walton G，Aoki R，Brondell K，Schug Jj Fox A, Smirnova 0，Dorrell C，Erker L，ChuAS, Wells RGj Grompe M，Greenbaum LE，Kaestner KH，Foxll-Cre—marked adult hepaticprogenitors have clonogenic and bilineage differentiat1n potential,GenesDev.25 (11):1185-1192 ；Dorre11 Cj Erker L，Schug Jj Kopp 几，Canaday PSj FoxAJj Smirnova 0，Duncan AWj Finegold MJ，Sander M，Kaestner KHj Grompe Mj Prospectiveisolat1n of a bipotential clonogenic liver progenitor cell in adult mice.GenesDev.25 (11): 1193-1203 ；Huch Mj Dorrell Cj Boj SFj van Es JHj Li VSj van de WeteringM，Sato T，Hamer K，Sasaki N，Finegold MJj Haft A, Vries RGj Grompe Mj Clevers H，Invitro expans1n of single Lgr5+liver stem cells induced by Wnt-driven regenerat1n, Nature.494(7436):247-250.)，但这些标志物并不能有效区分肝干细胞和胆管细胞。因此，现有的分离肝干细胞的方法操作繁复或是分离的肝干细胞纯度较低，目前尚没有能够快速从肝脏组织中特异分离纯化肝干细胞的方法。
[0004]⑶63是包含有四个疏水结构域(hydrophobic domains)的膜蛋白，是四次跨膜蛋白家族(tetraspanin family)的主要成员之一。⑶63主要与整合素(integrins)家族蛋白形成复合体，参与调节细胞的发育、生长、激活和迀移等功能。目前，CD63被发现主要表达于T细胞、巨噬细胞和激活的血小板。本发明发现CD63亦是肝干细胞的特异性表面分子标志物，并提供了从肝脏细胞悬液中快速、特异分离和纯化⑶63+肝干细胞的方法，同时，实现了肝干细胞在体外的扩增和双向分化，以及在肝脏疾病动物模型肝脏内的再植。CD63+肝干细胞的获得为肝脏疾病的细胞治疗和肝脏疾病治疗药物筛选提供平台，也为开发以CD63为靶标的肝脏疾病诊断试剂盒和治疗方法等研宄奠定基础。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种肝干细胞的特异性表面分子标志物CD63。
[0006]本发明的另一目的在于提供肝干细胞的特异性表面分子标志物CD63在肝干细胞快速分离扩增和/或诱导分化的方法中的应用。
[0007]本发明的又一目的在于提供肝干细胞的特异性表面分子标志物CD63在制备肝脏疾病诊断试剂盒和/或治疗肝脏疾病的药物中的应用。
[0008]本发明的第一方面，提供了一种肝干细胞的特异性表面分子标志物，所述的肝干细胞的特异性表面分子标志物是CD63。
[0009]本发明的肝干细胞的特异性表面分子标志物，也称为肝干细胞的特异性表面标志物、肝干细胞的表面分子标记、肝干细胞的表面分子标志等。
[0010]本发明的第二方面，提供了 CD63作为肝干细胞的特异性表面标志物的应用，该应用具体是CD63在肝干细胞快速分离扩增和/或诱导分化的方法中的应用。
[0011]⑶63作为肝干细胞的特异性表面标志物，可以准确地、特异性地从正常肝脏中分离出肝干细胞，也可从DDC诱导胆管反应后的肝脏中分离出肝干细胞。
[0012]特异性表面分子标志物CD63在肝干细胞快速分离扩增和/或诱导分化的方法中的应用。本发明通过肝干细胞表面特异性标志物CD63，结合流式分选的方法快速特异的从小鼠肝脏中分离出CD63阳性肝干细胞。CD63阳性的肝干细胞具有强大的增殖能力和分化为肝细胞和胆管细胞的双向分化能力。其中所述肝脏是指正常肝脏或DDC诱导胆管反应后的肝脏。
[0013]所述的DDC诱导胆管反应后的肝脏，诱导方法可参见文献Preisegger KH, FactorVMj Fuchsbichler A，Stumptner C，Denk H，Thorgeirsson SSj Atypical ductularproliferat1n and its inhibit1n by transforming growth factor betalin the3，5-diethoxycarbonyl-l, 4-dihydrocollidine mouse model for chronic alcoholicliver disease, Lab Invest.79 (2):103-109。
[0014]特异性表面分子标志物CD63在肝干细胞快速分离扩增的方法中的应用，具体方法如下:
[0015]A、原位免疫荧光和免疫组化染色鉴定⑶63阳性的肝干细胞在正常肝脏或DDC诱导胆管反应后肝脏中的定位。免疫荧光和免疫组化染色结果显示CD63阳性的肝干细胞在肝脏内分布于Hering’ s管和胆管腺内。
[0016]B、通过流式细胞仪分选的方法，从正常肝脏或DDC诱导胆管反应后肝脏中分离出CD63阳性(CD63+)的肝干细胞，并实现了 CD63阳性的肝干细胞在体外的扩增。首先将正常肝脏或DDC诱导胆管反应3周后的肝脏用两步法原位胶原酶灌注消化肝脏(Wang MJl, ChenF，Li JX, Liu CC, Zhang HB, Xia Y, Yu B, You P, Xiang D, Lu L, Yao H, Borjigin U, YangGS,Wangensteen KJ, He ZY, Wang X,Hu YP, Reversal of hepatocyte senescence aftercontinuous in vivo cell proliferat1n, Hepatology.6O (I): !M9-36L )，消化混合物继续用0.25%胶原酶在37°C孵育30分钟，然后通过梯度离心法富集肝脏非实质细胞。再通过流式细胞仪分选出⑶11b、⑶31和⑶45阴性，而⑶63阳性的肝干细胞。最后将⑶63阳性的肝干细胞在SCM-A培养基中大量扩增，SCM-A培养基:DMEM/F12、10%胎牛血清(Fetalbovine serum, FBS)、I X 青链霉素、0.lmM2_ 疏基乙醇(2-Mercaptoethanol，2_Mer)、I X 膜岛素-转铁蛋白 _砸溶液(Insulin-Transferrin-Selenium Solut1n, ITS)、10ng/ml 肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)、10ng