/ml 表皮生长因子(Epidermal growthfactor, EGF)、10ng/ml 尼克酰胺(Nicotinamide)、10_7M地塞米松(dexamethasone, Dex)和50ug/ml 庆大酶素(Gentamycin)。
[0017]所述的原位免疫荧光和免疫组化染色定位，可参见文献Yu B, He ZY, You P, HanQff, Xiang D, Chen F，Wang MJ, Liu CC, Lin Xff, Borjigin U, Zi XY, Li JX, Zhu HY, Li WL, HanCS, Wangensteen KJ,Shi Y, Hui LJ, Wang X, Hu YP, Reprogramming fibroblasts intobipotential hepatic stem cells by defined factors, Cell Stem Cell.13 (3):328-340。
[0018]所述的流式细胞仪分选的方法，可参见文献Wang MJl, Chen F，Li JX, LiuCC, Zhang HB, Xia Y, Yu B, You P, Xiang D, Lu L, Yao H, Borjigin U, Yang GS, WangensteenKJ, He ZY, Wang X,Hu YP,Reversal of hepatocyte senescence after continuous invivo cell proliferat1n, Hepatology.60 (I): 349-361。；所用流式细胞仪型号为 BectonDickinson FACs Calibur0
[0019]较佳地，其中步骤A中原位免疫荧光和免疫组化染色鉴定⑶63阳性的肝干细胞在正常肝脏或DDC诱导胆管反应后肝脏中的定位的具体步骤为:
[0020]Al、正常肝脏和DDC诱导胆管反应3周后的肝脏用OCT包埋剂包埋后，冰冻切片7um厚。4%多聚甲醛(PFA)室温固定10分钟，去除固定液，PBS洗三遍，4°C保存备用；
[0021]A2、免疫荧光染色:将经步骤Al处理后的肝脏切片用I %牛血清白蛋白(bovineserum album, BSA)室温封闭30分钟后，滴加用封闭液稀释的鼠抗⑶63抗体和兔抗CK19抗体，4°C过夜。PBS-T洗涤三次，每次5分钟，滴加FITC标记的羊抗兔IgG(FITC-Goat antiRabbit IgG)和TRITC标志的羊抗鼠 IgG(TRITC-Goat anti Mouse IgG)，37°C反应30 分钟，用PBS-T洗涤3次，每次5分钟；DAPI复染细胞核I分钟，PBS-T洗2次。抗荧光衰减封片剂封片，焚光显微镜下观察。
[0022]A3、免疫组化染色:将经步骤A2处理后的肝脏切片用0.3%双氧水封闭30分钟，PBS-T洗三次，I % BSA室温封闭30分钟后，滴加用封闭液稀释的鼠抗⑶63抗体，4°C过夜。PBS-T洗涤三次，每次5分钟。切片上滴加用PBS-T稀释的HRP标记二抗，37°C孵育30分钟，用PBS-T洗涤3次，每次5分钟。切片上滴加按说明书提供的方法新鲜配制的DAB染色液(货号:Kit-0014，福州迈新生物技术开发有限公司)，镜下观察切片颜色变化，待颜色明显时，立即将片子放入自来水中冲洗，终止显色反应。DAB显色后，苏木精(货号:H3136，购自Sigma)复染，脱水后封片。
[0023]较佳地，其中步骤B的具体步骤为:
[0024]B1、两步法原位胶原酶灌注消化肝脏(Wang MJl, Chen F，Li JX, Liu CC, ZhangHB, Xia Y, Yu B, You P, Xiang D, Lu L, Yao H, Borjigin U, Yang GS, Wangensteen KJ, HeZY, Wang X, Hu YP, Reversal of hepatocyte senescence after continuous in vivo cellproliferat1n, Hepatology.60 (I): 349-361.)，消化混合物继续用 0.25 % 胶原酶在 37 °C孵育30分钟。
[0025]B2、消化后的细胞悬液50g离心力低速离心30分钟两次，弃沉淀(大的肝细胞)，收集上清液后，继续用300g离心力离心5分钟，用无血清培养基重悬细胞，计数，将细胞稀释至107/ml，使用密度梯度离心分层液(OptiPrep? Density Gradient Medium)(货号:D1556，sigma公司)富集非实质细胞。
[0026]B3、收集富集到的非实质细胞后，PBS洗两遍，无血清培养基重悬。使用抗小鼠CDl6/32抗体(每16细胞Iug抗体)，4°C封闭10分钟。
[0027]B4、4 °C避光孵育CD63-PE抗体(每16细胞0.5ug抗体)，同时孵育CDllb，CD31，CD45-FITC抗体(每16细胞0.2ug抗体)，20分钟。用含有2% FBS (质量百分比)的PBS清洗细胞三遍。
[0028]B5、使用流式仪分选，以获得CD63-PE阳性，CDllb, CD31，CD45-FITC阴性的细胞。
[0029]B6、接种500个流式细胞仪分选出的⑶63+的肝干细胞至含SCM-A的培养基的96孔板中，37 °C，5 % CO2，95 %湿度条件培养2周。
[0030]进一步，在上述步骤B之后，本发明还提供了⑶63在肝干细胞诱导分化的方法中的应用，具体是分离出的CD63阳性的肝干细胞或扩增后的CD63阳性的肝干细胞在体外诱导分化为成熟肝细胞或胆管上皮细胞。
[0031]上述步骤B、通过流式细胞仪分选的方法，从正常肝脏或DDC诱导胆管反应后肝脏中分离出CD63阳性的肝干细胞，并实现了 CD63阳性的肝干细胞在体外的扩增。
[0032]本发明提供了 CD63阳性的肝干细胞在体外诱导分化为成熟肝细胞的方法。该方法具体为步骤C。
[0033]C、CD63阳性的肝干细胞在肝向诱导条件下(DMEM/F12、10% FBS、10ng/ml HGF、10ng/ml EGF、10_7M Dex、I % 二甲基亚讽(Dimethyl sulfoxide, DMS0)、10ng/ml 抑瘤素(oncostatin M, 0SM)、20%基质胶(Matrigel))诱导分化为成熟肝样细胞，0)63阳性的肝干细胞诱导分化形成的肝样细胞高表达肝细胞特异性功能基因(CYP7al、G6PD、AAT等)且具有储存糖原的功能。
[0034]较佳地，具体诱导步骤为:
[0035]Cl、按5X 14细胞/cm2将CD63阳性的肝干细胞种于I型胶原(货号:354236，购自BD公司)包被的35mm培养皿，添加SCM-A培养基，于37°C、5% CO2培养箱中培养至细胞长满，其间隔天换液。
[0036]C2、细胞长满后，更换肝向诱导培养基(DMEM/F12、10%FBS、10ng/ml HGFU0ng/mlEGFU0-7M DexU% DMSOUOng/ml 0SM,20% Matrigel)继续培养 6 天，其间隔天换液。
[0037]本发明还提供了 CD63阳性的肝干细胞在体外诱导分化为胆管上皮细胞。该方法具体为步骤D。
[0038]D、CD63阳性的肝干细胞在I型胶原三维培养条件下被诱导分化为分支样的管样结构，诱导形成的管样结构表达胆管细胞的标志物Krtl9和EpCAM。
[0039]较佳地，具体诱导步骤为:
[0040]Dl、所用的溶液均放置于4°C预冷30分钟；
[0041]D2、制备 I 型胶原凝胶溶液:1 型胶原 800ul，10XPBS 10ul，IN NaOH 20ul，ddH2080ul混匀，置于冰上。
[0042]D3、将 Iml 胆管诱导培养液(DMEM、10% FBS、lx 青链霉素、Ix ITS、20ng/ml HGF、50ug/ml Gentamycin)重悬的5X 14个⑶63阳性的肝干细胞与上述配制的I型胶原凝胶溶液混匀，加入35mm培养皿内；
[0043]D4、将培养皿置于37°C、5% CO2培养箱中培养2小时，等含有细胞的凝胶凝固；
[0044]D5、向培养皿中加入1.5ml胆管诱导培养液，并将细胞持续培养9天(期间隔天换液)。
[0045]上述分离扩增方法得到的⑶63阳性肝干细胞及其分化产生的功能性子代细胞。
[0046]上述分离扩增方法得到的CD63阳性肝干细胞及其分化产生的功能性子代细胞在制备组织化工程肝脏中的应用。
[0047]上述分离扩增方法得到的CD63阳性肝干细胞及其分化产生的功能性子代细胞在制备细胞治疗急性肝衰竭和各种终末期肝脏疾病的药物中的应用。
[0048]本发明的第三方面，提供了⑶63作为肝干细胞的特异性表面标志物的另一应用，该应用具体是特异性表面分子标志物CD63在制备肝脏疾病诊断试剂盒和/或治疗肝脏疾病的药物中的应用。
[0049]本发明所述的CD63在制备肝脏疾病诊断试剂盒中的应用，所述的试剂盒中包含检测⑶63表达量的试剂。
[0050]CD63作为肝干细胞的标志物，可以示踪并揭示肝干细胞在肝脏肿瘤发生、肝纤维化以及肝硬化的过程中肝干细胞所发挥的作用，CD63也可用作肝脏疾病的早期诊断标志物。
[0051]本发明所述的CD63在制备预防或治疗肝脏疾病药物中的应用，所述的药物为