一种新型免标记模式识别细胞仪方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞分类识别，特别是利用免标记细胞仪获取细胞的光散射图样信 息，然后对光散射图样进行模式识别，实现免标记、自动化细胞计数或分类功能。
【背景技术】
[0002] 传统流式细胞仪可用于细胞的分析和分选。一般说来，传统流式细胞仪需对细胞 进行染色处理，而荧光染色或者其他生物标记可能会对细胞产生一定的影响，特别是在活 体细胞功能研究方面。其次，荧光测量所需光路复杂，这直接增加了仪器成本，而且荧光测 量需要对仪器进行校准，操作复杂，需要专业人员。最后，在后期信号处理方面，由于荧光发 射光谱之间可能存在相互重叠，需要进行补色等操作，而且现有常规流式细胞仪在后期细 胞分类识别方面，只能根据预定的物理、化学特征参量范围识别相应的细胞亚群，缺乏自动 的机器学习并进行分类识别的功能，特别是在免标记、自动化细胞分类识别方面。
[0003] 临床上宫颈癌的筛查主要借助于宫颈细胞学检查以及HPV免疫检测。对于宫颈细 胞学检查而言，首先从宫颈组织上采集脱落的宫颈细胞，将其染色、制片，然后由临床病理 学医师在显微镜下进行人工阅片。有经验的医师可较为准确的判别宫颈正常与癌变细胞， 有时可能需要进行HPV检测和阴道镜活检以便确诊。宫颈细胞学检查过程步骤复杂，耗时 长，并且人工阅片需要医师具有丰富的临床经验，阅片结果具有较强的主观性。HPV检测和 阴道镜活检准确率高但较难普及。
【发明内容】
[0004] 本发明公开了一种新型免标记模式识别细胞仪方法，在获得免标记细胞或细胞聚 集群的二维光散射图样的基础上，对散射图样进行模式识别，达到免标记、自动化细胞计数 与分类识别的目的。该方法在样本处理方面，克服了传统流式细胞仪需要进行荧光染色的 缺点，实现了免标记的样本处理；在光路系统上克服了传统流式细胞仪光路复杂、成本高的 缺点；在信号处理方面，创新性的采用了模式识别来进行散射图样的自动分类识别。以上技 术的有机集成实现了细胞分类方法上的创新。在使用效果方面，该创新方法可用于细胞聚 集群数量的快速识别，也对正常宫颈细胞与癌变的宫颈HeLa细胞实现了免标记识别。
[0005] -种新型免标记模式识别细胞仪方法，具体方案包括以下步骤：
[0006] 配制出待测免标记细胞溶液并导入微流通道中或制成细胞悬液芯片；
[0007] 激光光源发出的光经过四倍物镜耦合进入光纤，光纤传导激光并激发微流通道或 细胞悬液中的单细胞或多细胞聚集群，形成分布于三维空间的散射光；
[0008] 散射光经过光学成像系统，被二维CMOS探测器探测并获取待测细胞对应的二维 光散射图样；
[0009] 或者，散射光无需经过光学成像系统，被二维CMOS探测器探测并获取待测细胞对 应的二维光散射图样；
[0010] 获取的二维光散射图样传输至模式识别分类系统，该系统通过对已知不同细胞种 类的二维光散射图样进行机器学习，实现对未知细胞的无标记、自动化识别；
[0011] 识别结果用于触发免标记模式识别细胞仪自动化细胞计数或细胞分类系统。
[0012] 进一步的，二维光散射图样获取对应的装置包括：光源系统，用于产生激光光源激 发被测细胞的散射光；二维光散射图样探测记录系统，记录收集被测细胞的散射光；模式 识别分类系统，通过数据处理及机器学习进行自动分类识别；细胞计数或细胞分类系统，包 括数字计数器以及机械式分类装置。
[0013] 进一步的，散射光经过光学成像系统，获取待测细胞对应的二维光散射图样时，需 要移动调整三维位移台寻找激光汇聚点，使激光光源经过四倍物镜后能以最佳耦合状态进 入光纤中，光纤的另一端作为探针用于激发微流通道或细胞悬液中的单细胞或细胞聚集 群。
[0014] 进一步的，微流通道中待测溶液中的细胞被激光激发产生的散射光，经过光学成 像系统或不经过光学成像系统；
[0015] 经过光学成像系统时，微流通道或细胞悬液中待测的细胞被激光激发产生散射 光，该散射光通过十倍物镜观测，调整十倍物镜，观察到细胞的原图像，对该物镜去焦，在 CMOS二维传感器上获得散射光图样。
[0016] 不经过光学成像系统，即不需要任何光学成像透镜，散射光经过一物理孔径，直接 在CMOS平面上形成二维光散射图样。
[0017] 进一步的，模式识别算法采用增强AdaBoost算法，对已检测的N个二维光散射图 样，选取出N-I个已知分类的图样进行训练，获得一组模式识别的弱分类器，然后用此弱分 类器组合对原先第N个图样进行测试，通过循环测试选出最强的弱分类器组合，最终得到 对待测细胞分类识别的高准确率。
[0018] 进一步的，上述方法用于酵母细胞聚类群的分类。
[0019] 进一步的，上述方法用于正常宫颈细胞和癌变宫颈细胞的分类。
[0020] 本发明的有益效果：
[0021] (1)本发明提出的新型免标记模式识别细胞仪装置简便，克服了传统流式细胞仪 光路复杂、设备昂贵、操作繁琐等缺点，可简便快速获得二维光散射图样。
[0022] (2)本发明采用的无标记技术，克服了传统流式细胞仪需要对细胞进行荧光染色， 从而可能造成细胞样本损伤的问题，可避免荧光染色对细胞特别是活细胞功能造成的干 扰。
[0023] (3)本发明提出的新型免标记模式识别细胞仪可实现对细胞或细胞群的免标记、 自动化分类识别，即通过自动化的模式识别算法达到对待测细胞的分类识别。
[0024] (4)本发明提出的新型免标记模式识别细胞仪泛化能力强，可广泛用于不同细胞 的分类识别。
[0025] (5)本发明分析过程可操作性强，可以选取恰当数目的弱分类器组成强分类器，尽 可能的提高识别准确率。获得强分类后，操作人员只需输入检测图像就可以自动的获取分 类识别结果。
[0026] (6)本发明所提出的免标记、自动化模式识别细胞术，可用于激发相应的物理计数 器或者分选器，实现对细胞的计数、分选功能。
[0027] (7)本发明提供了一种新型的进行细胞群数量区分的判断方法。
[0028] (8)本发明提供了一种新型的进行正常宫颈细胞和癌变的HeLa细胞分类的判断 方法。
【附图说明】
[0029] 图1为本发明装置的结构及原理图，
[0030] 图2 (a)-图2 (d)单个酵母细胞模拟图和实验散射图对比；
[0031] 图3(a)-图3(d)不同数量酵母细胞聚集群原图、散射图对比；
[0032] 图4(a) -图4(d)正常宫颈细胞和HeLa细胞原图、散射图对比；
[0033] 图1中：1、激光光源，2、四倍物镜，3、光纤耦合器，4、微流通道或细胞悬液芯片，5、 十倍物镜或物理孔径，6、二维CMOS探测器，7、模式识别系统，8分类系统；
[0034] 表1不同数量酵母细胞聚集群分类结果；
[0035] 表2正常宫颈细胞和HeLa细胞分类结果。
【具体实施方式】：
[0036] 下面结合附图对本发明进行详细说明：
[0037] 如图1所示，一种新型免标记模式识别细胞仪主要由光源系统、二维光散射图样 探测记录系统、数据处理分类系统构成。其中光源系统包括激光光源1，四倍物镜2,光纤耦 合器3,微流通道或细胞悬液芯片4 ;二维光散射图样探测记录系统包括十倍物镜或物理孔 径5,二维CMOS探测器6 ;数据处理分类系统构成分析系统包括模式识别系统7,分类系统 8〇
[0038] 本发明的二维光散射图样检测系统包括单细胞及细胞聚集群的光散射激发系统， 微流控或细胞悬液芯片系统，以及二维光散射图样获取系统。本发明的数据处理分类系统 采用模式识别算法来进行二维光散射图样的后期数据处理，实现了对单细胞以及细胞群的 免标记、自动化分类识别。本发明以模式识别中的AdaBoost机器学习算法为例，但不局限 于使用该特定的模式识别方法进行细胞光散射图样的识别。本发明不依赖于传统的荧光染 色以及人工分类，通过对散射图样的模式识别，实现了对不同数量酵母细胞群以及宫颈细 胞不同病理状态的免标记、自动化分类识别。本发明应用范围可推广到一般生物细胞的生 理、病理分析。本发明所公开的新型免标记模式识别细胞仪方法，无需对细胞进行复杂的荧 光染色，可免标记、自动化实现对待测细胞的分类、识别，以及后期的计数、分选等，操作简 便快捷，结果准确可靠，显著降低分析成本，应用范围广泛。
[0039] 下面结合附图1对本发明进行具体操作步骤的详细说明：
[0040] 步骤一：配制待测细胞溶液，根据不同的待测细胞配制溶液的方法不尽相同。
[0041 ] 步骤二：将待测细胞溶液导入微流通道4或制成细胞悬液芯片4。
[0042] 步骤三：打开激光光源1，激光光源1采用532nm波长绿色激光二极管栗浦固体激 光器（DPSS)。二极管栗浦固体激光器具有工作时间长、效率高、耗能低、热效应小、体积小等 显著的优势。为了保证直径为1.0 mm的激光光束能最大限度的耦合进入直径105 μπκ数值 孔径（NA)为0. 22的光纤中，本发明选择数值孔径为0. 1的四倍物镜2以提高耦合效率。
[0043] 步骤四：不断移动调整校准激光耦合器使激光光源经过四倍物镜2后，能以最佳 耦合状态进入光纤耦合器3中光纤一端。光纤耦合器3的光纤另一端作为探针