一种具有水稻子房特异性的dna片段的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及能够在水 稻转基因调控体系中特异性的驱动目标基因的表达的一段DNA片段。
【背景技术】
[0002] 人类通过对自然突变基因和重组体的选择与利用，对作物的品种进行改良已有近 千年的历史。近百年来，通常采用人工杂交的方法，实现优良基因的重组和外源基因的导入 培育作物新品种。杂交育种技术能够实现种内基因转移，但是，亲缘关系较远的品种之间的 基因转移则存在障碍；另一方面，杂交育种技术不能准确选择和操纵某个基因。因此，增加 了育种结果的复杂性。
[0003] 通过转基因的手段进行作物品种的选育，其优势在于转基因不受生物体间亲缘关 系的限制，从转基因的技术角度来讲，候选转化的基因来源几乎不受限制。此外，转基因技 术所操作和转移的基因是功能明确、控制目标性状的基因，这使得转基因后代的表型更具 有可预见性。目前转基因技术已经成为作物品种改良的重要手段，转基因大豆、玉米、棉花 和油菜的种植面积已达4种作物全球总种植面积的25%。
[0004] 在植物的转基因中需要两个必需的元件，即启动子和目的基因。启动子是位于基 因转录起始位点上游的顺式调控元件，与反式作用因子结合，通过识别因子与RNA聚合酶 的相互作用，启动基因的转录；因此，启动子调控基因的表达模式，即目的基因表达的时空 特异性及表达强度，是转基因成败或成效高低的关键因素之一。
[0005] 针对转基因的目的不同，转化的基因选择不同的表达模式，主要包括组成型高表 达、组织特异性表达及诱导型表达等。如在棉花、玉米、水稻等农作物中转入苏云金芽孢杆 菌的抗虫蛋白采用的是组成型高表达方式，在作物中高剂量表达Bt抗虫蛋白的优势在于 高剂量可以确保杀虫的效果，同时有利于延长Bt抗虫蛋白的有效期。在金稻谷的创制过程 中，其目标是通过在水稻胚乳中引入了维生素 A前体的合成途径，从而在稻米中强化维生 素 A，解决维生素 A营养缺乏的问题；因此，转基因时采用的启动子为在水稻胚乳中特异表 达的谷蛋白启动子。在植物抗病基因的转化中，常采用病原菌诱导表达的启动子。
[0006] 水稻是单子叶植物禾谷类的代表植物，不同于双子叶植物，且具有单子叶植物的 多项优势，是研宄花发育的理想材料，但水稻花发育机制的研宄却远远落后于双子叶植物。
【发明内容】
[0007] 因此，针对上述问题，本发明针对水稻花发育机制进行了仔细研宄。并且在研宄过 程，侧重于水稻子房中相关基因的表达，获得一个DNA片段，其具有子房表达特异性，可以 用于驱动在子房中特异性表达的一些功能基因或结构基因，这对于水稻穗的品质改良及水 稻的产量的提高具有重要的意义。
[0008] 本发明的还获得了获得含有上述DNA片段的表达盒和重组载体，并且本发明还利 用该DNA片段获得了相应的转基因植物。其中，本文中所涉及的"植物"是指单子叶植物， 例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
[0009] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种DNA片段，所述DNA片段包含：
[0010] 1)序列表中SEQ ID NO :1所示的DNA序列；或者
[0011] 2)在严格条件下与1)中所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或 者
[0012] 3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有启动子功能的DNA 分子。
[0013] 2)和3)中的序列与SEQ ID No: 1所示的DNA序列具有相同的功能，即驱动目标基 因在植物中表达，其中，
[0014] SEQ ID NO :1中所示序列为：
[0017] 需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头的序列" tccacaggat tcacaataac gt"共计22bp为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列；序列末尾的 序列"at tgcctctacc atactcggtg"共计22bp为获得启动子过程中使用的反向引物的留存 序列（该留存序列与反向引物的相应序列互补）；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本 晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列， 也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本 发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。
[0018] 优选地，本发明所述DNA序列为SEQ ID No: 1所示的序列。
[0019] 优选地，序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列用作水稻子房特异表达启动子。
[0020] 序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列可以提取自水稻属植物，优选为日本晴水 稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)，本文中称为OsOval或启动子OsOval。具体而言，本 申请的发明人发现日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)基因上游包括转录起始 位点在内的1970bp的DNA序列，具有驱动目标基因在水稻子房中特异性表达的功能，并且 分离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。但是，需要说明的，后续人们根据本发明公开内容 而人工合成的相同序列也包含在本发明的范围内。
[0021] 另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻子房特异性强表达启动子的表达盒。
[0022] 另一方面，本发明还提供一组用于扩增权利要求1所述的DNA片段的全长或其 任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物 的DNA序列包含片段：TCCACAGGATTCACAATAACGT ;所述第二引物的DNA序列包含片段： ATTGCCTCTACCATACTCGGTG。
[0023] 又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体为在植物表达载 体PCAMBIA1391的多克隆位点插入所述DNA片段得到的重组质粒，在所述重组表达载体中， 所述水稻子房特异表达启动子OsOval连接于载体中待表达的基因序列的上游；优选的，所 述待表达的基因为对水稻子房有改善功能的基因。通过本发明的启动子驱动基因在子房中 特异性表达，从而达到改良作物性状的作用。
[0024] 再一方面，本发明提供上述水稻子房特异性强表达启动子在培育转基因植物中的 应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻子房特异性强表达启动子连接于载体的待 表达的基因序列上游（例如，将所述启动子序列置于目标基因之前），从而构建重组表达载 体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
[0025] 综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare) OsOval基因上游包括转录起始位点在内的1970bp的DNA序列，并将其命名 为启动子OsOval。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应 的重组质粒（即重组表达载体），利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105,然后用农杆 菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行Gus组织 化学染色检测发现，转基因植株仅在子房部位有Gus表达，从而证明该1970bp的序列具有 驱动基因在子房部位特异性表达的活性。
[0026] 本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。 并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在水 稻的子房部位特异性的驱动靶标基因的表达，增加转基因的效果，改良水稻的特性。
[0027] 技术效果
[0028] 本发明所克隆的水稻启动子OsOval能够调控基因在水稻子房中特异性集中表 达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动 子驱动目标基因在植株中表达，可以提高和改善水稻的生殖特性，从而培育出理想的转基 因植物品种。
【附图说明】
[0029] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0030] 图1为将OsOval启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A 为PCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-0s0val示意图，其中示出了利用OsOval 启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；
[0031] 图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；
[0032] 图3为12周苗龄的OsOval::⑶S转基因植株组织染色图。（标尺=5mm)。在根、 茎、叶、鞘组织中均没有观察到代表GUS活性的蓝色，而在花中，仅有位于雌蕊基部的子房 中有蓝色出现，而颖壳、雄蕊中也都没有表现出⑶S活性。
【具体实施方式】
[0033] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用