樱花品种"松月"和"郁金"的分子特异性标记引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及樱花品种"松月"和"郁金"的分子特异性标记引物，以及利用该引物 对樱花品种"松月"和"郁金"进行快速鉴定的方法。 (二）
【背景技术】
[0002] 樱花隶属于蔷薇科（Rosaceae)樱属（Cerasus)，是世界著名的观赏植物。目前已 知樱花品种有300多个，因其株型优美、花色艳丽、整个花期延续期长，在园林上有极大的 应用价值。近年来，我国各地大规模种植樱花并应用于公园、学校、街道、庭院等绿地中，成 为早春主要观赏花木之一。北京、武汉、青岛、上海等城市每年纷纷举办樱花节，樱花产业得 到迅猛发展，这对于建设美丽中国，促进农民增收，推进山区综合开发和建设社会主义新农 村，都具有十分重要的意义。
[0003] 我国樱属植物资源丰富，分布广泛，且樱属植物表型具有较强可塑性，种间杂交容 易，品种数量众多，有些品种间性状差异较小，传统形态分类很难快速、准确有效评价与区 分。学术界对目前种植樱花品种的名称和描述都很混乱，"同物异名"或"同名异物"现象较 为严重，缺乏统一规范的名称及科学系统的分类体系，不便于品种鉴定、推广、交流及新品 种的培育，因此亟需建立一个科学合理的樱花品种分类鉴定系统。
[0004] 目前就全国范围内的樱花品种调查和分类还仅仅是通过传统的形态学特征、过氧 化物酶和酯酶同工酶技术、电镜扫描花粉粒和Q型聚类分析等方法，这些方法尽管有用，但 很难对樱花品种进行正确的鉴定和应用。而近年来在植物分类界已广泛应用的DNA分子标 记技术迄今尚未在樱花品种分类、品种间亲缘关系及遗传多样性等研宄上得以应用。因此， 有必要利用分子标记技术手段，对我国现有的樱花品种进行科学鉴别，不仅有助于樱花品 种分类鉴定系统的建立，也为樱属植物资源的进一步研宄提供分子依据。
[0005] 目前国内引进大量的樱花品种，在北京、青岛、武汉、上海等各大公园内广泛栽植， 观赏价值极高，其中以晚樱品种居多，普遍具有花量大、花色艳丽、花瓣多、花期长、抗性 强、适应性广等特点。我们经过长期的调查工作，发现20个晚樱品种包括红笠 （Cerasus serrulata iBenigasai)、红华（C. serrulata iKoukai)、一叶（C. serrulata iHisakurai)、 福绿寿（C. serrulata 'Contorta'）、普贤象（C. serrulata 'Albo-rosea'）、 松月（C. serrulata 'Superba'）、郁金（C. serrulata 'Grandifora'）、红丰 (CerasusXsieboldii iBeni - yutaka'）、御衣黄(C. serrulata 'Gioiko'）、关 山（C. serrulata 'Kanzan'）、大提灯（C. serrulata 'Ojochin'）、八重红枝垂 (C. spachiana 'Plena Rosea'）、市原虎尾（C. serrulata 'Albo Plena'）、咲耶 姬（CerasusXyedoensis 'Sakuyahime'）、朱雀（C. serrulata 'Shujaku'）、杨贵 妃（C. serrulata 'Mollis'）、雨情枝垂（C. spachiana 'Ujou-shidare'）、菊垂 楼（C. serrulata 'Plena-pendula'）、平野妹背（C.serrulata 'Imose'）、旭山楼 (C. serrulata 'Asahiyama'）在园林中的应用极其广泛，但这些品种的"同名异物"、"同物 异名"现象也异常严重，从表型特征方面很难鉴别，给园林植物应用、推广以及新品种选育 带来很多困难，因此着力从分子水平上开发出这些品种稳定、特异的DNA指纹标记才是实 现樱花品种准确快速鉴定的科学途径。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明目的提供樱花品种"松月"和"郁金"的分子特异性标记引物，以及一种能 对樱花品种"松月"和"郁金"进行快速鉴定的方法。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 樱花品种"松月"和"郁金"的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：
[0009] 上游引物：5，-AGCGGCCGCACAAATTAAGAAAAA-3，；
[0010] 下游引物：5' -AGCGGCCGCACTTTGAACGAT-3'。
[0011] 该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验获得樱花品种"松月"和"郁金"的 特异性DNA片段之后，将该片段克隆测序，以得到的DNA序列为基础设计特异性引物，以该 特异性引物对樱花品种进行PCR扩增，仅"松月"和"郁金"可获得1746bp大小的特异性片 段，其他樱花品种均不能获得特异性片段。需要说明的是，本发明分子特异性标记引物仅限 于樱花品种的鉴定（鉴定其是否为"松月"和"郁金"之一，后续再进行进一步鉴定），即待 测样品仅限于樱花。
[0012] 本发明还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物对樱花品种"松月"和"郁金" 进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测樱花品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述 分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果 出现1746bp的特异DNA条带，则待测樱花品种为樱花品种"松月"和"郁金"，反之则否；所 述分子特异性标记引物序列为：
[0013] 上游引物：5，-AGCGGCCGCACAAATTAAGAAAAA-3，；
[0014] 下游引物：5' -AGCGGCCGCACTTTGAACGAT-3'。
[0015] 本发明方法关键在于扩增引物的选择、DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定， 以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。
[0016] 优选的，本发明所述PCR反应体系组成如下：
[0017] PCR Buffer 终浓度为Ix dNTPs I mmol/L MgC^ 2.5 mmol/L Taq DNA 酶 1.0 U/反应 上、下游引物 各0.4 μΜ 模板DNA 60 ng/反应 余足:为ddH20。
[0018] 所述PCR扩增条件如下：95°C预变性3min ;95°C变性40s，65°C退火40s，72°C延伸 2min，共35个循环；最后于72°C补平7min，终止温度为4°C。
[0019] PCR Buffer终浓度为IX，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓度与 IXPCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10XPCR Buffer。10XPCR Buffer 成分为：100mM Tris-HCl (pH 8. 5)、500mM KCl、25mM MgCljP 1.0% Triton-X-100， 溶剂为ddH20。
[0020] 具体的，所述方法如下：
[0021] (1)取待测樱花叶片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待测樱花叶片的基因组 DNA ；
[0022] (2)以步骤⑴提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引 物，进行PCR扩增：
[0023] PCR扩增体系每25 μ L组成如下：
[0024] IOxPCR Buffer 2 5μ? 10 mmol/L dNTPs 2.5μ? 25 rnmol/L MgCl2 2,5μΙ.
[0025] 5 U/[iL Taq DNA 酶 0.2μ[ 10 μΜ上、下游引物 各IgL 20 ng^L 模板 DNA ddH20 补足至 25pL;
[0026] PCR扩增条件如下：
[0027] 95°C预变性3min ;95°C变性40s，65°C退火40s，72°C延伸2min，共35个循环；最后 于72°C补平7min，终止温度为4°C ;
[0028] (3)取步骤（2)扩增产物5 μ L，与1 μ L 0. 25 %溴酚兰缓冲液混匀，点样于1. 5 % 的琼脂糖凝胶上，于IXTAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶 图像分析仪上照相，若电泳结果出现1746bp的DNA条带，则待测樱花品