一种用于识别半胱氨酸的特异性荧光探针及其应用的制作方法
【专利摘要】一种用于识别半胱氨酸的特异性荧光探针及其应用，其属于精细化工领域。这种荧光探针为4位含有不同取代基团的7-羟基香豆素衍生物；按比例将4-取代基香豆素与三乙胺混合，再滴加丙烯酰氯酰氯，最后采用硅胶色谱法进行纯化，得荧光探针。该荧光探针及相应半胱氨酸含量检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中半胱氨酸含量的定量测定。这种应该探针具有高特异性，可以与半胱氨酸特异性环化后水解，即7位酯键断裂的水解产物；廉价易得，可经化学合成获得，合成工艺简单易行；灵敏度高，具有具有良好的荧光发射光谱特性（400～500nm），通过绘制标准曲线进行半胱氨酸定量测定。
【专利说明】一种用于识别半胱氨酸的特异性荧光探针及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于识别半胱氨酸的特异性荧光探针及其应用，其属于精细化工领域。
【背景技术】
[0002]氣基酸(amino acid)是构成生物体蛋白质并与生命活动有关的最基本的物质，与生物的生命活动有着密切的关系。例如，含巯基的氨基酸，半胱氨酸(Cysteine，Cys)与高半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)是同时表达在真核细胞内的含巯基氨基酸，分子结构只有一个亚甲基的区别，功能差异则非常明显:Cys作为人体必须的氨基酸之一，是参与蛋白质合成的20种氨基酸中的一种，同时也是构建重要的谷胱甘肽的三个氨基酸之一；而Hcy,为甲硫氨酸代谢的中间产物，本身不参与蛋白质的合成，体内高半胱氨酸含量的大小与许多疾病相关联。现代医学研究表明，细胞内Hcy的高表达与心血管疾病及阿尔茨海默(进行性老年痴呆)有直接关联。因此，研制高选择性地识别半胱氨酸和高半胱氨酸荧光探针并实现其在活细胞中的荧光成像具有十分重要的意义。
[0003]众所周知，细胞是生命的基础，但是目前人们对细胞内的很多生命现象却知之甚少，所以能够实现活细胞中各种分子的荧光显微成像具有很大的开发潜力和研究价值。在众多具有生物功能的分子中，巯基化合物是生物体中许多蛋白质和分子的重要组成部分，在细胞抗氧化系统中具有重要的作用:比如半胱氨酸(Cysteine, Cys)和高半胱氨酸(Homocysteine, Hcy),分子结构差别极小，仅有一个亚甲基差别，但其生物功能却完全不同。它们在生物体内含量的变 化均会导致一些疾病的发生，通过检测它们在生物体内含量的变化，可以为体内某些疾病的诊断提供正确的依据。因此，定量检测生物体系中Cys和Hcy的含量变化在化学、生物化学、临床医学等领域具有重要意义。
[0004]本发明提供了一类4位含有不同取代基团的7-羟基香豆素衍生物用于特异性识别半胱氨酸的探针，其与半胱氨酸水解后可生成具有荧光属性的水解产物。该反应具有高选择性、高灵敏度、反应迅速的特点。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种识别半胱氨酸(Cys)的特异性荧光探针，该探针本身具有微弱的荧光，与半胱氨酸反应后产物具有极强的荧光属性。利用该探针反应可对多种生物样本中半胱氨酸含量进行定量评价。
[0006]本发明的技术方案为:一种用于识别半胱氨酸的特异性荧光探针，所述荧光探针为4位含有不同取代基团的7-羟基香豆素衍生物，其结构通式如下:R
O
其中，R为三氟甲基、氯甲基、溴甲基中的一种；
所述荧光探针的制备方法包括如下步骤:
(1)按照4位取代基香豆素:三乙胺摩尔比为1:广2的比例加入到反应瓶中，再向反应瓶中缓慢滴加丙烯酰氯酰氯，控制反应温度在0°C，所述丙烯酰氯酰氯:4位取代基香豆素的摩尔比为广2:1 ;冰浴条件下搅拌I h后，将溶液温度升至室温，搅拌8-12h ;所述4位取代基香豆素为4-三氟甲基香豆素、4-氯甲基香豆素或4-溴甲基香豆素；
(2)将上述反应液经过减压除去溶剂，残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯:正己烷体积比为1: 3进行洗脱，得荧光探针。
[0007]所述荧光探针应用于生物样本中半胱氨酸含量的定量评价。该探针作为半胱氨酸的特异性探针，发生水解反应，通过定量检测水解产物的荧光强度来测定血浆及细胞中半胱氨酸的含量；具体测定方法为:
体系中以4位含有不同取代基团的7-羟基香豆素衍生物作为特异性探针；探针浓度选择I厂10 μ M ;在PBS或Tris-HCl等常用缓冲液:乙醇混合溶液(体积比9:1)中，反应温度为20°C至60°C之间，优选25°C为最优反应时间；反应体系pH介于5.5^10.5之间，优选pH7.4为最优反应pH值；反应时间为5~120分钟；测定水解产物荧光强度作为半胱氨酸含量的评价指标。
[0008]探针本身具有微弱荧光`，其水解产物均具有极强的荧光，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；荧光检测条件为:激发波长30(T400 nm，在40(T500 nm进行荧光发射谱的检测。
[0009]本发明的有益效果为:这种荧光探针为4位含有不同取代基团的7-羟基香豆素衍生物；按照比例将4-取代基香豆素与三乙胺混合，再滴加丙烯酰氯酰氯，最后采用硅胶色谱法进行纯化，得荧光探针。该荧光探针及相应半胱氨酸含量检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中半胱氨酸含量的定量测定。这种应该探针具有高特异性，可以与半胱氨酸特异性环化后水解，即7位酯键断裂的水解产物；廉价易得，可经化学合成获得，合成工艺简单易行；灵敏度高，具有具有良好的荧光发射光谱特性(400~500 nm)，通过绘制标准曲线进行半胱氨酸定量测定。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图14-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素的1H-NMR谱图。
[0011]图24-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素的13C-NMR谱图。
[0012]图34-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素的高分辨质谱。
[0013]图44-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素为探针与半胱氨酸反应后荧光强度变化结果。
[0014]图54-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素为探针与半胱氨酸反应后紫外吸收变化结果。
[0015]图6 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素为探针与不同氨基酸反应后荧光变化结果O
[0016]图7 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素为探针与不同浓度半胱氨酸反应后荧光强度变化曲线。
[0017]图8 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素为探针与半胱氨酸反应荧光强度变化与时间的关系。
[0018]图9细胞共聚焦成像图，图中由左到右分别为探针加巯基捕捉剂、探针、亮场。
[0019]图10 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素合成路线。
【具体实施方式】
[0020]下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
[0021]实施例1 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素的化学合成 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素合成步骤如下:
(1)向10mL含有0.5 mmol的4-三氟甲基-7-羟基香豆素和0.625 mmol三乙胺的四氢呋喃溶液中，30 min内向反应瓶中缓慢滴加0.6 mmol的丙烯酰氯酰氯(溶于5 mL的四氢呋喃中)，控制温度在0°C ；
(2)冰浴条件下搅拌Ih后，将溶液温度升至室温，搅拌过夜。；
(3)反应液经过减压除去溶剂，残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯-正己烷(1: 3 v/v)进行洗脱，得44mg白色固体粉末；
实施例2 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素对于不同氨基酸的选择性
(I)预先准备99 μ?代谢反应体系，包括pH 7.4的PBS缓冲液(10 mM):乙醇(体积比9:1)，L-丙氨酸(50 μ M)、L-精氨酸(50 μ M)、L-天门冬酰胺(50 μ M)、L-天门冬氨酸(50 μ M)、L-半胱氨酸(50 μ M)、L-谷氨酰胺(50 μ M)、L-谷氨酸甘氨酸(50 μ M)、L-组氨酸(50 μ M)、L-异亮氨酸(50 μ M)、L-亮氨酸(50 μ M)、L-赖氨酸(50 μ Μ)、甲硫氨酸(50 μ Μ)、苯丙氨酸(50 μ M)、L-脯氨酸(50 μ Μ)、L-丝氨酸(50 μ Μ)、L-苏氨酸(50 μ Μ)、L-色氨酸(50 μ Μ)、L-酪氨酸(50 μ Μ)、L-缬氨酸(50 μ Μ)、高半胱氨酸(50 μ Μ)、还原型谷胱甘肽(50μΜ)。
[0022](2)向反应体系中加入I μ?终浓度为10 μ M 4_三氟甲基_7_丙烯羰氧基香豆素起始反应；
(3)30 min后，进行荧光检测(λΕχ=380 nm, λ Em=500 nm);计算各体系中荧光强度(见图6)；
实施例3 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素与半胱氨酸浓度线性关系
(I)预先准备99 μ?代谢反应体系，包括pH 7.4的PBS缓冲液(10 mM):乙醇(体积比9:1)，半胱氨酸(0-100 μ M)，于25°C条件下反应30分钟;
(2向反应体系中加入I μ?终浓度为100 μ M 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素起始反应;
(3)30 min后，进行荧光检测(λΕχ=380 nm, λ Em=500 nm);计算各体系中荧光强度，建立荧光强度与半胱氨酸浓度标准曲线(见图7);标准曲线为y = 14905x + 3122.5，其中y代表荧光强度，X代表半胱氨酸浓度。
[0023]实施例4 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素为探针与半胱氨酸反应荧光强度变化与时间的关系
(I)预先准备99 μ?代谢反应体系，包括pH 7.4的PBS缓冲液(10 mM):乙醇(体积比9:1)，半胱氨酸(50 μΜ)；
(2向反应体系中加入I μ?终浓度为10 μ M 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素起始反应;
(3)90 min 内，每隔 I mn 进行一次突光检测(λ Ex=380 nm, λ Em=500 nm);(见图 8); 实施例5定量测定人肺腺癌A549细胞中半胱氨酸含量
(I)人肺腺癌A549细胞系培养于盖玻片上，采用的培养基是DMEM培养基(含10%小牛血清)以及100 μ g/ml的双抗，培养环境为25°C的5% 二氧化碳培养箱中。
[0024](2)使用之前，贴壁细胞采用不含血清的DMEM培养基冲洗3次，加入终浓度为10μ M的4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素，于25°C温孵40分钟。
[0025](3)之后，采用PBS缓冲液冲洗3次。在激光共聚焦显微镜下观察细胞，通过荧光分布位置与强度来显示细胞中含量(见图9)。
[0026]实施例6定量测定人血中半胱氨酸含量
(1)向380μ I的经PBS:乙醇溶液(体积比9:1)稀释的10%正常人血浆中加入20 μ I最终半胱氨酸浓度分别为2μΜ、5μΜ、10μΜ、20μΜ、30μΜ、40 μ Μ、50 μ M半胱氨酸溶液；
(2)向反应体系中加入Iμ?终浓度为10 μ M 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素起始反应;
(3)进行荧光检测(λΕχ=380nm, λ Em=500 nm);计算信噪比S/N>10，检测不同半胱氨酸含量血浆中荧光强度信号。
【权利要求】
1.一种用于识别半胱氨酸的特异性荧光探针，其特征在于:所述荧光探针为4位含有不同取代基团的7-羟基香豆素衍生物，其结构通式如下:
2.根据权利要求1所述的一种用于识别半胱氨酸的特异性荧光探针，其特征在于:所述荧光探针应用于生物样本中半胱氨酸含量的定量评价。
【文档编号】G01N21/64GK103755672SQ201410037292
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月26日 优先权日:2014年1月26日
【发明者】崔京南, 冯磊 申请人:大连理工常熟研究院有限公司