特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种EphA2来源的抗肿瘤CTL表位肽，为九肽，其氨基酸序列为Gln?Asn?Ile?Met?Asn?Asp?Met?Pro?Ile。本发明还包括上述肽在制备肿瘤治疗性DC?CIK中的应用。本发明所制备的特异性的DC?CIK细胞对肝癌细胞HepG2显示出一定的杀伤率，可用于制备肝癌特异性自体免疫细胞的制备。
【专利说明】
特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及表位肽技术领域，尤其涉及一种特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位 肽及其应用，还涉及一种肿瘤抗原EphA2特异性DC细胞的制备方法及其应用，以及一种肿瘤 抗原EphA2特异性DC-CIK细胞的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] Eph(erythropoietin producing human hepatocellularcarcinoma)受体家方矣是 受体酪氨酸激酶(RTKs)家族成员中最大的亚族，Eph受体和其配体ephrins间的相互作用参 与了胚胎发育的许多过程，如在神经轴突导向、血管发生、肿瘤形成等方面具有重要作用。 EphA2是EphA亚家族受体8个成员中的第2个，与Eph受体家族的其他成员有着相似的结构特 征，并且与细胞增殖、迀移等有关。EphA2在正常成熟细胞尤其是上皮细胞中处于低表达状 态，而在一些恶性肿瘤中广泛高表达，如肝癌、食管癌、前列腺癌、侵袭性黑色素瘤、神经胶 质瘤、卵巢癌等等。
[0003] 目前治疗癌症主要有外科疗法(手术）、化学疗法(化疗）、放射治疗(放疗)和生物 治疗四大模式，外加传统的中医药治疗和现代微创治疗方法。但是大多数病人的经过治疗 后的生存率和生活质量均没有得到很大改善。这可能由于肿瘤在发生的早期就有部分肿瘤 细胞转移到其他组织或器官，而目前的检查手段并不能显示出来，这很可能是很多肿瘤在 治疗后，出现复发和转移的主要原因。因此肿瘤的治疗需要作为全身性疾病进行治疗，不仅 要去除局部病灶的肿瘤，还要防止肿瘤的复发、转移。才可能真正有效地提高肿瘤病人的治 愈率和生存期。传统的化疗药物虽然在某些肿瘤的治疗方面取得一定的进展，但是患者的5 年生存率来看，并没有明显改善，同时化疗药物容易出现获得性多耐药及毒副作用，限制其 临床使用，因此需要更好的全身治疗的手段。
[0004] 免疫细胞治疗是近二十年发展起来的，指的是刺激人体自身免疫系统来抵抗癌症 的治疗方法。肿瘤免疫治疗有望成为继手术、化疗、放疗、靶向治疗后肿瘤治疗领域的一场 革新。相比于传统的治疗方法表现出更好的靶向性和特异性，对肿瘤的治疗更为有效，无毒 副作用，对提高生命质量、延长生存期有显著地效果，是目前肿瘤全身治疗的最佳手段之 〇
[0005] 然而，目前在诱导特异DC-CIK细胞的抗原仍有待改进，缺乏能够高效刺激肿瘤特 异性DC-CIK的CTL表位多肽抗原。
【发明内容】
[0006] 基于【背景技术】存在的技术问题，本发明目的在于提供一种特异性肿瘤抗原EphA2 的CTL识别表位肽。
[0007] 本发明目的还在于提供上述特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽的应用。
[0008] 本发明目的还在于提供一种肿瘤抗原EphA2特异性DC细胞的制备方法。
[0009] 本发明目的还在于提供一种肿瘤抗原EphA2特异性DC-CIK细胞的制备方法。
[0010] 本发明目的还在于提供上述肿瘤抗原EphA2特异性DC细胞和DC-CIK细胞的应用。
[0011] 为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
[0012]本发明提出的一种特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽，所述CTL识别表位肽 为九肽，其氨基酸序列如下:Gln-Asn-11 e-Met-Asn-Asp-Met-Pro-11 e。
[0013]上述特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽采用固相合成法进行合成。基本流程 如下：首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后 脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上;其次将第二个氨基被Fmoc基团保 护的氨基酸的羧基缩合剂活化，活化后的第二个氨基酸羧基再与已接在固相载体的第一个 氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上 述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目 的肽，再经HPLC纯化，其纯度大于90%。
[0014]本发明还提出的上述特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽在制备具有EphA2表 达的肿瘤治疗性多肽疫苗的应用。
[0015]优选地，上述特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽在制备肝癌EphA2表达相关 的肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用，尤其对肝癌细胞IfepG2具有杀伤力。
[0016] 本发明还提出的一种肿瘤抗原EphA2特异性DC细胞的制备方法，采用上述特异性 肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽加入DC细胞进行培养得到。
[0017] 本发明还提出的上述肿瘤抗原EphA2特异性DC细胞的制备方法得到的特异性DC细 胞在制备治疗EphA2表达相关的肿瘤药物中的应用。
[0018] 本发明还提出的一种肿瘤抗原EphA2特异性DC-CIK细胞的制备方法，采用上述特 异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽进行诱导得到。
[0019] 本发明还提出的上述肿瘤抗原EphA2特异性DC-CIK细胞的制备方法得到的特异性 DC-CIK细胞在制备治疗EphA2表达相关的肿瘤药物中的应用。
[0020] 本发明巧妙利用EphA2在肝癌等肿瘤中呈现高表达，而在正常组织中表达很低，从 而采用理论和实验相结合的方法筛选得到肿瘤相关抗原的表位肽，所得表位肽未见文献报 道，为研制基于抗原EphA2的肿瘤疫苗或肿瘤特异性CTL细胞的制备提供理论基础，并为后 续多价的抗原肽疫苗构建奠定基础。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明提出的一种特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽的质谱分析图。 [0022]图2为本发明实施例1所得P1、P2、P3……P20各自诱导得到的特异性CTL细胞分泌 INF-γ的能力对比图。
[0023]图3为本发明实施例1所得Ρ5、P8、P11、P13各自诱导得到的特异性CTL细胞对肝癌 细胞ifepG2杀伤能力对比图。
[0024]图4为由本发明提出的一种特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽所制备得到的 特异性CTL细胞免疫细胞群的流式细胞仪检测数据的统计分析图。
【具体实施方式】
[0025]下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0026] 实施例1:合成表位肽
[0027] 采用理论与实践相结合的方法，根据抗原的一级结构，综合运用免疫信息学手段， 运用SYFPEITHI、B頂AS、NetCTL、WAPP和EpiJen综合对EphA2的抗原CTL表位进行预测分析， 选取评分前20的多肽序列进行试验筛选，一次命名为P1、P2、P3……P20。
[0028] 基本流程如下:首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体 Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上;其次将第二个氨 基被Fmoc基团保护的氨基酸的羧基缩合剂活化，活化后的第二个氨基酸羧基再与已接在固 相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基 的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度， 最后切割得到目的表位肽粗品。将目的表位肽粗品经HPLC纯化得到目的表位肽精肽，其纯 度大于90%，质谱分析证实其分子量符合理论值。
[0029]本发明提出的一种特异性肿瘤抗原EPHA2的CTL识别表位肽采用Fmoc固相合成法 进行合成，所述CTL识别表位肽为九肽，编号为P8,其氨基酸序列如下:Gln-Asn-Ile-Met-Asn-Asp-Met-Pro-I le。对P8进行质谱分析，其质谱分析结果如图1所示，可以证实其分子量 为1075.25976g/mol，符合理论值。
[0030]实施例2:多肽功能检测
[0031]上述所得P8和其余19个表位肽，可用于制备具有EphA2表达的肿瘤治疗性多肽疫 苗，其应用实验如下：
[0032] 1、上述CTL识别表位肽诱导特异性CTL细胞、IFN- 丫分泌及对肿瘤靶细胞的杀伤实 验检测：抽取患者的外周血经密度梯度离心分离，获得PBMCs，添加细胞因子培养DC细胞和 CTL细胞，进一步采用DC细胞负载本发明的EphA2表位肽，与CTL共培养刺激特异的CTL扩增， 进一步在体外采用ELISA和LDH实验检测特异的CTL在特异抗原刺激下INF- γ的分泌及对肝 癌细胞Η印G2的杀伤作用。
[0033]具体方法如下：
[0034] (I)、PBMC的分离与诱导：
[0035] 1)将50mL抗凝处理的外周血，2000rpm离心10min;
[0036] 2)收集上层血浆冻存，用PBS(pH=7.4)稀释剩下的血细胞；
[0037] 3)将稀释的血细胞加入到等体积的淋巴分离液液面上；
[0038] 4)2(TC离心20min，关闭离心机刹车；
[0039] 5)离心后，分为四层，用吸嘴玻璃滴管吸取白膜层(即第二层）；
[0040] 6)取出的白膜层用PBS洗涤两遍；
[00411 7)将细胞以2~5X106/mL接种到6孔板内，2h后，回收未贴壁的细胞，用预包被 &拉卜0)3186和&拉丨-0)28186的培养板进行激活培养；
[0042] 8)贴壁的细胞加入GM-CSF和IL-4刺激培养5天诱导成DC细胞，第三天半换液；
[0043] 9)第5天，收集DC细胞，将10yg实施例1所得目的表位肽精肽加入DC细胞中，lh后， 将DC细胞与激活的T细胞共培养，同时加入IL2及IL-15;
[0044] 10)继续培养5天后，得到抗原特异的CTL细胞进行细胞因子分泌及对肿瘤细胞的 杀伤实验。
[0045] (11 )、IFN-γ 细胞因子分泌检测：Human IFN-gamma Platinum ELISA( IFN-γ ELISA检测试剂盒，eBioscience公司)检测CTL细胞分泌的IFN-γ，步骤如下：
[0046] 1)将CTL细胞去除细胞因子培养24h后，接种到96孔板内；
[0047] 2)细胞中加入刺激对应的多肽再次刺激24h后，离心去除细胞，收集细胞上清；
[0048] 3)采用ELISA检测上清中IFN- γ的表达，选择IFN- γ分泌较多的CTL表位肽进行杀 伤实验。
[0049] 结果如图2所示，Ρ8和？5111、？13负载的0(：细胞均能够较好诱导出特异性(：1^细 胞，分泌较高量的IFN-γ。
[0050] (III)、肿瘤细胞杀伤实验：采用乳酸脱氢酶（LDH)释放检测法，使用CytoTox 96Non_Radioactive Cytotoxicity Assay(细胞毒性检测试剂盒，Promega公司）进行LDH试 验检测细胞杀伤能力。步骤如下：
[0051] 1)设立检测培养板(100μL孔）
[0052] a.设立实验组：以EphA2阳性表达的肝癌细胞HepG2为靶细胞，按效应细胞和靶细 胞比为5:1、10:1、20:1加入上述特性CTL细胞
[0053] b.设立效应细胞自发释放组
[0054] c.设立靶细胞自发释放组
[0055] d.设立靶细胞最大释放组
[0056] e.设立背景对照组
[0057] 2)细胞裂解及收获上清
[0058] &.37。〇5%0)2共培养511
[0059] b.靶细胞最大释放组中加入裂解液，45min后，所有的孔，250g/min离心收集上清
[0060] 3)LDH 检测
[0061 ] a.转移50yL上清至另一个96孔板
[0062] b.每孔加入50yL稀释的底物混合物，室温避光孵育30min
[0063] c.每孔添加 50yL终止液
[0064] d.在490nm下检测吸光值0D [0065]细胞杀伤率计算公式如下：
[0066] 杀伤率（％ ) = [ (0D孅且-0D规_6酸；输齟-0Df_a自发稀齟)/(0D_mt稀齟-0D__发输齟)] X100%
[0067] 结果如图3所示，图3为本发明实施例1所得P5、P8、P11、P13各自诱导得到的特异性 CTL细胞对肝癌细胞HepG2杀伤能力对比图；由图3可知，P8诱导的CTL细胞对肝癌细胞HepG2 杀伤效果最好。
[0068] 2、采用流式分析获得的特异CTL中各种免疫细胞所占的百分比，结果如图4所示。 由图4可知，本发明由P8制备获得的免疫细胞群中含有大量的CTL细胞，同时也含有一定比 例的NKT细胞，即该免疫细胞群具有较好的免疫活性，具有强大的杀伤特定肿瘤细胞的能 力。
[0069] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽，其特征在于，所述CTL识别表位肽为九 肽，其氨基酸序列为 Gln-Asn-I le-Met-Asn-Asp-Met-Pro-I le。2. 权利要求1所述特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽在制备具有EphA2表达的肿 瘤治疗性多肽疫苗的应用。3. 权利要求1所述特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽在制备肝癌EphA2表达相关 的肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用。4. 一种肿瘤抗原EphA2特异性DC细胞的制备方法，其特征在于，采用如权利要求1所述 特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽加入DC细胞进行培养得到。5. 根据权利要求4所述肿瘤抗原EphA2特异性DC细胞的制备方法得到的特异性DC细胞 在制备治疗EphA2表达相关的肿瘤药物中的应用。6. -种肿瘤抗原EphA2特异性DC-CIK细胞的制备方法，其特征在于，采用如权利要求1 所述特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽进行诱导得到。7. 根据权利要求6所述肿瘤抗原EphA2特异性DC-CIK细胞的制备方法得到的特异性DC-CIK细胞在制备治疗EphA2表达相关的肿瘤药物中的应用。
【文档编号】C12N5/0784GK106084027SQ201610483249
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】唐奇, 冯振卿, 许国贞, 刘振云, 蒯兴旺, 朱进, 章明炯
【申请人】安徽未名细胞治疗有限公司