人宫颈癌细胞特异性结合的多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，以改良的肽库消减筛选法筛选对人宫颈癌细胞(SiHa 细胞)特异性结合的多肽(序列），对人宫颈癌细胞具有良好的结合特异性和敏感性。 技术背景
[0002] 宫颈癌(Cervical cancer)是常见的妇科肿瘤之一，其发病率在发达国家仅次于 乳腺癌、子宫内膜癌，在发展中国家则居首位。目前，宫颈癌的治疗主要以手术切除为主，但 因早期宫颈癌无明显症状和体征，易造成漏诊或误诊，待发现时已到中晚期，丧失最佳手术 时机。放疗、化疗毒性极大，易产生剂量依赖性和药物抗药性等，效果不理想，病人的五年生 存率仍然很低。因此，寻找一种敏感性高且特异性强的早期筛查诊断方法，从而降低宫颈癌 的死亡率也是目前面临的关键问题之一。
[0003] 近年来，迅速发展的分子影像学与靶向治疗为宫颈癌的治疗带来了新的希望，其 中，筛选出宫颈癌细胞表面特异性强、敏感度高的靶向分子成为当务之急。
[0004] 噬菌体肽库技术为宫颈癌细胞靶向分子筛选、宫颈癌的早期诊断和靶向治疗提供 了新的途径，其中的关键元件是对癌细胞、癌组织具有特异靶向结合活性的多肽片段的获 得。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于，提供以改良的肽库消减筛选由噬菌体12肽库筛选得到对宫颈 癌细胞特异性结合的多肽序列，并提供鉴定该多肽与宫颈癌细胞特异性亲和力的实验结 果，证明该多肽在宫颈癌的早期分子影像学诊断、靶向化疗、与其它材料偶联而进行的宫颈 癌靶向治疗等方面具有巨大应用价值。
[0006] 为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
[0007] 宫颈癌SiHa细胞特异性结合的多肽，其氨基酸序列为:QQLKDPWHSTPY。该多肽能够 特异性结合SiHa细胞，而不识别人胚肾HEK293细胞（即正常细胞），并对其他肿瘤细胞表现 出极低的亲和力或者无亲和力。
[0008] 上述宫颈癌SiHa细胞特异性结合的多肽的筛选方法为以体外培养的SiHa细胞系 为靶细胞，以人胚肾J1EK293细胞系为非特异性吸附细胞，对噬菌体随机12肽库进行4轮消减 筛选，随机挑取60个噬菌体克隆，利用ELI SA鉴定出阳性克隆。对阳性克隆进行DNA测序，分 析其多肽的氨基酸序列组成及基本特征，最后获得拥有共有序列(Consensus sequence)的 阳性克隆组6个，对它们以细胞免疫荧光法进一步鉴定其特异性和敏感性，确定最佳序列。
[0009] 各种噬菌体克隆水平、最佳序列合成肽探针水平的实验结果均提示序列 QQLKDPWHSTPY特异性、敏感性最佳，这为该多肽未来用于宫颈癌的早期分子影像学诊断、靶 向化疗等提供了实验依据。由于多肽分子量小、免疫原性低、亲和力高、组织穿透性强、易合 成等特点也有望使其与适当的荧光标记物、纳米颗粒、脂质体或抗肿瘤药物等偶联，从而应 用于肿瘤的早期影像诊断、靶向治疗、病程监测及肿瘤治疗疗效评价等，对于解决目前癌症 防治所面临问题具有重要的意义。
[0010] 本发明以宫颈癌SiHa细胞为靶细胞，对噬菌体12肽库以我们改良的消减筛选法进 行了4轮消减筛选，最后获得6条共同多肽序列，分别为KNLTNEPQVPLV、ETLPQNESKIPW、 QQLKDPWHSTPY、VTALRKVDHTPL、SLSEWQDVRTTS、TITSKLVKWSRK。通过一系列鉴定分析实验发 现其中的QQLKDPWHSTPY对于宫颈癌的靶向性最强，提示了其用于宫颈癌诊断、靶向治疗方 面的价值。
[0011] 在宫颈癌检测方面，利用同位素或者荧光标记的多肽可以特异性结合宫颈癌细 胞/组织，适用于肿瘤成像和分子影像诊断，对于宫颈癌早期检测、癌病灶定位和疗效评价 都具有重要意义;在宫颈癌靶向治疗方面，有望利用其特异性高、分子量小、穿透力强、亲和 力高的特性来与化疗药物偶联，达到靶向递送给药的目的，可大大减小化疗药物的非特异 性和毒副作用。
【附图说明】
[0012] 图1为本发明多肽的制备路线图；
[0013] 图2为随机十二肽pill融合蛋白的N末端序列；
[0014] 图3为专用密码子表；
[0015]图4为首次ELISA所选36个阳性噬菌体克隆与SiHa细胞亲和力的再鉴定结果；
[0016]图5为6条共有序列的代表性阳性噬菌体克隆与细胞亲和力的免疫荧光鉴定，其中 A:S6+SiHa；B:S6+Hek293；C：S7+SiHa；D：S7+Hek293；E：S21+SiHa；F：S21+Hek293；G：S22+ SiHa；H：S22+Hek293；I：S31+SiHa；J：S31+Hek293；K：S46+SiHa；L：S46+Hek293；M：URPs+ SiHa; N: PBS+SiHa; DAPI 染细胞核；
[0017] 图6为克隆S7(QQLKDPWHSTPY)与靶细胞亲和力鉴定，其中A:SiHa+S7;B:Hek293+ S7; C: SiHa+URP; D: Hek293+URP; E: SiHa+PBS; F: Hek293+PBS; DAPI 染细胞核；
[0018]图7为细胞免疫化学鉴定阳性噬菌体克隆S7与靶细胞的结合特异性，其中A:SiHa+ S7；B：SiHa+URP；C：SiHa+PBS；D：Hek293+S7；E：Hek293+URP；F：Hek293+PBS；
[0019]图8为阳性噬菌体克隆S7与多种肿瘤细胞的结合特异性，其中A:S7+SiHa;B:S7+ SMMC-7721(肝癌细胞）；C:S7+MCF-7(乳腺癌细胞）；D:S7+Cac〇-2(结直肠癌细胞）；E:S7+ Hek293; F: PBS+SiHa; G: URPs+SiHa; DAPI染细胞核；
[0020] 图9为合成多肽(QQLKDPWHSTPY)与靶细胞特异性结合剂量、时间效应，其中左侧为 剂量效应检测，右侧为时间效应检测；
[0021] 图10为合成多肽(QQLKDPWHSTPY)与靶细胞的结合特异性鉴定，其中A:SiHa+阳性 多肽;B:SiHa+阴性多肽;C:Hek293+阳性多肽;D:Hek293+阴性多肽;DAPI染细胞核；
[0022]图11为合成多肽(QQLKDPWHSTPY)在靶细胞定位分析，其中A:SiHa+阳性多肽;B: S iHa+阴性多肽;C: Hek293+阳性多肽;D: Hek293+阴性多肽;DAP I染细胞核；
[0023]图12为细胞免疫荧光鉴定合成多肽(QQLKDPWHSTPY)与多种肿瘤细胞的结合特异 性，其中A:SiHa;B:SMMC-7721(肝癌细胞）；C:MCF-7(乳腺癌细胞）；D:Eca-109(食道癌细 胞）；E:Cac 〇2(结直肠癌细胞）；F:SGC-7901(胃癌细胞）；DAPI染细胞核。
[0024]以下结合附图和具体实例对本发明作进一步说明。
【具体实施方式】
[0025] 菌体展示技术是1985年由美国Missouri大学的G.P. Smith等创立的一项能够特 异性筛选多肽或蛋白的技术。该技术将目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌 体表面，与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，被展示的多肽或蛋白能够保持相对独立的空间结 构和生物活性。目前，噬菌体展示技术已经被广泛应用于肿瘤标志物的筛选、肿瘤药物的靶 向运输和多肽药物开发等方面的研究。
[0026] 本发明就是利用上述肽库以改良的肽库消减筛选法筛选可以特异敏感的结合于 人宫颈癌细胞的一条多肽序列，并以相关实验证明了该序列对人宫颈癌细胞结合的高度特 异性和敏感性。该多肽具有亲和力高、分子量小、组织穿透性强、免疫原性低、易合成等特 点，将其连接其它效应分子，可以用于宫颈癌的早期分子影像学诊断，形成肿瘤三维成像， 大大提高宫颈癌的早期诊断率，并可对治疗疗效评价;作为宫颈癌化疗药物的导向元件而 用于宫颈癌的靶向化疗，可大大降低药物毒性而提高疗效，使化疗成为对病人确实有益的 治疗方法之一;将多肽与纳米脂质体或纳米药物偶联，可达到更好的靶向治疗效果；用于寻 找肿瘤细胞表面相关配体的研究，为肿瘤治疗提供新的靶点。
[0027] 本发明以人宫颈癌SiHa细胞为靶细胞，对噬菌体肽库以改良的肽库消减筛选法进 行4轮消减筛选，寻找与宫颈癌细胞SiHa具有特异性结合力的噬菌体肽序，为进一步研发宫 颈癌早期靶向诊断试剂和高效低毒靶向治疗药物奠定基础，具体技术路线如图1所示。 [0028] 一、材料与方法
[0029] 1.1主要实验材料
[0030] 1.1.1细胞株人宫颈癌细胞株SiHa，购于美国ATCC(Rockville，USA)，人胚肾细胞 株HEK293，为本实验室保存。
[0031] 1.1.2噬菌体随机十二肽库贮存:与甘油1:1保存在TBS溶液中，1.5 X 1013pfu/ml。 复杂度:~2.7X109个转化子。载体M13KE的外壳基因-96gIII测序引物:5'-HQCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3,。
[0032] 1.1.3宿主菌￡.(：〇11￡1?2738，与甘油1:1保存在-80°(：超低温冰箱中。
[0033] 1.2实验方法
[0034] 1.2.1细胞培养
[0035] 用DMEM完全培养基、37 °C、饱和湿度、5 % C02孵箱。
[0036] 1.2.2宿主菌￡.(：〇11￡1?2738的准备
[0037] E.coli ER2738是NEB公司的Ph.D系列噬菌体肽库的专用菌株。用LB-Tet培养基、 37 °C恒温摇床、300rpm振荡过夜。
[0038] 1.2.3噬菌体随机十二肽库体外快速消减筛选
[0039]以人胚肾细胞HEK293作为阴性吸附细胞预吸附以排除非正常细胞靶向克隆，再以 人宫颈癌细胞SiHa和作为祀细胞，对革E1向宫颈癌克隆以改良的消减筛选法（Subtraction Biopanning)进行淘筛，重复4轮。相对于噬菌体肽库试剂盒生产商一一美国新英格兰生物 实验室公司（New England BioLabs Inc.，NEB)提供的传统经典Biopanning方法(见试剂盒 说明书），在此基础上，改良的消减筛选法每一轮Biopanning的特色如下：（1)每轮第一步增 加了以正常细胞对投入噬菌体肽库的预吸附，以尽可能除去非癌细胞靶向的噬菌体克隆； (2)将传统步骤要求的"扩增"步骤的25ml菌液体积改为3ml。这一改变大大简化了实验难度 和提高了筛选效率；（3)由于第(2)项改变，最后一轮(一般做4轮Biopanning)可以随机挑选 至少60个或更多的噬菌体克隆。
[0040]所选噬菌体克隆扩增后以ELISA法鉴定与靶细胞SiHa的亲和力。
[0041 ] 1.2.4阳性噬菌体克隆多肽序列的测定
[0042]对噬菌体阳性克隆、无关克隆进行测序，根据遗传密码子表格(参见图2、图3)，将 多肽序列翻译成氨基酸序列并获得Consensus序列。
[0043] 1 ? 2 ? 5Consensus序列的结合特异性鉴定
[0044] 以Consensus序列的代表性克隆通过常规细胞免疫荧光法进行结合特异性和敏感 性的鉴定。
[0045] 1.2.6统计学分析
[0046]利用SPSS 16.0数据处理软件进行数据分析，数据结果用x土SD表示，P〈0.01表示 差异极显著，P〈〇.05表示差异显著，P>0.05说明差异不显著，无统计学意义，组间多重比较 采用Duncan检验处理。
[0047] 二、实验结果
[0048] 2.1阳性克隆的ELISA鉴定和测序
[0049] 获得阳性噬菌体克隆36个，其中克隆S7与SiHa细胞结合特异性最高，结果如图4所 示。阳性噬菌体克隆有6个共有序列:KNLTNEPQVPLV(代表性克隆S22);ETLPQNESKIPW(代表 性克隆S6) ;QQLKDPWHSTPY(代表性克隆S7) ;VTALRKVDHTPL(代表性克隆S21) ;SLSEWQDVRTTS (代表性克隆S31) ;TITSKLVKWSRK(代表性克隆S46);无关克隆（阴性克隆）序列为 SSLNHLTSLTNW。
[0050] 2.2阳性噬菌体克隆的结合特异性
[0051 ] 结果如图5-图8所示，阳性噬菌体克隆均结合SiHa细胞而不与HEK293细胞结合，以 克隆S7 (QQLKDPWHSTPY)最佳，说明该阳性多肽有很好的靶向性。
[0052] 2.3合成FITC标记多肽QQLKDPWHSTPY的特异性和敏感性鉴定
[0053] 结果如图9-图12所示。多肽QQLKDPWHSTPY特异结合于SiHa细胞表面而不与HEK293 结合，或与其他种类癌细胞呈现极低结合力。
【主权项】
1. 人宫颈癌细胞特异性结合的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列为： QQLKDPWHSTPY。2. 权利要求1所述多肽特异结合人宫颈癌细胞的应用。3. 权利要求1所述多肽用于制备治疗人宫颈癌药物的应用。
【专利摘要】本发明涉及人宫颈癌细胞SiHa特异性结合的多肽及其应用，所涉及多肽的氨基酸序列为：QQLKDPWHSTPY。所涉及的应用为本发明的人宫颈癌细胞SiHa特异性结合的多肽特异结合人宫颈癌的应用。本发明筛选和初步鉴定获得的宫颈癌靶向多肽具有明显的宫颈癌细胞结合特异性，可用于研发宫颈癌早期靶向诊断试剂、高效低毒靶向治疗药物。
【IPC分类】A61K47/42, C07K7/08, A61P35/00
【公开号】CN105713071
【申请号】CN201610085382
【发明人】侯颖春, 何慧敏, 肖丽, 高晓杰, 薛琴琴, 达苗苗, 马乐乐, 马妮, 程思楠
【申请人】陕西师范大学