新型与人tlr2及人tlr4结合的双特异性抗体的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种双特异性抗体，其与人TLR2及人TLR4这两者作用，通过抑制人TLR2及人TLR4介导的免疫炎症作用而预防或治疗免疫炎症性疾病。提供一种相对于人LR2及人TLR4的双特异性抗体，其包含：由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗体的重链可变区、由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗体的轻链可变区、由序列号4的氨基酸序号491至609的氨基酸序列构成的抗人TLR4抗体的重链可变区、及由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人TLR4抗体的轻链可变区。
【专利说明】
新型与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体
技术领域
[0001 ]本发明设及一种新型的与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体。
【背景技术】
[0002] Toll样受体2(Toll-Like Receptor 2;TLR2)及Toll样受体4(Toll-Like Receptor 4;TLR4)为在包含巨隧细胞及中性粒细胞等免疫活性细胞、血管内皮细胞、肾小 管上皮细胞等肾固有细胞的广泛的细胞W及组织中表达的一次跨膜型的蛋白质（Folia Biol (Pr址a).、2005、Vol. 51、No. 6、p. 188-197)。化32与化1?1或化36形成复合体，与肤聚糖 或脂蛋白等的细菌成分进行反应。另一方面，TLR4与髓样分化因子2(MD2)蛋白质或CD14蛋 白质等形成复合体，并与W脂多糖化PS)为代表的脂多糖等的细菌成分进行反应。另外，运 些受体通过与作为内源性的组织损伤因子的损伤相关分子模式(DAMPS)结合而被活化，从 而向细胞内传递信号。TLR2及化R4的活化例如经由作为转录因子的核因子kB(NF-kB)的活 化而诱导肿瘤坏死因子曰(TNFa)或白细胞介素6(IL-6)等炎症性的细胞活素的表达，从而引 起炎症应答(Nat. Immunol.、2010、V〇1.11、No.5、p.373-384)。
[0003] 已知运种化R2及化R4介导的各种细胞的活化参与免疫炎症性疾病如败血症、急性 肾损伤、慢性肾脏病、急性呼吸窘迫综合征、硬皮病、急性膜腺炎、慢性闭塞性肺疾病等疾 病。
[0004] 作为与败血症的关联，据报道在作为败血症模型的沙口氏菌感染模型中化R2的遗 传缺陷动物(基因敲除小鼠）显示生存率改善，在大肠杆菌感染模型中化R4基因敲除小鼠显 示生存率改善，进而，在各模型中化R2及化R4的双基因敲除小鼠与化R2或化R4的单独基因 敲除小鼠相比，生存率大幅度改善(J.Exp.Med.、2008、V〇1.205、p. 1747-1754)。另外，据报 道在前述两个模型中，在抗化R2抗体(T2.5)或抗化R4抗体（1A6)的单独给药中，生存率没有 改善，与此相对，通过两抗体的并用给药，生存率得到改善（J.Exp.Med.、2008、V〇1.205、 p.1747-1754)。
[0005] 作为与急性膜腺炎的关联，据报道在牛横胆酸诱发膜腺炎模型中化R4的基因敲除 小鼠的血中淀粉酶、膜脏髓过氧化物酶、及膜脏组织损伤降低（Inf lamm. Res.、2011、 Vol .60、p. 1093-1098)。另外，据报道在雨蛙素诱导膜腺炎模型中，在膜脏中，TLR2及化R4的 表达量上升（Pancreas、2013、Vol.42、p. 114-122)。
[0006] 作为与人化R2结合的抗体，报道有小鼠单克隆抗体T2.5(专利文献1)、小鼠单克隆 抗体11G7(专利文献2)、及T2.5的人源化单克隆抗体0PN305(专利文献3)。其中，报道有11G7 抑制化R2/TLR1信号，但不抑制化R2/TLR6信号，与此相对，0PN305对两信号均抑制。具体而 言，据报道在使用了人单核系细胞THP-1细胞的实验中，0PN305对Pam3CSK4(TLR2ALRl激动 剂)刺激及F化-UTLR2ALR6激动剂）刺激运两者具有中和活性，进而抑制通过Pam3CSK4给 药而诱导的小鼠血中炎症性细胞因子浓度上升(专利文献3)。
[0007] 作为与人化R4结合的抗体，报道有小鼠单克隆抗体HTA125(非专利文献1)、小鼠单 克隆抗体1細10、16G7、15C1及7E3(专利文献4)、15C1的人源化单克隆抗体hul5Cl(专利文献 5)、W及通过对hul5Cl的互补决定区的随机突变而发现的人源化单克隆抗体1A6及 1E11.C2E3等(专利文献6)。其中，关于小鼠单克隆抗体，15C1由使用了人血液的实验结果而 示出中和活性最高（专利文献4)，15C1的人源化单克隆抗体hul5Cl通过同样的使用了人血 液的实验而确认具有中和活性(专利文献5)。进而，据报道人源化单克隆抗体化11.C2E3与 hul5Cl相比，在使用了人血液的实验中具有优异的中和活性(专利文献6)。
[000引另外，据报道在对于使用了人血液的加热处理的大肠杆菌、假单胞菌属 (Pseudomonas)及克雷伯氏菌属化lebsiella)刺激而产生化-6的评价系统中，抗人化32抗 体(T2.5)较弱地抑制IL-6产生，抗人化34抗体（15C1)为抑制约50%IL-6产生的程度，与此 相对，通过两抗体的并用添加而几乎完全抑制IL-6产生(专利文献7)。
[0009] 但是，与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体迄今为止没有进行报道。
[0010] 现有技术文献
[0011] 专利文献
[0012] 专利文献1:国际公开第2005/028509号
[0013] 专利文献2:国际公开第2005/019431号
[0014] 专利文献3:国际公开第2011/003925号
[0015] 专利文献4:国际公开第2005/065015号
[0016] 专利文献5:国际公开第2007/110678号 [0017] 专利文献6:国际公开第2013/149111号
[0018] 专利文献7:国际公开第2006/077471号
[0019] 非专利文献
[0020] 非专利文献 1:。实验医学杂志（The Journal of Experimental Medicine)"、（美 国）、1999、Vol.189、No.11、p.1777-1782
【发明内容】
[0021] 发明所要解决的课题
[0022] 本发明的课题在于提供一种双特异性抗体，其通过与人TLR2及人化R4运两者结合 而抑制人TLR2及人TLR4介导的免疫炎症作用，由此预防或治疗免疫炎症性疾病。
[0023] 解决课题的手段
[0024] 本发明人等在与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体的制作中重复进行了大量 的独创研究，结果发现:制作下述与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体(实施例1至8)，该 双特异性抗体抑制由与化R2及TLR4反应的源自临床分离株的绿脈杆菌Pseudomonas aeruginosa PA0-1的加热处理死菌体后称为死菌)诱导的炎症性细胞因子TWa的产生 (实施例10)，所述双特异性抗体含有1)由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成 的抗人化R2抗体的重链可变区、及由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗 人化R2抗体的轻链可变区；W及2)由序列号4的氨基酸序号491至609的氨基酸序列构成的 抗人化R4抗体的重链可变区、及由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗 人化R4抗体的轻链可变区。运些结果提供了前述与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体， 从而完成了本发明。另外发现：该双特异性抗体也抑制由源自临床分离株的大肠杆菌 Escherichia coli 21006的死菌所诱导的TN阳产生(实施例11)。
[0025] 目P，本发明作为医学上或工业上有用的物质或方法包含W下的发明。
[0026] [ 1 ]-种与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体，其从W下的（1)或(2)中选择：
[0027] (1) 一种与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体，包含：
[00%] 1)由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的重链可变 区、及由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的轻链可变区，W 及
[0029] 2)由序列号4的氨基酸序号491至609的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的重链可 变区、及由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的轻链可变 区；或
[0030] (2)作为通过（1)的双特异性抗体的翻译后修饰而生成的双特异性抗体的与人 TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体。
[0031] [2]根据[1]所述的双特异性抗体，其从W下的（1)或(2)中选择：
[0032] (1)-种含有抗人TLR2抗体及抗人TLR4抗体片段的双特异性抗体，
[0033] 该抗人化R2抗体为IgG抗体，且包含由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列 构成的抗人化R2抗体的重链可变区、及由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成 的抗人TLR2抗体的轻链可变区，
[0034] 该抗人化R4抗体片段为单链可变区片段（scFv)，且包含由序列号4的氨基酸序号 491至609的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的重链可变区、及由序列号4的氨基酸序号625 至732的氨基酸序列构成的抗人TLR4抗体的轻链可变区;或
[0035] (2)作为通过（1)的双特异性抗体的翻译后修饰而生成的双特异性抗体的与人 TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体。
[0036] [ 3 ]根据[2 ]所述的双特异性抗体，该双特异性抗体含有抗人化R2抗体及抗人化R4 抗体片段，
[0037] 该抗人化R2抗体为IgG抗体，且包含由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列 构成的抗人化R2抗体的重链可变区、及由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成 的抗人TLR2抗体的轻链可变区，
[0038] 该抗人化R4抗体片段为scFv，且包含由序列号4的氨基酸序号491至609的氨基酸 序列构成的抗人化R4抗体的重链可变区、及由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序 列构成的抗人TLR4抗体的轻链可变区。
[0039] [4]根据[2]所述的双特异性抗体，其中，翻译后修饰为抗人化R2抗体的重链可变 区氨基末端(N末端）的焦谷氨酷化口少瓜夕抗人化R2抗体的重链簇基末端(C末 端)的赖氨酸缺失、和/或抗人TLR4抗体片段的重链可变区N末端的焦谷氨酷化。
[0040] [5]根据[2]至[4]中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗人化R2抗体包含作为人 Ig 丫 1恒定区的重链恒定区。
[0041] [6]根据[引所述的双特异性抗体，其中，人Ig 丫 1恒定区为具有L234A及L235A的氨 基酸突变或L234A、L235A及I253A的氨基酸突变的人Ig 丫 1恒定区。
[0042] [7]根据[2]至[4]中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗人化R2抗体包含作为人 IgK恒定区的轻链恒定区。
[0043] [引根据[2]至[4]中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗人化R2抗体包含作为人 Ig 丫 1恒定区的重链恒定区及作为人IgK恒定区的轻链恒定区。
[0044] [9]根据[引所述的双特异性抗体，其中，人Ig 丫 1恒定区为具有L234A及L235A的氨 基酸突变或L234A、L235A及I253A的氨基酸突变的人Ig 丫 1恒定区。
[0045] [10]根据[2]或[3]所述的双特异性抗体，其中，抗人化R2抗体含有由序列号4的氨 基酸序号1至450的氨基酸序列构成的重链、及由序列号6的氨基酸序列构成的轻链。
[0046] [11]根据[2]至[10]中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗人化R4抗体片段为具 有在重链可变区的C末端经由接头连结轻链可变区域的N末端的结构的scFv。
[0047] [12]根据[2]至[11]中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗人化R4抗体片段为由 序列号4的氨基酸序号491至732的氨基酸序列构成的scFv。
[0048] [13]根据[2]或[3]所述的双特异性抗体，其中，抗人化R2抗体含有由序列号4的氨 基酸序号1至450的氨基酸序列构成的重链、及由序列号6的氨基酸序列构成的轻链，抗人 TLR4抗体片段为由序列号4的氨基酸序号491至732的氨基酸序列构成的scFv。
[0049] [14]根据[2]至[13]中任一项所述的双特异性抗体，其中，在抗人化R2抗体的各重 链的C末端经由接头连结抗人TLR4抗体片段的N末端。
[0050] [15]根据[14]所述的双特异性抗体，其中，连结抗人化R2抗体的重链和抗人化R4 抗体片段的接头由GS接头构成。
[0051] [16]根据[1引所述的双特异性抗体，其中，GS接头由序列号9的氨基酸序列构成。
[0052] [17]根据[2]或[3]所述的双特异性抗体，其中，抗人化R2抗体含有由序列号4的氨 基酸序号1至450的氨基酸序列构成的重链、及由序列号6的氨基酸序列构成的轻链，抗人 化R4抗体片段为由序列号4的氨基酸序号491至732的氨基酸序列构成的scFv，在该抗人 TLR2抗体的各重链的C末端经由接头连结该抗人TLR4抗体片段的N末端。
[0053] [1引根据[17]所述的双特异性抗体，其中，连结抗人化R2抗体的重链和抗人化R4 抗体片段的接头由GS接头构成。
[0054] [19]根据[1引所述的双特异性抗体，其中，GS接头由序列号9的氨基酸序列构成。
[0055] [20]-种双特异性抗体，其是通过[17]至[19]中任一项所述的双特异性抗体的翻 译后修饰而生成的。
[0056] [21]-种多核巧酸，其含有编码[1]所述的双特异性抗体的抗人化R2抗体的重链 可变区、抗人化R2抗体的轻链可变区、抗人TLR4抗体的重链可变区、和/或抗人TLR4抗体的 轻链可变区的碱基序列。
[0057] [22]-种多核巧酸，其含有编码在[17]至[19]中任一项所述的双特异性抗体的抗 人化R2抗体的重链的C末端经由接头连结抗人化R4抗体片段的N末端而成的融合体的碱基 序列。
[0058] [23]根据[22]所述的多核巧酸，其含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的所述 融合体的碱基序列。
[0059] [24]-种多核巧酸，其含有编码[17]至[19]中任一项所述的双特异性抗体的抗人 TLR2抗体的轻链的碱基序列。
[0060] [2引一种表达载体，其含有[21]所述的多核巧酸。
[0061] [26]-种表达载体，其含有[22]、[23]、和/或[24]所述的多核巧酸。
[0062] [27]-种用[25]所述的表达载体进行了转化的宿主细胞，其选自由W下的（a)至 (d)构成的组：
[0063] (a)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人 化R2抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至 609的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、及含有编码 由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的轻链可变区的碱基 序列的多核巧酸的表达载体、和包含含有编码由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序 列构成的抗人化R2抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿 主细胞；
[0064] (b)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人 化R2抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至 609的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、含有编码由 序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的轻链可变区的碱基序 列的多核巧酸、及含有编码由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗人化R2 抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0065] (C)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人 化R2抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至 609的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、及含有编码 由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的轻链可变区的碱基 序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞;W及
[0066] (d)用包含含有编码由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗人 TLR2抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0067] [2引一种用[26]所述的表达载体进行转化的宿主细胞，其选自由W下的(a)至(d) 构成的组：
[0068] (a)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸的表达载体和含有[24]所述的多核巧酸的 表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0069] (b)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸和[24]所述的多核巧酸的表达载体进行了 转化的宿主细胞；
[0070] (C)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；W及
[0071] (d)用含有[24]所述的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0072] [29] -种生产与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体的方法，包括:对选自由W 下的(a)至(C)构成的组中的宿主细胞进行培养，并使与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗 体表达的工序：
[0073] (a)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人 化R2抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至 609的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、及含有编码 由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的轻链可变区的碱基 序列的多核巧酸的表达载体、和包含含有编码由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序 列构成的抗人化R2抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿 主细胞；
[0074] (b)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人 化R2抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至 609的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、含有编码由 序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的轻链可变区的碱基序 列的多核巧酸、W及含有编码由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗人 TLR2抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞;W及
[0075] (C)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人 化R2抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至 609的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、及含有编码 由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的轻链可变区的碱基 序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、W及用包含含有编码由序列号6的氨 基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸 的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0076] [30] -种生产与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体的方法，包括:对选自由W 下的(a)至(C)构成的组中的宿主细胞进行培养，并使与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗 体表达的工序：
[0077] (a)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸的表达载体和含有[24]所述的多核巧酸的 表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0078] (b)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸和[24]所述的多核巧酸的表达载体进行了 转化的宿主细胞；W及
[0079] (C)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、W及 用含有[24]所述的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0080] [31]-种用[29]所述的方法所生产的与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体。
[0081] [32]-种用[30]所述的方法所生产的与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体。
[0082] [33]-种医药组合物，其含有[1]至[20]、[31]及[32]中任一项所述的双特异性抗 体及药学上可接受的赋形剂。
[0083] [34]根据[33]所述的医药组合物，其为免疫炎症性疾病的预防或治疗用医药组合 物。
[0084] [3引根据[34]所述的医药组合物，其中，免疫炎症性疾病为败血症或急性膜腺炎。
[0085] [36]-种预防或治疗免疫炎症性疾病的方法，包括施用治疗有效量的[1]至[20]、 [31 ]及[32 ]中任一项所述的双特异性抗体的工序。
[0086] [37]根据[36]所述的预防或治疗的方法，其中，免疫炎症性疾病为败血症或急性 膜腺炎。
[0087] [3引根据[1]至[20]、[31]及[32]中任一项所述的双特异性抗体，其用于在免疫炎 症性疾病的预防或治疗中使用。
[0088] [39]根据[3引所述的双特异性抗体，其中，免疫炎症性疾病为败血症或急性膜腺 炎。
[0089] [40] [1]至[20]、[31]及[32]中任一项所述的双特异性抗体在免疫炎症性疾病的 预防或治疗用医药组合物制造中的应用。
[0090] [41]根据[40]所述的双特异性抗体的应用，其中，免疫炎症性疾病为败血症或急 性膜腺炎。
[0091] [42] -种抗人TLR2抗体或其抗原结合片段，其从W下的（1)或(2)中选择：
[0092] (1)含有由序列号8的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的重链可变区、W及由 序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人化R2抗体或其抗原结 合片段;或
[0093] (2)作为通过（1)的抗人化R2抗体或其抗原结合片段的翻译后修饰而生成的抗体 或其抗原结合片段的抗人TLR2抗体或其抗原结合片段。
[0094] [43]根据[42]所述的抗人TLR2抗体或其抗原结合片段，其含有由序列号8的氨基 酸序号1至120的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸 序列构成的轻链可变区。
[0095] [44]根据[42]所述的抗人化R2抗体或其抗原结合片段，其为通过含有由序列号8 的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号6的氨基酸序号1至113的 氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人TLR2抗体或其抗原结合片段的翻译后修饰而生成的 抗体或其抗原结合片段。
[0096] [45]根据[42]或[44]所述的抗人TLR2抗体或其抗原结合片段，其中，翻译后修饰 为重链可变区N末端的焦谷氨酷化和/或重链C末端的赖氨酸缺失。
[0097] [46]根据[42]至[45]中任一项所述的抗人化R2抗体或其抗原结合片段，其含有作 为人Ig 丫 1恒定区的重链恒定区。
[0098] [47]根据[46]所述的抗人化R2抗体或其抗原结合片段，其中，人Ig 丫 1恒定区为具 有L234A及L235A的氨基酸突变或L234A、L235A及I253A的氨基酸突变的人Ig 丫 1恒定区。
[0099] [4引根据[42]至[45]中任一项所述的抗人化R2抗体或其抗原结合片段，其含有作 为人IgK恒定区的轻链恒定区。
[0100] [49]根据[42]至[44]中任一项所述的抗人化R2抗体或其抗原结合片段，其含有作 为人Ig 丫 1恒定区的重链恒定区及作为人IgK恒定区的轻链恒定区。
[0101] [50]根据[49]所述的抗人化R2抗体或其抗原结合片段，其中，人Ig 丫 1恒定区为具 有L234A及L235A、或L234A、L235A及I253A的氨基酸突变的人Ig 丫 1恒定区。
[0102] [51]根据[42]或[43]所述的抗人化R2抗体，其含有由序列号8的氨基酸序号1至 450的氨基酸序列构成的重链、及由序列号6的氨基酸序列构成的轻链。
[0103] [52]根据[42]至[50]中任一项所述的抗原结合片段，其为单链可变区片段、Fab、 Fab'、或F(ab'）2。
[0104] [53]-种抗人化R2抗体，其为通过[51]所述的抗人化R2抗体的翻译后修饰而生成 的抗体。
[0105] [54]根据[53]所述的抗人TLR2抗体，其中，翻译后修饰为重链可变区N末端的焦谷 氨酷化和/或重链C末端的赖氨酸缺失。
[0106] [55]根据[42]或[44]所述的抗人化R2抗体，其含有由序列号8的氨基酸序号1至 449的氨基酸序列构成的重链、及由序列号6的氨基酸序列构成的轻链。
[0107] [56] -种生产抗人化R2抗体或其抗原结合片段的方法，包括对选自由W下的（a) 至(C)构成的组中的宿主细胞进行培养，使抗人TLR2抗体或其抗原结合片段表达的工序：
[0108] (a)用包含含有编码[43]所述的抗人TLR2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的 碱基序列的多核巧酸和含有编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多 核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0109] (b)用包含含有编码[43]所述的抗人TLR2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的 碱基序列的多核巧酸的表达载体和包含含有编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区 的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞;W及
[0110] (C)用包含含有编码[43]所述的抗人TLR2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的 碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、W及用包含含有编码该抗体或其 抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0111] [57] -种生产抗人化R2抗体的方法，包括对选自由W下的(a)至(C)构成的组中的 宿主细胞进行培养，使抗人TLR2抗体表达的工序：
[0112] (a)用包含含有编码[51]所述的抗人化R2抗体的重链的碱基序列的多核巧酸和含 有编码该抗体的轻链的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0113] (b)用包含含有编码[51]所述的抗人化R2抗体的重链的碱基序列的多核巧酸的表 达载体和包含含有编码该抗体的轻链的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿 主细胞；W及
[0114] (C)用包含含有编码[51]所述的抗人化R2抗体的重链的碱基序列的多核巧酸的表 达载体进行了转化的宿主细胞、W及用包含含有编码该抗体的轻链的碱基序列的多核巧酸 的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0115] [5引一种用[56]所述的方法所生产的抗人TLR2抗体或其抗原结合片段。
[0116] [ 59 ] -种用[57 ]所述的方法所生产的抗人TLR2抗体。
[0117] [60]-种医药组合物，其含有[42]至[55]、[5引及[59]中任一项所述的抗人化尺2 抗体或其抗原结合片段及药学上可接受的赋形剂。
[0118] [61]-种医药组合物，其含有[43]所述的抗人化R2抗体或其抗原结合片段、[44] 所述的抗人TLR2抗体或其抗原结合片段、及药学上可接受的赋形剂。
[0119] [62]-种医药组合物，其含有[51]所述的抗人化R2抗体、[55]所述的抗人化R2抗 体、及药学上可接受的赋形剂。
[0120] [63]根据[60]至[62]中任一项所述的医药组合物，其为癌的预防或治疗用医药组 合物。
[0121] [64]-种预防或治疗癌的方法，包括施用治疗有效量的[42]至[55]、[5引及[59] 中任一项所述的抗人TLR2抗体或其抗原结合片段的工序。
[0122] [65]根据[42]至[55]、[5引及[59]中任一项所述的抗人化R2抗体或其抗原结合片 段，其用于在癌的预防或治疗中使用。
[0123] [66][42]至[55]、[5引及[59]中任一项所述的抗人化R2或其抗原结合片段在癌的 预防或治疗用医药组合物制造中的应用。
[0124] 所述与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体W及抗人化R2抗体及其抗原结合片 段也包含其与其它肤及蛋白质的融合抗体、或使其结合修饰剂而成的修饰抗体。
[0125] 发明效果
[0126] 本发明的双特异性抗体通过人化R2及人化R4的功能抑制而具有强的抗免疫炎症 作用，可w作为免疫炎症性疾病的预防或治疗剂使用。
【附图说明】
[0127] 图1表示在作为IgG抗体的抗人化R2抗体的各重链的C末端经由接头连结抗人化R4 抗体scFv的N末端的本发明的双特异性抗体的结构的一例。
[0128] 图2表示各抗人化32抗体对于向THPl-xBlue细胞产生PamSCSM^LRS/e激动剂）诱 导碱性憐酸酶(AP)的抑制效果。
[0129] 图3表示各双特异性抗体对于向正常人末梢血单核细胞产生大肠杆菌死菌诱导 TNFa的抑制效果。
【具体实施方式】
[0130] W下，对本发明进行详述。
[0131] 在抗体中存在1邑6、1邑1、1邑4、1曲及1姐运5类。抗体分子的基本结构在各类中是共 通的，由分子量5万~7万的重链和2~3万的轻链构成。重链通常由含有约440个氨基酸的多 肤链构成，每类均具有特征性结构，对应于IgG、I gM、IgA、I曲、I巧被称为Ig 丫、Igii、Iga、Ig 8、1邑6。此外，在1邑6中存在1邑61、1邑62、1邑63、1邑(；4的亚类，分别与之对应的重链被称为1邑丫 l、Ig 丫 2、Ig 丫 3、Ig 丫 4。轻链通常由含有约220个氨基酸的多肤链构成，已知有L型和K型2 种，分别被称为Ig^、IgK。就抗体分子的基本结构的肤构成而言，各自同源的2条重链及2条 轻链通过二硫键(S-S键)及非共价键结合，分子量为15万~19万。巧巾轻链可W与任一个重 链构成对。各个抗体分子通常可由2条相同的轻链和2条相同的重链形成。
[0132] 链内S-S键在重链上存在四个(在y、e链上存在五个），在轻链上存在两个，每100~ 110个氨基酸残基形成一个环，该立体结构在各环间类似，被称为结构单元或结构域。即使 为来自同种动物的相同类(亚类)的标准品，重链、轻链中位于N末端的结构域的氨基酸序列 也不恒定，被称为可变区，各结构域分别被称为重链可变区(Vh)及轻链可变区(Vl)。来自可 变区的C末端侧的氨基酸序列在各类或亚类中大致恒定，被称为恒定区（各结构域分别表示 为ChI、Ch2、Ch3或Cl)。
[0133] 抗体的抗原决定部位由Vh及化构成，结合的特异性取决于该部位的氨基酸序列。另 一方面，与补体或各种细胞的结合运样的生物学活性反映各类Ig的恒定区的结构差别。已 知轻链和重链的可变区的可变性大致限于在任一个链上均存在的3个小的超变区，将运些 区域称为互补决定区（CDR;重链、轻链从N末端侧起分别为CDR1、CDR2、CDR3)。可变区的剩余 部分被称为骨架区(FR)，相对恒定。
[0134] 含有抗体的Vh及化的各种抗体片段也具有抗原结合活性，作为运种代表性的抗体 片段，可列举单链可变区片段(3。。乂）^曰6^曰6'^仙'）2而6为由轻链和含有￥11、扣1结构域 和较链区的一部分的重链片段构成的一价的抗体片段。Fab'为由轻链和含有Vh、Ch1结构域 和较链区的一部分的重链片段构成的一价的抗体片段，在该较链区的部分中含有构成了重 链间S-S键的半脫氨酸残基。F(ab'）2片段为2个化b'片段通过较链区中的重链间S-S键结合 的二价的抗体片段。scFv为由用接头(例如肤接头)连结的Vh和化构成的一价的抗体片段。
[0135] 双特异性抗体为运样的抗体，其含有辨识两个不同的抗原、并与各自的抗原结合 的两个抗体的重链可变区及轻链可变区。双特异性抗体报道有各种格式（结构）化xped Rev.Clin.I^armacol.、2010、V〇1.3、No. 4、p. 491-508)。例女日，报道有在一个抗体的重链可 变区及轻链可变区的N末端经由接头而分别连结另一个抗体的重链可变区及轻链可变区的 C末端的四价的双特异性抗体、将各抗体的重链及轻链利用knobs-into-hol es技术经由C出 而接合的二价的双特异性抗体、W及在一个抗体的重链或轻链的N末端经由接头而连结另 一个抗体的scFv的C末端、或在一个抗体的重链或轻链的C末端经由接头而连结另一个抗体 的scFv的N末端的四价的双特异性抗体(NaUire Biotech.、1997、Vol.l5、p. 159-163)等。
[0136] <本发明的双特异性抗体>
[0137] 在本说明书中，"与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体"是指具有对人化R2的结 合活性及对人化R4的结合活性的双特异性抗体，具体而言，本发明的双特异性抗体包含具 有W下的特征的双特异性抗体：
[0138] -种与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体，其包含：
[0139] 1)由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的重链可变 区、及由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的轻链可变区；W 及
[0140] 2)由序列号4的氨基酸序号491至609的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的重链可 变区、及由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的轻链可变 区。
[0141] 在本说明书中，"抗人化32抗体"是指与人化32结合的抗体，"抗人化34抗体"是指 与人TLR4结合的抗体。本发明的双特异性抗体只要具有抗人TLR2抗体及抗人TLR4抗体的各 个重链可变区及轻链可变区即可，例如可W具有任意的双特异性抗体的结构，该结构含有 抗人化R2抗体或具有对人化R2的结合活性的抗人化R2抗体片段、和抗人TLR4抗体或具有对 人化R4的结合活性的抗人TLR4抗体片段。作为运种结构，可列举例如:在一个抗体的重链可 变区及轻链可变区的N末端经由接头而分别连结另一个抗体的重链可变区及轻链可变区的 C末端的双特异性抗体(DVD-Ig)、利用knobs-into-holes技术将各抗体的重链及轻链经由 CH3而接合的双特异性抗体、W及在一个抗体的重链或轻链的N末端经由接头而连结另一个 抗体的scFv的C末端、或在一个抗体的重链或轻链的C末端经由接头而连结另一个抗体的 scFv的N末端的四价的双特异性抗体等。
[0142] 优选本发明的双特异性抗体为含有抗人化R2抗体及抗人化R4抗体片段、该抗人 化R2抗体为IgG抗体、且该抗人化R4抗体片段为scFv的四价的双特异性抗体。W下，将该结 构的四价的双特异性抗体也称为IgG(TLR2)-scFv(TLR4)。
[0143] 本发明的双特异性抗体为1旨6(化32)-3。。巾(化1?4)的情况下，作为抗人化32抗体的 恒定区，也可W选择任何亚类的恒定区（例如作为重链的Ig 丫 1、Ig 丫 2、Ig 丫 3或Ig 丫 4的恒 定区、作为轻链的I gA或IgK的恒定区），作为重链恒定区，优选人Ig 丫 1恒定区，作为轻链恒 定区，优选人IgK恒定区。
[0144] 作为用作抗人化R2抗体的重链恒定区的人Ig 丫 1恒定区，可列举例如由序列号8的 氨基酸序号121至450构成的氨基酸序列。
[0145] 使用人Ig 丫 1恒定区作为抗人化R2抗体的重链恒定区的情况下，为了使抗体的抗 体依赖细胞毒性或补体依赖细胞毒性降低，也可W使用导入有L234A(基于Kabat等人的抓 索引的氨基酸234位的亮氨酸被丙氨酸取代KL235A(基于Kabat等人的抓索引的氨基酸235 位的亮氨酸被丙氨酸取代）等的氨基酸突变的人Ig 丫 1恒定区（Mol. Immunol.、1992、 Vo 1.29、No. 5、p . 633-639)。另外，从体内动态的观点出发，为了使抗体从血液中迅速地消 失，也可W使用导入有I253A(基于Kabat等人的抓索引的氨基酸253位的异亮氨酸被丙氨酸 取代)等的氨基酸突变的人Ig 丫 1恒定区（J. Immunol.、1997、Vol. 158、p. 2211-2217)。关于 与本说明书中所使用的抗体的恒定区中的氨基酸突变导入有关的残基编号，基于EU索引 (Rabat等、1991、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed.、United States Public Health Service、National Institute of Health、Bethesda)。
[0146] 优选抗人化R2抗体的重链恒定区为具有L234A及L235A的氨基酸突变的人Ig 丫 1恒 定区或具有L234A、L235A、及I253A的氨基酸突变的人Ig 丫 1恒定区。更优选抗人化R2抗体的 重链恒定区为具有L234A、L235A、及I253A的氨基酸突变的人Ig 丫 1恒定区，作为运种人Ig 丫 1恒定区，可列举例如由序列号4的氨基酸序号121至450构成的氨基酸序列。
[0147] 作为用作抗人化R2抗体的轻链恒定区的人IgK恒定区，可列举例如由序列号6的氨 基酸序号114至219构成的氨基酸序列。
[0148] 优选抗人化R2抗体为含有作为人Ig 丫 1恒定区的重链恒定区及作为人IgK恒定区 的轻链恒定区的抗人化32抗体，更优选该人Ig 丫 1恒定区为具有L234A、L235A、及I253A的氨 基酸突变的人Ig 丫 1恒定区。
[0149] 例如作为抗人化R2抗体，可列举含有由序列号4的氨基酸序号1至450的氨基酸序 列构成的重链、及由序列号6的氨基酸序列构成的轻链的抗人TLR2抗体。
[0150] 本发明的双特异性抗体为1旨6(化32)-3。。乂(化1?4)的情况下，抗人化1?4抗体片段可 W为具有在重链可变区的C末端经由接头连结轻链可变区的N末端的结构（重链可变区-接 头-轻链可变区）的scFv、及具有在轻链可变区的C末端经由接头连结重链可变区的N末端的 结构(轻链可变区-接头-重链可变区）的scFv的任一种，优选为具有重链可变区-接头-轻链 可变区的结构的scFvdScFv中的"接头"为连结重链可变区和轻链可变区的任意的长度的肤 (肤接头），优选为具有至少5个、更优选至少10个、进一步优选15~50个的氨基酸的肤。作为 优选的肤接头，为含有氨基酸序列GlyGlyGlyGlySer(也表示为(Gly)4Ser)的肤接头(本说 明书中称为"GS接头"），优选含有多个、更优选3~5个(Gly)4Ser。
[0151] 例如，作为抗人化R4抗体片段，可列举作为由序列号4的氨基酸序号491至732的氨 基酸序列构成的S cFv的抗人TLR4抗体片段。
[0152] 在1个实施方式中，作为IgG(化R2)-scFv(TLR4)即本发明的双特异性抗体，为抗人 化R2抗体含有由序列号4的氨基酸序号1至450的氨基酸序列构成的重链及由序列号6的氨 基酸序列构成的轻链、抗人化R4抗体片段为由序列号4的氨基酸序号491至732的氨基酸序 列构成的S cFv的双特异性抗体。
[0153] 优选在IgG(化R2)-scFv(TLR4)即本发明的双特异性抗体中，在抗人化R2抗体的各 重链的C末端经由接头连结抗人化R4抗体片段的N末端。将运种双特异性抗体的结构示于图 1〇
[0154] 在抗人化R2抗体的各重链的C末端连结抗人化R4抗体片段的N末端的接头为连结 两者的任意的长度的肤(肤接头），优选为具有至少5个、更优选至少10个、进一步优选15~ 50个的氨基酸的肤。作为优选的肤接头，为GS接头，优选含有多个、更优选5~10个(Gly) 4Ser。作为运种接头，可列举由序列号9所示的氨基酸序列构成的肤接头。
[0巧5]在1个实施方式中，作为IgG(化R2)-scFv(TLR4)即本发明的双特异性抗体，为抗人 化R2抗体含有由序列号4的氨基酸序号1至450的氨基酸序列构成的重链及由序列号6的氨 基酸序列构成的轻链、抗人化R4抗体片段为由序列号4的氨基酸序号491至732的氨基酸序 列构成的scFv、且在该抗人化R2抗体的各重链的C末端经由接头连结该抗人化R4抗体片段 的N末端的双特异性抗体。将在抗人化R2抗体的重链的C末端经由接头连结抗人化R4抗体片 段的N末端的融合体也称为"抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体"。优选在该双特 异性抗体中，连结该抗人化R2抗体的重链和抗人化R4抗体片段的接头为GS接头，更优选该 GS接头由序列号9的氨基酸序列构成。作为运种本发明的双特异性抗体，可列举含有由序列 号4的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体、及由序列号6的氨 基酸序列构成的抗人TLR2抗体的轻链的双特异性抗体。
[0156] -般而言，已知在使抗体在细胞中表达的情况下，在翻译后抗体受到修饰。作为翻 译后修饰的实例，可列举:重链C末端的赖氨酸利用簇基肤酶的切断、重链及轻链N末端的谷 氨酷胺或谷氨酸通过焦谷氨酷化修饰为焦谷氨酸等，在各种抗体中，已知重链C末端的赖氨 酸缺失或重链N末端的谷氨酷胺的大部分被修饰为焦谷氨酸(Journal of Pharmaceutical Sciences、2008、Vol.97、p.2426-p2447)。
[0157] 在本发明的与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体中，也包含与人化R2及人化R4 结合的受到了翻译后修饰的双特异性抗体。例如，不仅包含具有全长重链的双特异性抗体， 而且也包含具有C末端的赖氨酸缺失的重链的双特异性抗体。另外，也包含N末端的谷氨酷 胺或谷氨酸通过焦谷氨酷化被修饰为焦谷氨酸的双特异性抗体。运种N末端的焦谷氨酷化 或C末端侧赖氨酸缺失引起的翻译后修饰对抗体的活性并不产生影响也是该领域中所公知 的（Analytical Biochemistry、Vol.：M8、2006、p.24-39)。
[0158] 在一个实施方式中，在本发明的与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体中也包含 W下记载的双特异性抗体。
[0159] 含有由序列号4的氨基酸序列构成、且序列号4的氨基酸序号1的谷氨酸被修饰为 焦谷氨酸的抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体、及由序列号6的氨基酸序列构成 的抗人TLR2抗体的轻链的、与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体。
[0160] 本发明也包含具有W下的特征的与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体。
[0161 ] -种与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体，其包含：
[0162] 1)含有由序列号4的氨基酸序号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨 基酸序号50至66的氨基酸序列构成的CDR2、及由序列号4的氨基酸序号99至109的氨基酸序 列构成的CDR3的抗人化R2抗体的重链可变区、W及含有由序列号6的氨基酸序号24至39的 氨基酸序列构成的CDR1、由序列号6的氨基酸序号55至61的氨基酸序列构成的CDR2、及由序 列号6的氨基酸序号94至102的氨基酸序列构成的CDR3的抗人TLR2抗体的轻链可变区；W及
[0163] 2)含有由序列号4的氨基酸序号521至525的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的 氨基酸序号540至556的氨基酸序列构成的CDR2、及由序列号4的氨基酸序号589至598的氨 基酸序列构成的CDR3的抗人化R4抗体的重链可变区、W及含有由序列号4的氨基酸序号648 至658的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基酸序号674至680的氨基酸序列构成的 CDR2、及由序列号4的氨基酸序号713至721的氨基酸序列构成的CDR3的抗人化R4抗体的轻 链可变区。
[0164] 作为评价本发明的双特异性抗体的活性的方法，可列举评价对人化R2和/或人 TLR4的结合活性或中和活性的方法。
[0165] 是否具有对人化R2或人化R4的结合活性可W使用该领域中公知的测定方法来确 认。作为运种测定方法，可列举例如表面等离子体共振（SPR)解析、酶联免疫吸附测定 化nzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)等方法。例如，关于对人化1?2的结合活性进 行SPR解析的情况下，可W使用Biacore T200(GE Healthcare)，该情况下，通过将人化32蛋 白质（R&D systems公司）固相化于传感器忍片的表面，将被验抗体添加于流路并解析被验 抗体和人TLR2蛋白质的解离常数化D)，由此可W评价被验抗体对人TLR2的结合活性。作为 具体的评价方法，可W使用例如后述实施例5中所记载的方法。作为其它的实例，关于对人 化R4的结合活性使用化ISA进行评价的情况下，将人化R4及MD2复合体（W下，称为人化R4/ MD2)蛋白质固定化于ELISA用板，向其中添加被验抗体而使其反应之后，使利用辣根过氧化 物酶化RP)等酶进行了标记的抗IgG抗体等二次抗体反应并清洗，之后使用检测其活性的试 剂(例如在HRP标记的情况下，3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB;M0S公司））等进行活性测定， 确定二次抗体的结合，由此可W评价被验抗体对于人化R4的结合活性。作为具体的评价方 法，例如可W使用后述实施例9中所记载的方法。
[0166] 抗体对人化R2的中和活性是指利用对人化R2的结合抑制经由人化R2而产生的任 意的生物活性的活性，可运些1个或多个生物活性为指标进行评价。例如，作为运种对 人化R2的中和活性，可列举抑制人单核系细胞THPl-xBlue细胞中的Pam2CSK4诱导性的AP产 生的活性，作为活性的具体的评价方法，例如可W使用后述实施例6中所记载的方法。
[0167] 对人化R4的中和活性是指利用对人化R4的结合抑制经由人化R4而产生的任意的 生物活性的活性，可运些1个或多个生物活性为指标进行评价。例如，作为运种对人 化R4的中和活性，可列举抑制人单核系细胞株即U937细胞中的LPS诱导性的IL-6产生的活 性。
[0168] 本发明的双特异性抗体具有对人化R2和人化R4的中和活性。具有对人化R2和人 化R4的中和活性是指具有对人化R2的中和活性和对人化R4的中和活性运两者。是否具有对 人化R2和人化R4的中和活性可W分别使用前述对人TLR2或人TLR4的中和活性的评价方法 进行评价，可W使用表达人化R2和人TLR4运两者的细胞来评价抑制人化R2和人化R4介导的 该细胞的1个或多个生物活性的活性。作为后者的评价方法的实例，可列举例如抑制表达人 化R2及人化R4的人末梢血单核细胞中作为败血症的致病菌的绿脈杆菌Pseudomonas aeruginosa PA0-1 (例如ATCC:BAA-47)诱导性TN化产生的活性。具有运种活性的抗体可W 判断为具有对人化R2和人化R4的中和活性的抗体。作为具体的评价方法，可W使用例如后 述实施例10中所记载的方法。
[0169] 本发明的与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体可W基于本说明书中所公开的 本发明的双特异性抗体中所含的抗人TLR2抗体的重链可变区及轻链可变区、W及抗人TLR4 抗体的重链可变区及轻链可变区的序列信息，并使用该领域中公知的方法由本领域技术人 员容易地制作。本发明的与人TLR2及人化R4结合的双特异性抗体没有特别限定，例如，可W 按照后述的<本发明的双特异性抗体的生产方法及利用该方法所生产的双特异性抗体> 中记载的方法来制造。
[0170] 本发明的与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体根据需要进一步精制之后，按照 常规方法进行制剂化，可w用于免疫炎症性疾病如败血症、急性肾损伤、慢性肾脏病、急性 呼吸窘迫综合征、硬皮病、急性膜腺炎、慢性闭塞性肺疾病等人化R2及人化R4参与病态形成 的疾病的预防或治疗。
[0171] <本发明的多核巧酸>
[0172] 本发明的多核巧酸包含:含有编码本发明的与人化R2及人化R4结合的双特异性抗 体中所含的抗人化R2抗体的重链可变区（由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构 成）的碱基序列的多核巧酸、含有编码该双特异性抗体中所含的抗人化R2抗体的轻链可变 区（由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成）的碱基序列的多核巧酸、含有编码 该双特异性抗体中所含的抗人化R4抗体的重链可变区（由序列号4的氨基酸序号491至609 的氨基酸序列构成）的碱基序列的多核巧酸、或含有编码该双特异性抗体中所含的抗人 化R4抗体的轻链可变区（由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成）的碱基序列 的多核巧酸。
[0173] 本发明的多核巧酸只要为含有编码本发明的与人化R2及人化R4结合的双特异性 抗体中所含的抗人化R2抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、或为含有编码该双特异 性抗体中所含的抗人化R2抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸、或为含有编码该双特 异性抗体中所含的抗人化R4抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、或为含有编码该双 特异性抗体中所含的抗人化R4抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸，就没有特别限 定。例如，作为含有编码该抗人化R2抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸，可列举含有 从序列号3的碱基序号1至360的碱基序列的多核巧酸，作为含有编码该抗人化R2抗体的轻 链可变区的碱基序列的多核巧酸，可列举含有从序列号5的碱基序号1至339的碱基序列的 多核巧酸，作为含有编码该抗人化R4抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸，可列举含 有从序列号3的碱基序号1471至1827的碱基序列的多核巧酸，作为含有编码该抗人化R4抗 体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸，可列举含有从序列号3的碱基序号1873至2196的 碱基序列的多核巧酸。
[0174] 作为优选的本发明的多核巧酸，可列举例如:含有编码本发明的双特异性抗体IgG (TLR2)-scFv (化R4)的碱基序列的多核巧酸，即含有编码抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体 scFv融合体的碱基序列的多核巧酸，在抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体中，在 由序列号4的氨基酸序号1至450的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的重链的C末端经由接 头而连结由序列号4的氨基酸序号491至732的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体片段的N末 端；W及含有编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的轻链的碱基序列的多核 巧酸。作为前述含有编码抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体的碱基序列的多核 巧酸，优选含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的该融合体的碱基序列的多核巧酸。
[0175] 在1个实施方式中，作为编码由序列号4的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体重链- 抗人TLR4抗体scFv融合体的多核巧酸，可列举由序列号3的碱基序列构成的多核巧酸，作为 由序列号6的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的轻链的多核巧酸，可列举由序列号5的碱基 序列构成的多核巧酸。
[0176] 本发明的多核巧酸可W基于其碱基序列，使用本领域中公知的方法由本领域技术 人员容易地制作。例如，可W利用本领域中公知的基因合成方法而合成。作为运种基因合成 方法，可W使用W090/07861中记载的抗体基因的合成方法等本领域技术人员所公知的各种 方法。另外，如果一旦取得本发明的多核巧酸，则通过在该多核巧酸的预定位点导入突变， 也可W取得本发明的其它多核巧酸。作为运种突变导入方法，可W使用位点特异性突变诱 发法（Current Protocols in Molecular Biology edi t.、1987 John Wi ley&Sons Section 8.1-8.5)等本领域技术人员所公知的各种方法。
[0177] <本发明的表达载体>
[0178] 本发明的表达载体包含W下表达载体，其包含:含有编码本发明的与人化R2及人 化R4结合的双特异性抗体中所含的抗人化R2抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、含 有编码该双特异性抗体中所含的抗人化R2抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸、含有 编码该双特异性抗体中所含的抗人化R4抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、和/或 含有编码该双特异性抗体中所含的抗人化R4抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸，其 为可W用于本发明的与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体的生产的载体。本领域中各种 格式的双特异性抗体及其生产方法为公知的，本发明的表达载体可W按照运些生产方法， 根据所表达的双特异性抗体的格式由本领域技术人员容易地构建。
[0179] 例如，作为用于生产IgG(化R2)-scFv(TLR4)即本发明的双特异性抗体的表达载 体，优选W下表达载体，其包含:含有编码该双特异性抗体中所含的抗人化R2抗体的重链可 变区、该双特异性抗体中所含的抗人化R4抗体的重链可变区、及该双特异性抗体中所含的 抗人TLR4抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸、和含有编码该双特异性抗体中所含的 抗人TLR2抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸的任一个或两者。
[0180] 更优选的是，用于生产IgG(TLR2)-scFv(化R4)即本发明的双特异性抗体的表达载 体为运样的表达载体，其包含:含有编码抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体的碱 基序列的多核巧酸、和含有编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的轻链的碱 基序列的多核巧酸的任一个或两者，其中在抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体 中，在由序列号4的氨基酸序号1至450的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的重链的C末端经 由接头而连结由序列号4的氨基酸序号491至732的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体片段的 N末端。
[0181] 用于生产IgG(化R2)-scFv(TLR4)即本发明的双特异性抗体的表达载体进一步优 选为运样的表达载体，其包含：含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体重 链-抗人化R4抗体scFv融合体的碱基序列的多核巧酸、和含有编码由序列号6的氨基酸序列 构成的抗人TLR2抗体的轻链的碱基序列的多核巧酸的任一个或两者。
[0182] 作为用于表达多核巧酸的表达载体，只要在真核细胞(例如动物细胞、昆虫细胞、 植物细胞、酵母)和/或原核细胞(例如大肠杆菌)的各种宿主细胞中表达含有编码本发明的 与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体中所含的抗人化R2抗体的重链可变区的碱基序列 的多核巧酸、含有编码该双特异性抗体中所含的抗人化R2抗体的轻链可变区的碱基序列的 多核巧酸、含有编码该双特异性抗体中所含的抗人TLR4抗体的重链可变区的碱基序列的多 核巧酸、和/或含有编码该双特异性抗体中所含的抗人化R4抗体的轻链可变区的碱基序列 的多核巧酸，并可W产生运些多肤，就没有特别限制，可使用例如质粒载体、病毒载体(例如 腺病毒、反转录病毒)等，优选可W使用祀E6.4或祀E12.4(Lonza公司）。另外，也可W通过在 AG-丫 1或AG-K(例如参照W0 94/20632)等预先具有人Ig恒定区基因的表达载体中导入可变 区基因片段而表达抗体基因。
[0183] 使用动物细胞、昆虫细胞或酵母作为宿主细胞的情况下，本发明的表达载体可W 含有起始密码子及终止密码子。而且该情况下，本发明的表达载体可W含有增强子序列、编 码本发明的双特异性抗体或其重链可变区或轻链可变区的基因的5'侧及3'侧的非翻译区 域、分泌信号序列、剪接接合部、聚腺巧酸化位点、或者可复制单元等。另一方面，使用大肠 杆菌作为宿主细胞的情况下，本发明的表达载体可W含有起始密码子、终止密码子、终止子 区域、及可复制单元。而且本发明的表达载体可W根据目的含有通常所使用的选择标记(例 如四环素抗性基因、氨节青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、二氨叶酸 还原酶基因）。
[0184] 本发明的表达载体可W含有能够与多核巧酸可操作地连接的启动子。作为用于用 动物细胞使本发明的多核巧酸表达的启动子，可列举例如：CMV、RSV、SV40等来自病毒的启 动子、肌动蛋白启动子、EF(elongation factorHa启动子、热激启动子等。宿主细胞为大肠 杆菌(例如大肠埃希氏菌属菌）的情况下，可列举例如：trp启动子、lac启动子、WL启动子、 tac启动子等。另外，作为酵母中的表达用启动子，可列举例如:GAL1启动子、GAL10启动子、 P册5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。
[0185] <本发明的进行了转化的宿主细胞>
[0186] 本发明的进行了转化的宿主细胞只要用本发明的表达载体进行转化，就没有特别 限定，例如，作为用于生产IgG(化R2)-ScFv(TLR4)即本发明的双特异性抗体的本发明的进 行了转化的宿主细胞，可列举用W下表达载体进行了转化的宿主细胞，该表达载体包含:含 有编码该双特异性抗体中所含的抗人化R2抗体的重链可变区、该双特异性抗体中所含的抗 人化R4抗体的重链可变区、及该双特异性抗体中所含的抗人化R4抗体的轻链可变区的碱基 序列的多核巧酸、和含有编码该双特异性抗体中所含的抗人化R2抗体的轻链可变区的碱基 序列的多核巧酸的任一个或两者。
[0187] IgG巧LR2)-scFv(TLR4)即本发明的进行了转化的宿主细胞包含选自由W下的(a) ~(d)构成的组中的、用本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞：
[0188] (a)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人 化R2抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至 609的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、和含有编码 由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的轻链可变区的碱基 序列的多核巧酸的表达载体、W及包含含有编码由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸 序列构成的抗人化R2抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的 宿主细胞；
[0189] (b)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人 化R2抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至 609的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、含有编码由 序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的轻链可变区的碱基序 列的多核巧酸、及含有编码由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗人化R2 抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0190] (C)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人 化R2抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至 609的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、及含有编码 由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的轻链可变区的碱基 序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞;W及
[0191] (d)用包含含有编码由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗人 TLR2抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0192] 在1个实施方式中，本发明的进行了转化的宿主细胞为选自由W下的（a)~(d)构 成的组中的、用本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞：
[0193] (a)用包含含有编码抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体的碱基序列的 多核巧酸的表达载体、和包含含有编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的轻 链的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞，其中在抗人化R2抗体重链- 抗人化R4抗体scFv融合体中，由序列号4的氨基酸序号1至450的氨基酸序列构成的抗人 化R2抗体的重链的C末端经由接头而连结由序列号4的氨基酸序号491至732的氨基酸序列 构成的抗人TLR4抗体片段的N末端；
[0194] (b)用包含含有编码抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体的碱基序列的 多核巧酸和含有编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的轻链的碱基序列的多 核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞，其中在抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv 融合体中，在由序列号4的氨基酸序号1至450的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的重链的C 末端经由接头而连结由序列号4的氨基酸序号491至732的氨基酸序列构成的抗人TLR4抗体 片段的N末端。
[01M] (C)用包含含有编码抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体的碱基序列的 多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞，其中在抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体 scFv融合体中，在由序列号4的氨基酸序号1至450的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的重 链的C末端经由接头而连结由序列号4的氨基酸序号491至732的氨基酸序列构成的抗人 TLR4抗体片段的N末端；W及
[0196] (d)用包含含有编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的轻链的碱基 序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0197] 在1个实施方式中，本发明的进行了转化的宿主细胞为选自由W下的（a)~(d)构 成的组中的、用本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞：
[0198] (a)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体重链-抗人化R4 抗体scFv融合体的碱基序列的多核巧酸的表达载体、和包含含有编码由序列号6的氨基酸 序列构成的抗人化R2抗体的轻链的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细 胞；
[0199] (b)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体重链-抗人化R4 抗体scFv融合体的碱基序列的多核巧酸和含有编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗人 TLR2抗体的轻链的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0200] (C)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体重链-抗人化R4 抗体scFv融合体的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞;W及
[0201] (d)用包含含有编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的轻链的碱基 序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0202] 作为IgG巧LR2)-scFv(TLR4)即本发明的进行了转化的宿主细胞，优选列举：用包 含含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体 的碱基序列的多核巧酸的表达载体、和包含含有编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗人 化R2抗体的轻链的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；W及用包含含 有编码由序列号4的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗体重链-抗人TLR4抗体scFv融合体的碱 基序列的多核巧酸和含有编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的轻链的碱基 序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0203] 生产本发明的IgG(化R2)-scFv(TLR4)的方法只要包括将本发明的进行了转化的 宿主细胞进行培养、并使IgG(TLR2)-scFv(化R4)表达的工序，就没有特别限定。作为该方法 中所使用的优选的宿主细胞，可列举上述的优选的本发明的进行了转化的宿主细胞。
[0204] 作为进行转化的宿主细胞，只要适合于所使用的表达载体、用该表达载体进行转 化从而能够表达抗体，就没有特别限定，例如可举出在本发明的技术领域中通常使用的天 然细胞或人工建立的细胞等各种细胞(例如，动物细胞(例如CH0-K1SV细胞）、昆虫细胞(例 如Sf9)、大肠杆菌(大肠埃希氏菌属菌等）、酵母(酵母属、毕赤酵母属等)等），优选可W使用 CH0-K1SV细胞、CH0-DG44细胞、293细胞、NS0细胞等培养细胞。
[0205] 转化宿主细胞的方法没有特别限定，例如可W使用憐酸巧法、电穿孔法等。
[0206] <生产本发明的双特异性抗体的方法及利用该方法所生产的双特异性抗体>
[0207] 生产本发明的与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体的方法只要包括对本发明 的进行了转化的宿主细胞进行培养、并使与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体表达的工 序，就没有特别限定。作为该方法中所使用的优选的宿主细胞，可列举上述的优选的本发明 的进行了转化的宿主细胞。
[0208] 在一个实施方式中，在生产IgG (化R2) -scFv (TLR4)即本发明的双特异性抗体的方 法中，包括运样的生产与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体的方法:该方法包括对选自 由W下的(a)~(C)构成的组中的宿主细胞进行培养，并使与人化R2及人TLR4结合的双特异 性抗体表达的工序。
[0209] (a)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人 化R2抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至 609的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、及含有编码 由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的轻链可变区的碱基 序列的多核巧酸的表达载体、和包含含有编码由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序 列构成的抗人化R2抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿 主细胞；
[0210] (b)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人 化R2抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至 609的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、含有编码由 序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的轻链可变区的碱基序 列的多核巧酸、及含有编码由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗人化R2 抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞;W及
[0211] (C)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人 化R2抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至 609的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的重链可变区的碱基序列的多核巧酸、及含有编码 由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的轻链可变区的碱基 序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、W及用包含含有编码由序列号6的氨 基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的轻链可变区的碱基序列的多核巧酸 的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0212] 在1个实施方式中，生产本发明的与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体的方法 包括运样的生产与人TLR2及人化R4结合的双特异性抗体的方法:该方法包括对选自由W下 的(a)~k)构成的组中的宿主细胞进行培养，并使与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体 表达的工序。
[0213] (a)用包含含有编码抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体的碱基序列的 多核巧酸的表达载体、和包含含有编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的轻 链的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞，其中在抗人化R2抗体重链- 抗人化R4抗体scFv融合体中，在由序列号4的氨基酸序号1至450的氨基酸序列构成的抗人 化R2抗体的重链的C末端经由接头而连结由序列号4的氨基酸序号491至732的氨基酸序列 构成的抗人TLR4抗体片段的N末端；
[0214] (b)用包含含有编码抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体的碱基序列的 多核巧酸和含有编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的轻链的碱基序列的多 核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞，其中在抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv 融合体中，在由序列号4的氨基酸序号1至450的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的重链的C 末端经由接头而连结由序列号4的氨基酸序号491至732的氨基酸序列构成的抗人TLR4抗体 片段的N末端；W及
[0215] (C)用包含含有编码抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体的碱基序列的 多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和用包含含有编码由序列号6的氨基酸序列 构成的抗人化R2抗体的轻链的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞，其 中在抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体中，在由序列号4的氨基酸序号1至450的 氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的重链的C末端经由接头而连结由序列号4的氨基酸序号 491至732的氨基酸序列构成的抗人TLR4抗体片段的N末端。
[0216] 在1个实施方式中，生产本发明的与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体的方法 包括运样的生产与人TLR2及人化R4结合的双特异性抗体的方法:该方法包括对选自由W下 的(a)~k)构成的组中的宿主细胞进行培养，并使与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体 表达的工序。
[0217] (a)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗体重链-抗人TLR4 抗体scFv融合体的碱基序列的多核巧酸的表达载体、和包含含有编码由序列号6的氨基酸 序列构成的抗人化R2抗体的轻链的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细 胞；
[0218] (b)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗体重链-抗人TLR4 抗体scFv融合体的碱基序列的多核巧酸和含有编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗人 TLR2抗体的轻链的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞;W及
[0219] (c)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗体重链-抗人TLR4 抗体scFv融合体的碱基序列的多核巧酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和用包含含有 编码由序列号6的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的轻链的碱基序列的多核巧酸的表达载 体进行了转化的宿主细胞。
[0220] 进行了转化的宿主细胞的培养可W利用公知方法来进行。培养条件例如溫度、培 养基的pH及培养时间可适当选择。宿主细胞为动物细胞的情况下，作为培养基，例如可W使 用含有约5~20% 的胎牛血清的MEM培养基（Science，1959，Vol. 130，No. 3373，p.432-7)、 DMEM 培养基（Virology ,1959, Vol. 8，p. 396)、RPMI 1640 培养基（J. Am. Med. Assoc. ,1967， Vol. 199，p. 519)、199 培养基化邱.Biol.Med. ,1950, Vol. 73，p. 1-8)等。培养基的抑优选为 约6~8,培养时，根据需要一边进行通气或揽拌，一边在通常约30~4(TC下进行约15~72小 时。宿主细胞为昆虫细胞的情况下，作为培养基，例如可W使用含有胎牛血清的Grace's培 养基(Proc.化11.4。日(1.5(31.1]54，1985，￥〇1.82,9.8404)等。培养基的抑优选为约5~8，培养 时，根据需要一边进行通气或揽拌，一边在通常约20~40°C下进行约15~100小时。宿主细 胞为大肠杆菌或酵母的情况下，作为培养基，例如含有营养源的液体培养基是适当的。营养 培养基优选含有进行了转化的宿主细胞的生长所必需的碳源、无机氮源或有机氮源。作为 碳源，例如可列举葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、薦糖等，作为无机氮源或有机氮源，例如可 列举锭盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、腺、酪蛋白、肉类提取物、大豆巧、马铃馨提取液等。 根据期望可W含有其它营养素(例如，无机盐(例如氯化巧、憐酸二氨钢、氯化儀）、维生素类 等）、抗生素(例如四环素、新霉素、氨节青霉素、卡那霉素等）。培养基的抑优选为约5~8。宿 主细胞为大肠杆菌的情况下，作为优选的培养基，例如可W使用LB培养基、M9培养基 (Mol.Clo.，Cold Spring 化rbor Laborato;ry，Vol.3，A2.2)等。培养时，根据需要一边进行 通气或揽拌，一边在通常约14~39°C下进行约3~24小时。宿主细胞为酵母的情况下，作为 培养基，例如可 W 使用Burkholder 基本培养基（Proc.化 tl. Acad. Sci.USA，1980, Vol. 77， P .4505)等。培养时，根据需要一边进行通气或揽拌，一边在通常约20~35°C下进行约14~ 144小时。通过如上所述的培养，可W使本发明的与人化R2和人化R4结合的双特异性抗体表 达。
[0221] 生产本发明的与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体的方法除了包括对如上所 述的进行了转化的宿主细胞进行培养、并使本发明的双特异性抗体表达的工序之外，还可 W进一步包括从该进行了转化的宿主细胞中回收(优选分离或精制)本发明的双特异性抗 体的工序。作为分离或精制方法，例如可列举:盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法，透 析、超滤、凝胶过滤等利用分子量差的方法，离子交换色谱或径基憐灰石色谱等利用电荷的 方法，亲和色谱法等利用特异亲和性的方法，反相高效液相色谱等利用疏水性差的方法，等 电点电泳等利用等电点差的方法等。优选的是，蓄积于培养上清液中的抗体可W利用各种 色谱法(例如使用了Protein A柱或Protein G柱的各种柱色谱法)进行精制。
[0222] <本发明的医药组合物>
[0223] 本发明的医药组合物包含含有本发明的与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体 及药学上可接受的赋形剂的医药组合物。本发明的医药组合物可W使用该领域中通常所用 的赋形剂（即，药剂用赋形剂或药剂用载体等)并通过通常所使用的方法来制备。作为运些 医药组合物的剂型的实例，例如可列举注射剂、点滴用剂等非经口剂，可W通过静脉内给 药、皮下给药等进行给药。在制剂时，可w在药学上所允许的范围内使用与运些剂型相应的 载体或添加剂等。
[0224] 本发明的医药组合物可W含有多种本发明的与人化R2及人化R4结合的双特异性 抗体。例如，含有没有经受翻译后修饰的抗体、W及通过该抗体的翻译后修饰而生成的抗体 的医药组合物也包含在本发明中。
[0225] 在1个实施方式中，含有与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体的本发明的医药 组合物也包含下述中记载的医药组合物。
[0226] 一种医药组合物，其包含下述与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体，该双特异 性抗体为含有1)由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的重链 可变区、及由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体的轻链可变 区、W及
[0227] 2)由序列号4的氨基酸序号491至609的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的重链可 变区、及由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人化R4抗体的轻链可变 区的、与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体、W及
[0228] 通过该双特异性抗体的翻译后修饰而生成的双特异性抗体。
[0229] 本发明的医药组合物也包含运样的医药组合物，其含有:重链C末端的赖氨酸缺失 的双特异性抗体、经受了 N末端翻译后修饰的双特异性抗体、重链C末端赖氨酸缺失且经受 了 N末端翻译后修饰的双特异性抗体、和/或具有重链C末端赖氨酸且没有经受N末端翻译后 修饰的双特异性抗体。
[0230] 在1个实施方式中，含有下述（1)和（2)的与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体 的医药组合物也包含在本发明中。
[0231] (1)含有由序列号4的氨基酸序列构成、氨基酸序号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸 的抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体、及由序列号6的氨基酸序列构成的抗人 TLR2抗体的轻链的、与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体。
[0232] (2)含有由序列号4的氨基酸序列构成的抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融 合体、及由序列号6的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗体的轻链的、与人TLR2及人TLR4结合的 双特异性抗体。
[0233] 进而，在1个实施方式中，含有与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体的本发明的 医药组合物也包含下述中记载的医药组合物。
[0234] 一种医药组合物，其包含与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体、及药学上可接 受的赋形剂，所述与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体含有由序列号4所示的氨基酸序 列构成的抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体及由序列号6所示的氨基酸序列构 成的抗人TLR2抗体的轻链。
[0235] 在上述制剂化时本发明的与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体的添加量根据 患者的症状程度或年龄、使用的制剂的剂型、或抗体的结合效价等而不同，例如可W使用 0.0 Olmg/kg ~lOOmg/kg左右。
[0236] 本发明的医药组合物可W作为人化R2及人化R4参与病态形成的免疫炎症性疾病 (例如败血症、急性肾损伤、慢性肾脏病、急性呼吸窘迫综合征、硬皮病、急性膜腺炎、慢性闭 塞性肺疾病等)的预防或治疗剂使用。
[0237] 本发明包括免疫炎症性疾病的预防或治疗用医药组合物，其含有本发明的与人 化R2及人TLR4结合的双特异性抗体。另外，本发明包括预防或治疗免疫炎症性疾病的方法， 包括施用治疗有效量的该双特异性抗体的工序。另外，本发明包括用于在免疫炎症性疾病 的预防或治疗中使用的本发明的双特异性抗体。此外，本发明包括本发明的双特异性抗体 在免疫炎症性疾病的预防或治疗用医药组合物制造中的用途。
[0238] <本发明的抗人TLR2抗体及含有其的医药组合物>
[0239] 本发明含有抗人化R2抗体或其抗原结合片段，其包含含有由序列号8的氨基酸序 号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号8的氨基酸序号50至66的氨基酸序列构成的 CDR2、及由序列号8的氨基酸序号99至109的氨基酸序列构成的CDR3的抗人化R2抗体的重链 可变区、W及含有由序列号6的氨基酸序号24至39的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号6的 氨基酸序号55至61的氨基酸序列构成的CDR2、及由序列号6的氨基酸序号94至102的氨基酸 序列构成的CDR3的抗人TLR2抗体的轻链可变区。
[0240] 另外，本发明也包含含有由序列号8的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的重 链可变区及由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人化R2抗 体或其抗原结合片段、W及通过该抗体或其抗原结合片段的翻译后修饰而生成的抗体或其 抗原结合片段。作为翻译后修饰的实例，可列举重链可变区N末端的焦谷氨酷化和/或重链C 末端的赖氨酸缺失。在本发明的抗人化R2抗体或其抗原结合片段中优选的重链恒定区及轻 链恒定区与关于上述的< 本发明的双特异性抗体> 中的抗人化R2抗体所记载的重链恒定 区及轻链恒定区相同。
[0241] 在一个实施方式中，本发明的抗人TLR2抗体为具有下述的特征的抗人TLR2抗体。
[0242] 含有由序列号8的氨基酸序号1至450的氨基酸序列构成的重链及由序列号6的氨 基酸序列构成的轻链的抗人TLR2抗体。
[0243] 进而，在一个实施方式中，本发明的抗人化R2抗体为具有下述的特征的抗人化R2 抗体。
[0244] 含有由序列号8的氨基酸序号1至449的氨基酸序列构成的重链及由序列号6的氨 基酸序列构成的轻链的抗人TLR2抗体。
[0245] 本发明的抗人化R2抗体或其抗原结合片段可W使用含有各自编码上述的本发明 的双特异性抗体中所含的抗人化R2抗体的重链可变区及轻链可变区的碱基序列的多核巧 酸，参照上述的 <本发明的表达载体 >、<本发明的进行了转化的宿主细胞 >及< 生产本 发明的双特异性抗体的方法及利用该方法所生产的双特异性抗体>的记载由本领域技术 人员容易地生产。
[0246] 本发明也包含含有本发明的抗人化R2抗体或其抗原结合片段、及药学上可接受的 赋形剂的医药组合物。本发明的医药组合物可W使用该领域中通常所用的赋形剂（即，药剂 用赋形剂或药剂用载体等)并通过通常所使用的方法来制备。作为运些医药组合物的剂型 的实例，例如可列举注射剂、点滴用剂等非经口剂，可W通过静脉内给药、皮下给药等进行 给药。在制剂时，可W在药学上所允许的范围内使用与运些剂型相应的赋形剂、载体、添加 剂等。
[0247] 本发明的医药组合物可W含有多种本发明的抗人化R2抗体或其抗原结合片段。例 如，含有没有经受翻译后修饰的抗体或其抗原结合片段、及通过该抗体或其抗原结合片段 的翻译后修饰而生成的抗体或其抗原结合片段的医药组合物也包含在本发明中。
[0248] 在1个实施方式中，含有抗人化R2抗体或其抗原结合片段的本发明的医药组合物 也包含下述中记载的医药组合物。
[0249] 包含含有由序列号8的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的重链可变区及由序 列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人化R2抗体或其抗原结合 片段、W及作为通过该抗体或其抗原结合片段的翻译后修饰而生成的抗体或其抗原结合片 段的抗人TLR2抗体或其抗原结合片段的医药组合物。
[0250] 在1个实施方式中，在含有抗人化R2抗体的本发明的医药组合物中，含有下述（1) 至(4)的与人TLR2结合的抗体的医药组合物也包含在本发明中。
[0251] (1)含有由序列号8的氨基酸序号1至449的氨基酸序列构成的重链及由序列号6所 示的氨基酸序列构成的轻链的抗人TLR2抗体。
[0252] (2)含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且氨基酸序号1的谷氨酸被修饰为焦谷 氨酸的重链及由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人TLR2抗体。
[0253] (3)含有由序列号8的氨基酸序号1至449的氨基酸序列构成且氨基酸序号1的谷氨 酸被修饰为焦谷氨酸的重链及由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人TLR2抗体。
[0254] (4)含有由序列号8所示的氨基酸序列构成的重链及由序列号6所示的氨基酸序列 构成的轻链的抗人TLR2抗体。
[0255] 进而，在一个实施方式中，在含有抗人化R2抗体的本发明的医药组合物中，下述的 含有与人TLR2结合的抗体的医药组合物也包含在本发明中。
[0256] 包含含有由序列号8的氨基酸序号1至450的氨基酸序列构成的重链及由序列号6 的氨基酸序列构成的轻链的抗人化R2抗体、含有由序列号8的氨基酸序号1至449的氨基酸 序列构成的重链及由序列号6的氨基酸序列构成的轻链的抗人化R2抗体、及药学上可接受 的赋形剂的医药组合物。
[0257] 在上述制剂化时，本发明的抗人TLR2抗体或其抗原结合片段的添加量根据患者的 症状程度或年龄、使用的制剂的剂型、或抗体的结合效价等而不同，例如可W使用O.OOlmg/ kg ~lOOmg/kg 左右。
[0258] 本发明的抗人化R2抗体或其抗原结合片段根据需要进一步进行精制之后，按照常 规方法进行制剂化，可W用于治疗败血症、癌等人TLR2参与病态形成的疾病。
[0259] <融合抗体及修饰抗体>
[0260] 如果是本领域技术人员，则也可W使用该领域中公知的方法将与人化R2及人化R4 结合的双特异性抗体、抗人TLR2抗体或其抗原结合片段制作成融合有其它肤或蛋白质的融 合抗体，或制作成使之与修饰剂结合而成的修饰抗体。本发明的与人TLR2及人TLR4结合的 双特异性抗体、抗人化R2抗体或其抗原结合片段也包含运种融合体或修饰体的形态的抗体 或抗原结合片段。只要本发明的与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体作为融合抗体具有 对人TLR2及人TLR4的结合活性、或本发明的抗人TLR2抗体或其抗原结合片段作为融合抗体 具有对人化R2的结合活性，则用于融合的其它肤或蛋白质没有特别限定，例如，可列举:人 血清白蛋白、各种标记肤、人工螺旋基序肤、麦芽糖结合蛋白质、谷脫甘肤S转移酶、各种毒 素、能够促进多聚化的其它肤或蛋白质等。只要本发明的与人TLR2及人TLR4结合的双特异 性抗体作为融合抗体具有对人化R2及人化R4的结合活性、或本发明的抗人化R2抗体或其抗 原结合片段作为修饰抗体具有对人化R2的结合活性，则用于修饰的修饰剂没有特别限定， 可列举例如聚乙二醇、糖链、憐脂、脂质体、低分子化合物等。
[0261] 为了对本发明进一步进行理解在此提供参考的特定实施例，但是它们作为例示性 目的，而并不限定本发明。
[0262] 实施例
[0263] 关于使用了市售试剂盒或试剂等的部分，如果没有特殊说明，则按照随附的实验 方案进行实验。另外，为了方便，将浓度mol/L表示为M。例如，1M氨氧化钢水溶液是指Imol/L 的氨氧化钢水溶液。（实施例1:产生抗人TLR2抗体的杂种瘤的制作）
[0264] 使用人单克隆抗体开发技术 "Veloclmmune" (Velocimmune antibody technology; Regeneron公司（美国专利6596541号））小鼠制作抗人化R2抗体。与引起免疫反 应的佐剂一起，用人化32蛋白质（R&D systems公司、2616-TR-050)免疫Velocimmune小鼠。 按照常规方法摘出免疫后的小鼠的脾脏或淋己节等并收集淋己细胞，将其与小鼠骨髓瘤细 胞SP2/0(ATCC:邸L-1581)进行细胞融合而制作杂种瘤。进行单克隆化，在作为无血清培养 基的CD杂种瘤培养基（ク^フテ夕7 口公一乂社）中进行培养。由得到的培养上清液使用 Protein G柱(GE~瓜乂少7社）将抗体进行精制。在Velocimmune技术中，使用了内源性的 免疫球蛋白重链及轻链的可变区被对应的人可变区取代的转基因小鼠，因此，得到的抗体 为具有人抗体的可变区和小鼠抗体的恒定区的抗体(也称为嵌合抗体）。
[0265] (实施例2:抗人TLR2抗体的中和活性评价）
[0266] 为了评价实施例1中确定的抗人化R2抗体的中和活性，使用内源性表达人化R2的 人单核系细胞THPl-xBlue细胞，检测对化R2/6激动剂Pam2CSK4诱导碱性憐酸酶(AP)产生的 抑制。
[0267] 其结果可知:命名为31-5F5-2F3的抗人化R2抗体(嵌合抗体)抑制了 AP产生，具有 对人TLR2的中和活性。
[0268] (实施例3:抗人TLR2抗体的序列确定及突变体制作）
[0269] 由产生抗人化R2抗体31-5巧-2F3的杂种瘤解析编码抗体的重链及轻链的基因的 序列，进行序列确定。
[0270] 抗体的序列确定后，为了提高抗体的物性及稳定性，将31-5F5-2F3的重链及轻链 的FR替换为其它人抗体的FR，制作抗人TLR2抗体31-5巧-2F3 .ml。
[0271] (实施例4:完全人型抗人TLR2抗体的制作）
[0272] 实施例3中制作的抗体为可变区源自人、恒定区源自小鼠的抗体。因此，使用哺乳 细胞表达用载体GS载体化onza公司）构建含有重链及轻链的两基因的表达载体，制作完全 人型抗体。具体而言，在31-5F5-2F3.ml的抗体的重链可变区基因的5'侧连接编码信号序列 (化gel 怖ittle等、Protein Enginee;ring、1987、Vol. l、No.6、p.499-505.)的基因，而且在 3'侧连接人Ig 丫 1恒定区基因（由序列号7的碱基编号361至1350的碱基序列构成），将该重 链基因插入于GS载体pEE6.4。另外，在轻链可变区基因的5'侧连接编码信号序列（Nigel Whittle等、前述）的基因，而且在3'侧连接人K链的恒定区基因（由序列号5的碱基编号340 至657的碱基序列构成），将该轻链基因插入于GS载体祀E12.4。
[0273] 用测序仪分析插入于pEE6.4的抗体的重链基因序列、插入于PEE12.4的抗体的轻 链基因序列，由该结果得到的氨基酸序列，参照Kabat等的数据库（"Sequences of Proteins of Immunological Interest''、US Department of Health and Human Services'US Government Printing Office)确定CDR序列。
[0274] 将制作的31-5F5-2F3.ml的完全人型抗体(完全人型31-5F5-2F3.ml)的重链的碱 基序列示于序列号7,将由此所编码的氨基酸序列示于序列号8,将该抗体的轻链的碱基序 列示于序列号5,将由此所编码的氨基酸序列示于序列号6。
[0275] 序列号8所示的重链的可变区由序列号8的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成， 重链的CDR1、CDR2、CDR3分别由序列号8的氨基酸序号31至35、50至66、99至109的氨基酸序 列构成。序列号6所示的轻链的可变区由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成， 轻链的CDR1、CDR2、CDR3分别由序列号6的氨基酸序号24至39、55至61、94至102的氨基酸序 列构成。
[0276] 使用分别插入有抗体的重链和轻链的基因的上述的GS载体，用瞬时表达及永久表 达运两种方法进行抗体表达。关于瞬时表达，对于在化eeSt^e 293Expression medium(弓 斗フテ夕7 口公一乂社）中W约100万cells/mL培养的Freestyle 293细胞（弓^フテ夕7 口公一乂社），使用基因导入试剂293Fectin(^ 斗フテ夕7 口公一乂社)将上述的重链及轻 链的两表达载体转染，培养7天。或者，对于在Expi293Expression medium(^ ^フテ夕7 口 公一乂社）中W约300万ce 11 s/mL培养的E邱i293细胞（弓^ 7テ夕7 口公一乂社），使用基 因导入试剂E邱iFectamine293(ク^フテ夕7口ッ一乂社）将上述的重链及轻链的两表达 载体转染，培养7天。或者，对于在CD-C册medium(ク^フテ夕7 口公一乂社）中W约1000万 cells/mL培养的C册-K1SV细胞化onza公司），使用电穿孔法将上述的重链及轻链的两表达 载体转染，培养7天。将培养上清液使用Protein A或Protein G柱（均为GE~瓜乂少7社)进 行精制，得到完全人型抗体的精制抗体。关于永久表达，将分别插入有抗体的重链和轻链的 基因的上述的GS载体用Notl和Pvul进行限制酶切断，使用连接用试剂盒Ligation- Convenience Kit(NIPP0NGE肥公司）或连接试剂Ligation-higMTOYOBO公司）进行连接，构 建插入有重链和轻链的两基因的GS载体。该表达载体编码全长的重链及轻链和谷氨酷胺合 成酶，通过对C册-K1SV细胞的转染使抗体表达。将培养上清液用Protein A柱或Protein G 柱进行精制，得到完全人型抗体的精制抗体。（实施例5:完全人型抗人化R2抗体的结合活性 评价）
[0277] 为了评价实施例4中制作的完全人型31-5巧-2F3.ml对人化R2的结合活性，实施 SPR分析。
[027引在sra分析中，使用Biacore T200(GE~瓜乂少7社）。使用His Capture Kit(GE~ 瓜乂少7社、28-9950-56)和Amine Coupling Kit(GE~瓜乂少7社、BR-1000-50)将Anti- His IgG化is CapUire Kit附属）固定于CM5传感器忍片（GE~瓜乂少7社、BR-1005-30)。将 流路No. 1作为参照，在该流路上不结合人化R2蛋白质，分别在其它流路(No. 2、No. 3、No .4) 上W流速化L/分钟添加用皿S-EP+buffer(GE~瓜乂少7社、BR-1006-69)稀释为0.66iig/mL 的人化R2蛋白质(R&Dsystems公司、2616-TR-050)2分钟，并使其固相化。其后，W流速50化/ 分钟添加将完全人型31-5F5-2F3.ml用皿S-EP+buffer稀释为200nM的溶液2分钟，测定完全 人型抗体和人化R2的结合。接着，W流速50化/分钟添加皿S-EP+buff er 5分钟，测定完全人 型抗体和人化R2的解离。用Fit local分析二价分析物模型、Rmax，算出结合速度常数化a) 及解离速度常数化d)，用kd除Wka，由此算出结合解离常数化D)。
[02巧]其结果可知:邸为88.5pM，完全人型31-5F5-2F3.ml具有对人TLR2的结合活性。
[0280] (实施例6:完全人型抗人TLR2抗体的中和活性评价）
[0281] 为了评价实施例4中制作的完全人型31-5巧-2F3.ml对人化R2的中和活性，使用 THPl-xBlue细胞实施Pam2CSK4诱导AP产生抑制检测。W在96孔板（贝克顿-迪金森公司）上 W75化/孔在RPMI1640培养基（弓斗フテ夕7 口公一乂社）下接种THPl-xBlue细胞 (Invivogen公司、thpx-sp)使之成为5X 104cells/孔。细胞接种后立即添加25化的在855nM ~2.19pM的范围内用RPMI1640培养基稀释了9级的完全人型31-5巧-2F3 .ml，并在37°C、5% C〇2条件下培养30分钟。进而，添加25化用RPMI1640培养基稀释的化m2CSK4(Invivogen公 司、tlrl-pm2s;最终浓度lOOng/mL)。作为对照，准备取代抗体而添加有RPMI1640培养基的 孔，准备取代化m2CSK4而添加有RPMI1640培养基的孔。在37 °C、5 %C〇2条件下培养一夜之 后，回收培养上清液，使用市售的Quanti-Blue(Invivogen公司）测定培养上清液中所含的 AP浓度。进一步算出抗体对于Pam2CSK4诱导AP产生的IC50值。在计算IC50值时，将取代抗体 而添加有RPMI1640培养基的孔设为0 %抑制对照，将取代Pam2CSK4而添加有RPMI1640培养 基的孔作为100%抑制对照设定。通过4参数logistic曲线拟合来计算IC50值。
[0282] 其结果，完全人型31-5巧-2F3 .ml抑制AP产生，I巧0值为97.7pM。可知：完全人型 31-5F5-2F3. ml具有对人TLR2的中和活性。
[0283] (实施例7:完全人型抗人TLR2抗体的中和活性评价(2))
[0284] 为了评价实施例4中制作的完全人型31-5巧-2F3.ml对人化R2的中和活性，使用 THPl-xBlue细胞实施Pam2CSK4诱导AP产生抑制检测。作为比较抗体，使用作为抗人化R2抗 体的T2.5(专利文献1)及0PN305(专利文献3)。
[0285] 对于完全人型31-5F5-2F3.ml(在855nM~2.19pM的范围内WRPMI1640培养基稀释 9级）、T2.5(在83：3nM~2.13pM的范围内WRPMI1640培养基稀释9级）、W及0PN305(在861nM ~2.20pM的范围内WRPMI1640培养基稀释9级）的巧巾抗体实施与实施例6同样的实验，并通 过4参logistic曲线拟合算出IC50值。
[02化]其结果，完全人型31-5F5-2F3.ml完全抑制Pam2CSK4诱导引起的AP产生，I巧0值为 130pM。另一方面，T2.5及0PN305的Pam2CSK4诱导引起的AP产生抑制为部分的（图2)。
[0287] (实施例8:与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体的制作）
[0288] 制作含有抗人化R2抗体(IgG抗体)和抗人化R4抗体单链可变区片段(scFv)的两种 抗人化R2及抗人化R4双特异性抗体。本实施例中制作的双特异性抗体为上述的IgG(化R2)- scFv(TLR4)型的双特异性抗体，具有在抗人化R2抗体的各重链的C末端经由接头连结抗人 TLR4抗体scFv的N末端的结构（图1)。
[0289] 使用PCR法在实施例4中制作的完全人型31-5巧-2F3.ml的重链基因的3'末端连结 编码GS接头(序列号9)的基因，进而使用PCR法在编码该GS接头的基因的3'末端连结编码抗 人化34抗体scFv的基因，制作将完全人型31-5F5-2F3.ml的重链的C末端和抗人化34抗体 scFv的N末端用该GS接头连结的、编码抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体的基 因。该基因所编码的该融合体中所含的抗人化R4抗体scFv由序列号4的氨基酸序号491至 732的氨基酸序列构成，具有在由序列号4的氨基酸序号491至609的氨基酸序列构成的重链 可变区的C末端经由GS接头(序列号10)连结由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序 列构成的轻链可变区的N末端的结构。将制作的抗人TLR2抗体重链-抗人TLR4抗体scFv融合 体称为ICU-1-Ig 丫 1重链。在ICU-1-Ig 丫 1重链基因的5'侧连接编码信号序列（Nigel Whittle等、前述)的基因，并插入于祀E6.4载体。
[0巧0] 另外，制作在ICU-1-Ig 丫 1重链的人Ig 丫 1重链恒定区导入有L2%A、L235A、及 I253A的氨基酸突变的改变型的ICU-1-Ig 丫 1重链(称为ICU-1-Ig 丫 1-LAsh重链)的基因，将 该基因插入于祀E6.4载体。
[0巧1] 将插入有ICU-1-Ig 丫 1重链基因或ICU-1-Ig 丫 1-LAsh重链基因的祀E6.4载体和实 施例4中制作的插入有完全人型31-5巧-2F3.ml的轻链基因的祀E12.4组合，使用与实施例4 中记载的抗体的表达及精制法同样的方法，制作两种与人化R2及人化R4结合的双特异性抗 体。
[0292] 将含有ICU-1-Ig 丫 1重链和完全人型31-5F5-2F3.ml的轻链的双特异性抗体称为 完全人型ICU-1-Ig 丫 1，将含有ICU-1-Ig 丫 1-LAsh重链和完全人型31-5巧-2F3 .ml的轻链的 双特异性抗体称为完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh。
[029；3]将完全人型ICU-1-Ig 丫 1的ICU-1-Ig 丫 1重链的碱基序列示于序列号1，将由此所 编码的氨基酸序列示于序列号2。将完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh的ICU-1-Ig 丫 1-LAsh重链 的碱基序列示于序列号3,将由此所编码的氨基酸序列示于序列号4。
[0294]序列号2所示的抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体中所含的抗人化R2 抗体重链由序列号2的氨基酸序号1至450的氨基酸序列构成。
[0巧日]序列号4所示的抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体中所含的抗人化R2 抗体重链由序列号4的氨基酸序号1至450的氨基酸序列构成。
[0296] 序列号2及序列号4所示的所述两个抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体 中所含的抗人化R2抗体重链的可变区是共通的，由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸 序列构成，该重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别由序列号4的氨基酸序号31至35、50至66、 99至109的氨基酸序列构成。
[0297] 序列号2及序列号4所示的所述两个抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体 中所含的抗人化R4抗体scFv是共通的，由序列号4的氨基酸序号491至732的氨基酸序列构 成，构成该抗人化R4抗体scFv的抗人化R4抗体的重链可变区由序列号4的氨基酸序号491至 609的氨基酸序列构成，该重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别由序列号4的氨基酸序号521 至525、540至556、589至598的氨基酸序列构成。构成该抗人化R4抗体scFv的抗人化R4抗体 的轻链可变区由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成，该轻链可变区的CDR1、 CDR2、CDR3分别由序列号4的氨基酸序号648至658、674至680、713至721的氨基酸序列构成。
[0298] 完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh的轻链的碱基序列是共通 的，将该碱基序列示于序列号5,将由此所编码的氨基酸序列示于序列号6。序列号6所示的 抗人化R2抗体轻链的可变区由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成，该轻链可 变区的CDR1、CDR2、CDR3分别由序列号6的氨基酸序号24至39、55至61、94至102的氨基酸序 列构成。
[0299] (实施例9:与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体的结合活性评价）
[0300] 为了评价实施例8中制作的两种双特异性抗体对人化R2及人化R4的各自的结合活 性，使用人化R2蛋白质及人化R4/MD2蛋白质进行化ISA。在透明的MAXIS0RP384孔板(哥一子 フ々/シ中一哥斗工シテ^フ々/夕社）中W15化/孔添加用PBS(^ 斗フテ夕7 口公一乂社、 10010-023)稀释为lOiig/mL的浓度的人化32蛋白质（R&D systems公司、2616-TR-050)，在室 溫下固相化1小时。同样地，W15化/孔添加 lOiig/mL的浓度的人I'LRA/MDS蛋白质（R&D systems公司、3146-TM/CF)，在室溫下固相化1小时。在1小时后用清洗液(含0.05%Tween- 20的Tris缓冲生理食盐水(TBS))清洗孔3次，W10化L/孔添加 Blocking化e(十力弓^テ乂 夕社、03953-95)，在室溫下进行封闭1小时。再次用清洗液清洗3次，分别对固相化有人化R2 蛋白质的孔、固相化有人化R4/MD2蛋白质的孔W15化/孔添加实施例8中制作的两种双特异 性抗体。使用等量混合有PBS及Blocking One的反应缓冲液进行运些抗体的稀释，从75. OnM 至4.47fM稀释13级。在室溫下静置1小时后，用清洗液进行清洗3次。W15化/孔添加用反应 缓冲液将人IgG重链轻链交叉吸附抗体化uman IgG-heavy and light chain cross- adsorbed Antibody) (BETHYL 公司、 A80-219P) 稀释 4000 倍而成的液体 ，在室溫下静置 1 小 时。用清洗液清洗3次，W 15化/孔添加 TMB PEROXIDASE SUBSTRATE化ISA(M0SS公司、# TMBE-500)。15分钟后在固相化有人化R2蛋白质的孔中W15化/孔添加1M硫酸（和光纯药工 业公司、198-09595)而停止反应。5分钟后在固相化有人化R4/MD2蛋白质的孔中W15化/孔 添加1M硫酸而停止反应。用Safire2(TECAN公司）测定450皿处的吸光度，分别算出相对于人 化R2蛋白质及人化R4/MD2蛋白质的各抗体的EC50值。在计算EC50值时，由纵轴W测定值描 绘、横轴W抗体浓度值描绘的图表上的Sigmoid曲线的形状，将随着浓度的上升可W判断为 测定值达到收敛值的各抗体的测定值的最大值设定为100%，将随着抗体浓度的下降可W 判断为测定值达到收敛值的各抗体的测定值的最小值设定为0%。将通过4参数logistic曲 线拟合算出的EC50值示于W下(表1、表2)。
[0301] 表1:相对于人TLR2蛋白质的结合活性
[0302] [表1]
[0303] _
[0304]表2:相对于人TLR4/MD2蛋白质的结合活性
[0305][表 2] 「nwAl
[0307] ~其结果可知：完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh与人化32蛋白' 质及人TLR4/MD2蛋白质运两者结合。
[0308] (实施例10:与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体的正常人末梢血单核细胞绿 脈杆菌死菌诱导TN阳产生抑制检测）
[0309] 为了评价实施例8中制作的双特异性抗体的中和活性，使用内源性表达人化R2及 人化R4/MD2的人末梢血单核细胞实施绿脈杆菌死菌诱导TWa产生抑制检测。已知的是，绿 脈杆菌Pseudomonas aeruginosa为败血症的致病菌的一个，刺激人末梢血单核细胞上的 TLR2和TLR4并产生TN阳（Scand.J. Immunol.、2008、V〇1.67、No.2、p. 193-203)。
[0310] 在384孔板シ夕社）中使用含有适当制备成终浓度10~30%的人血清化onza公 司、14-490E)的RPMI1640培养基（弓^ 7テ夕7 口公一乂社）W30化/孔接种正常人末梢血 单核细胞化onza公司、CC-2702)使之成为1.875X 104cells/孔。其后立即添加在375nM~ 7.680fM的范围内用RPMI1640培养基稀释12级的精制抗体完全人型ICU-1-Ig 丫 1或在5(K)nM ~10.24fM的范围内用RPMI1640培养基稀释13级的完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh 10化，并在 37°C、5%C02条件下培养30分钟。进而，将临床分离株的绿脈杆菌Pseudomonas aeruginosa PAO-1的加热处理死菌用RPMI1640培养基进行稀释，W终浓度成为1X106C即(菌落形成单 位)/mL的方式添加10化。作为对照，分别准备取代抗体而添加有RPMI1640培养基的孔、取代 绿脈杆菌死菌而添加有RPMI1640培养基的孔。在37 °C、5 % C〇2条件下培养一夜之后，回收培 养上清液，使用市售的A1地aLISA TN化试剂盒一年シ工瓜7-社、AL208C)测定培养上 清液中所含的TWa浓度。进一步算出各抗体对于绿脈杆菌死菌诱导TWa产生的IC50值。在 IC50值算出时，将取代抗体而添加有RPMI1640培养基的孔作为0%抑制对照、将取代绿脈杆 菌死菌而添加有RPMI1640培养基的孔作为100%抑制对照设定。将通过4参数logistic曲线 拟合算出的IC50值示于W下(表3)。
[0311] 表3:正常人末梢血单核细胞绿脈杆菌死菌诱导TNFa产生抑制活性
[0312] [表 3]
[0314] 由其结果可知：完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh抑制TN化产 生，具有对人TLR2及人TLR4的中和活性。
[0315] (实施例11:正常人末梢血单核细胞大肠杆菌死菌诱导TNFa产生抑制检测）
[0316] 在384孔板（スシ夕社）中使用含有适当制备成终浓度10%的人血清化onza公司、 14-490E)的RPMI1640培养基（ク^フテ夕7 口公一乂社）W30化/孔接种正常人末梢血单核 细胞化onza公司、CC-2702)使之成为lX104Cells/孔。其后立即添加在2.500咖至20.00fM 的范围内用RPMI1640培养基稀释12级的精制完全人型ICU-1-Ig 丫 1或完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh 1化L。另外，作为比较抗体，添加在7.75祉M至52.96fM的范围内用RPMI1640培养基 稀释13级的精制抗人化R4抗体化ll.C2E3(专利文献6)及抗人化R2抗体0PN305(专利文献3) 的混合溶液10化。其后，在37°C、5%C02条件下培养30分钟。进而，将临床分离株的大肠杆菌 Escherichia coli (21006)的加热处理死菌用RPMI1640培养基进行稀释，W终浓度成为1 X 106C即/mL的方式添加10化。作为对照，分别准备取代抗体而添加有RPMI1640培养基的孔、 取代大肠杆菌死菌而添加有RPMI1640培养基的孔。在37°C、5%C02条件下培养一夜之后，回 收培养上清液，使用市售的A1地aLISA TN化试剂盒一年シ工瓜7-社)测定培养上清液 中所含的TWa浓度。进一步算出各抗体对于大肠杆菌死菌诱导TWa产生的IC50值。在计算 IC50值时，将取代抗体而添加有RPMI1640培养基的孔作为0 %抑制对照、将取代大肠杆菌死 菌而添加有RPMI1640培养基的孔作为100%抑制对照设定。将通过4参数logistic曲线拟合 算出的IC50值示于W下(表4、图3)。
[0317] 表4:正常人末梢血单核细胞大肠杆菌死菌诱导TNFa产生抑制活性
[031 引[表4]
[0319]
[0320] 由其结果可知:完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh与化11.C沈3 及0PN305的并用相比，具有约10倍的效力(潜能）的TN阳产生抑制活性。
[0321] 工业实用性
[0322] 本发明的与人化R2及人化R4结合的双特异性抗体对参与人化R2及人化R4介导的 病态形成的各种疾病的预防或治疗是有用的。另外，本发明的多核巧酸、表达载体、进行了 转化的宿主细胞及生产双特异性抗体的方法对生产所述与人TLR2及人化R4结合的双特异 性抗体是有用的。
[0323] 序列表自由文本
[0324] 在W下的序列表的数字标题<223>中，记载"人工序列"的说明。具体而言，序列 表的序列号1表示的碱基序列为完全人型ICU-1-Ig 丫 1的抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体 scFv融合体的碱基序列，序列号2表示的氨基酸序列为由序列号1所编码的抗人化R2抗体重 链-抗人化R4抗体scFv融合体的氨基酸序列。序列表的序列号3表示的碱基序列为完全人型 ICU-1-Ig 丫 1-LAsh的抗人化R2抗体重链-抗人TLR4抗体scFv融合体的碱基序列，序列号4表 示的氨基酸序列为由序列号3所编码的抗人化R2抗体重链-抗人化R4抗体scFv融合体的氨 基酸序列。序列表的序列号5表不的碱基序列为完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh的抗人化R2抗体轻链、W及完全人型31-5F5-2F3.ml的轻链的碱基序列，序列号6 表示的氨基酸序列为由序列号5所编码的抗人化R2抗体轻链的氨基酸序列。序列表的序列 号7表不的碱基序列为完全人型31-5F5-2F3 .ml的重链的碱基序列，序列表的序列号8表不 的氨基酸序列为由序列号7所编码的重链的氨基酸序列。序列表的序列号9表不的氨基酸序 列为连结完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh中所含的抗人化32抗体的重 链恒定区的C末端和抗人化R4抗体scFv的N末端的GS接头的氨基酸序列。序列表的序列号10 表示的氨基酸序列为连结完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh中所含的抗 人TLR4抗体scFv中的重链可变区和轻链可变区的GS接头的氨基酸序列。
【主权项】
1. 一种与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体，其从以下的（1)或(2)中选择： (1) 一种与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体，包含： 1) 由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗体的重链可变区、 及由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗体的轻链可变区、以及 2) 由序列号4的氨基酸序号491至609的氨基酸序列构成的抗人TLR4抗体的重链可变 区、及由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人TLR4抗体的轻链可变区； 或 (2) 作为通过（1)的双特异性抗体的翻译后修饰而生成的双特异性抗体的与人TLR2及 人TLR4结合的双特异性抗体。2. 根据权利要求1所述的双特异性抗体，其从以下的（1)或(2)中选择： (1) 一种包含抗人TLR2抗体及抗人TLR4抗体片段的双特异性抗体， 该抗人TLR2抗体为IgG抗体，且包含由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成 的抗人TLR2抗体的重链可变区、及由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗 人TLR2抗体的轻链可变区， 该抗人TLR4抗体片段为单链可变区片段(scFv)，且包含由序列号4的氨基酸序号491至 609的氨基酸序列构成的抗人TLR4抗体的重链可变区、及由序列号4的氨基酸序号625至732 的氨基酸序列构成的抗人TLR4抗体的轻链可变区;或 (2) 作为通过（1)的双特异性抗体的翻译后修饰而生成的双特异性抗体的与人TLR2及 人TLR4结合的双特异性抗体。3. 根据权利要求2所述的双特异性抗体，该双特异性抗体含有抗人TLR2抗体及抗人 TLR4抗体片段， 该抗人TLR2抗体为IgG抗体，且包含由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成 的抗人TLR2抗体的重链可变区、及由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗 人TLR2抗体的轻链可变区， 该抗人TLR4抗体片段为scFv，且包含由序列号4的氨基酸序号491至609的氨基酸序列 构成的抗人TLR4抗体的重链可变区、及由序列号4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构 成的抗人TLR4抗体的轻链可变区。4. 根据权利要求2所述的双特异性抗体，其中，翻译后修饰为抗人TLR2抗体的重链可变 区氨基末端(N末端）的焦谷氨酰化、抗人TLR2抗体的重链羧基末端(C末端）的赖氨酸缺失、 和/或抗人TLR4抗体片段的重链可变区N末端的焦谷氨酰化。5. 根据权利要求2至4中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗人TLR2抗体包含作为人 Igyl恒定区的重链恒定区。6. 根据权利要求5所述的双特异性抗体，其中，人Igy 1恒定区为具有L234A及L235A的 氨基酸突变或L234A、L235A及I253A的氨基酸突变的人Ig γ 1恒定区。7. 根据权利要求2至4中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗人TLR2抗体包含作为人 IgK恒定区的轻链恒定区。8. 根据权利要求2至4中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗人TLR2抗体包含作为人 Igyl恒定区的重链恒定区及作为人IgK恒定区的轻链恒定区。9. 根据权利要求8所述的双特异性抗体，其中，人Igy 1恒定区为具有L234A及L235A的 氨基酸突变或L234A、L235A及I253A的氨基酸突变的人Ig γ 1恒定区。10. 根据权利要求2或3所述的双特异性抗体，其中，抗人TLR2抗体包含由序列号4的氨 基酸序号1至450的氨基酸序列构成的重链、及由序列号6的氨基酸序列构成的轻链。11. 根据权利要求2至10中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗人TLR4抗体片段为具 有在重链可变区的C末端经由接头连结轻链可变区的Ν末端的结构的scFv。12. 根据权利要求2至11中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗人TLR4抗体片段为由 序列号4的氨基酸序号491至732的氨基酸序列构成的scFv。13. 根据权利要求2或3所述的双特异性抗体，其中，抗人TLR2抗体包含由序列号4的氨 基酸序号1至450的氨基酸序列构成的重链、及由序列号6的氨基酸序列构成的轻链，抗人 TLR4抗体片段为由序列号4的氨基酸序号491至732的氨基酸序列构成的scFv。14. 根据权利要求2至13中任一项所述的双特异性抗体，其中，在抗人TLR2抗体的各重 链的C末端经由接头连结抗人TLR4抗体片段的N末端。15. 根据权利要求14所述的双特异性抗体，其中，连结抗人TLR2抗体的重链和抗人TLR4 抗体片段的接头由GS接头构成。16. 根据权利要求15所述的双特异性抗体，其中，GS接头由序列号9的氨基酸序列构成。17. 根据权利要求2或3所述的双特异性抗体，其中，抗人TLR2抗体包含由序列号4的氨 基酸序号1至450的氨基酸序列构成的重链、及由序列号6的氨基酸序列构成的轻链，抗人 TLR4抗体片段为由序列号4的氨基酸序号491至732的氨基酸序列构成的scFv，在该抗人 TLR2抗体的各重链的C末端经由接头连结该抗人TLR4抗体片段的N末端。18. 根据权利要求17所述的双特异性抗体，其中，连结抗人TLR2抗体的重链和抗人TLR4 抗体片段的接头由GS接头构成。19. 根据权利要求18所述的双特异性抗体，其中，GS接头由序列号9的氨基酸序列构成。20. -种双特异性抗体，其是通过权利要求17至19中任一项所述的双特异性抗体的翻 译后修饰而生成的。21. -种多核苷酸，其含有编码权利要求1所述的双特异性抗体的抗人TLR2抗体的重链 可变区、抗人TLR2抗体的轻链可变区、抗人TLR4抗体的重链可变区、和/或抗人TLR4抗体的 轻链可变区的碱基序列。22. -种多核苷酸，其含有编码在权利要求17至19中任一项所述的双特异性抗体的抗 人TLR2抗体的重链的C末端经由接头连结抗人TLR4抗体片段的N末端的融合体的碱基序列。23. 根据权利要求22所述的多核苷酸，其含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的所述 融合体的碱基序列。24. -种多核苷酸，其含有编码权利要求17至19中任一项所述的双特异性抗体的抗人 TLR2抗体的轻链的碱基序列。25. -种表达载体，其包含根据权利要求21所述的多核苷酸。26. -种表达载体，其包含根据权利要求22、23、和/或24所述的多核苷酸。27. -种用权利要求25所述的表达载体进行了转化的宿主细胞，其选自由以下的（a)至 (d)构成的组： (a)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗 体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至609的氨 基酸序列构成的抗人TLR4抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、及含有编码由序列号 4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人TLR4抗体的轻链可变区的碱基序列的多 核苷酸的表达载体、和包含含有编码由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的 抗人TLR2抗体的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞； (b) 用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗 体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至609的氨 基酸序列构成的抗人TLR4抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、含有编码由序列号4 的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人TLR4抗体的轻链可变区的碱基序列的多 核苷酸、及含有编码由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗体的 轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞； (c) 用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗 体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至609的氨 基酸序列构成的抗人TLR4抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、及含有编码由序列号 4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人TLR4抗体的轻链可变区的碱基序列的多 核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞;以及 (d) 用包含含有编码由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗 体的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。28. -种用权利要求25所述的表达载体进行了转化的宿主细胞，其选自由以下的（a)至 (d)构成的组： (a) 用含有权利要求22或23所述的多核苷酸的表达载体和含有权利要求24所述的多核 苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞； (b) 用含有权利要求22或23所述的多核苷酸和权利要求24所述的多核苷酸的表达载体 进行了转化的宿主细胞； (c) 用含有权利要求22或23所述的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及 (d) 用含有权利要求24所述的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。29. -种生产与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体的方法，包括：对选自由以下的 (a)至(c)构成的组中的宿主细胞进行培养，使与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体表达 的工序： (a) 用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗 体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至609的氨 基酸序列构成的抗人TLR4抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、及含有编码由序列号 4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人TLR4抗体的轻链可变区的碱基序列的多 核苷酸的表达载体、和包含含有编码由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的 抗人TLR2抗体的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞； (b) 用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗 体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至609的氨 基酸序列构成的抗人TLR4抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、含有编码由序列号4 的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人TLR4抗体的轻链可变区的碱基序列的多 核苷酸、及含有编码由序列号6的氨基酸序号1至113的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗体的 轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞;以及 (C)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序号1至120的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗 体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、含有编码由序列号4的氨基酸序号491至609的氨 基酸序列构成的抗人TLR4抗体的重链可变区的碱基序列的多核苷酸、及含有编码由序列号 4的氨基酸序号625至732的氨基酸序列构成的抗人TLR4抗体的轻链可变区的碱基序列的多 核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、以及用包含含有编码由序列号6的氨基酸序号1 至113的氨基酸序列构成的抗人TLR2抗体的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体 进行了转化的宿主细胞。30. -种生产抗与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体的方法，包括:对选自由以下的 (a)至(c)构成的组中的宿主细胞进行培养，使与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体表达 的工序： (a) 用含有权利要求22或23所述的多核苷酸的表达载体和含有权利要求24所述的多核 苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞； (b) 用含有权利要求22或23所述的多核苷酸和权利要求24所述的多核苷酸的表达载体 进行了转化的宿主细胞；以及 (c) 用含有权利要求22或23所述的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、以及 用含有权利要求24所述的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。31. -种与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体，其是通过权利要求29所述的方法生 产的。32. -种与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体，其是通过权利要求30所述的方法生 产的。33. -种医药组合物，其含有权利要求1至20、31及32中任一项所述的双特异性抗体及 药学上可接受的赋形剂。34. 根据权利要求33所述的医药组合物，其为免疫炎症性疾病的预防或治疗用医药组 合物。35. 根据权利要求34所述的医药组合物，其中，免疫炎症性疾病为败血症或急性胰腺 炎。36. -种预防或治疗免疫炎症性疾病的方法，包括施用治疗有效量的权利要求1至20、 31及32中任一项所述的双特异性抗体的工序。37. 根据权利要求36所述的预防或治疗的方法。其中，免疫炎症性疾病为败血症或急性 胰腺炎。38. 根据权利要求1至20、31及32中任一项所述的双特异性抗体，其用于在免疫炎症性 疾病的预防或治疗中使用。39. 根据权利要求38所述的双特异性抗体，其中，免疫炎症性疾病为败血症或急性胰腺 炎。40. 权利要求1至20、31及32中任一项所述的双特异性抗体在免疫炎症性疾病的预防或 治疗用医药组合物制造中的应用。41. 根据权利要求40所述的双特异性抗体的应用，其中，免疫炎症性疾病为败血症或急 性胰腺炎。42. -种与人TLR2及人TLR4结合的双特异性抗体，包含： 1) 含有由序列号4的氨基酸序号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基酸 序号50至66的氨基酸序列构成的CDR2、及由序列号4的氨基酸序号99至109的氨基酸序列构 成的CDR3的抗人TLR2抗体的重链可变区、以及含有由序列号6的氨基酸序号24至39的氨基 酸序列构成的CDR1、由序列号6的氨基酸序号55至61的氨基酸序列构成的CDR2、及由序列号 6的氨基酸序号94至102的氨基酸序列构成的CDR3的抗人TLR2抗体的轻链可变区；以及 2) 含有由序列号4的氨基酸序号521至525的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基 酸序号540至556的氨基酸序列构成的CDR2、及由序列号4的氨基酸序号589至598的氨基酸 序列构成的CDR3的抗人TLR4抗体的重链可变区、以及含有由序列号4的氨基酸序号648至 658的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基酸序号674至680的氨基酸序列构成的 CDR2、及由序列号4的氨基酸序号713至7 21的氨基酸序列构成的⑶R3的抗人TLR4抗体的轻 链可变区。
【文档编号】C12N1/15GK106062193SQ201580011160
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年2月27日 公开号201580011160.9, CN 106062193 A, CN 106062193A, CN 201580011160, CN-A-106062193, CN106062193 A, CN106062193A, CN201580011160, CN201580011160.9, PCT/2015/55860, PCT/JP/15/055860, PCT/JP/15/55860, PCT/JP/2015/055860, PCT/JP/2015/55860, PCT/JP15/055860, PCT/JP15/55860, PCT/JP15055860, PCT/JP1555860, PCT/JP2015/055860, PCT/JP2015/55860, PCT/JP2015055860, PCT/JP201555860
【发明人】竹内聪, 佐藤雅人, 铃木丈太郎, 曽我真司, 高崎淳, 青山康二, 奥山千枝
【申请人】安斯泰来制药株式会社