一种双特异性抗体her2xcd3的构建及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及免疫学的技术领域。具体地说，设及双特异性抗体的构建和制备方法。
【背景技术】
[0002] 双特异性抗体化ispecific antibody, BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的 人工抗体，能在祀细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。BiAb在 生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作用 杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相关 抗原和免疫效应细胞上的祀分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。W下 是针对所研究的免疫细胞抗原和肿瘤细胞抗原，W及相关技术发展的一些【背景技术】介绍。
[0003] 1.CD3
[0004] CD3分子由4个亚基组成；5、e、丫、C，其分子质量分别为18. 9kDa、23.IkDa、 20. 5kDa、18. 7kDa，其长度分别有171、207、182、164个氨基酸残基。它们一起组成6条肤链， 常与T细胞受体（Tcellrec巧tor，TCR)紧密结合形成含有8条肤链的TCR-CD3复合体，结 构示意图见图1。此复合体具有T细胞活化信号转导，稳定TCR结构的功能。CD3胞质段含免 疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)，TCR 识别并结合由MHC(majorhisto-compatibilitycomplex)分子提呈的抗原肤，导致CD3的 ITAM的保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p561ck磯酸化，然后可募集其 他含有甜2(Scrhomology2)结构域的酪氨酸蛋白激酶（如ZAP-70)。ITAM的磯酸化和与 ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分子 的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。
[0005] 2.肥R2
[0006] 1981 年化；Lh等（ShihC,化化yLC,MurrayM,etal."Transforminggenes ofcarcinomasandneuroblastomasintroducedintomousefibroblasts[J]. 化化re, 1981,290(5803) :261-264.)首次从大鼠神经母细胞瘤基因组中克隆出癌基因 neu，Slamon等（1987，Science2;35;177-182)从人cDNA文库中分离出肥R2 基因。随后 的序列分析和染色体谱分析发现neu和肥R2为同一个基因，习惯上称为肥R2/neu基因或 c-erbB-2基因。肥R2是人类表皮生长因子受体家族的第2个成员，该家族属于I型受体酪 氨酸激酶，又称化bB受体家族，其在许多正常和异常表皮细胞的生长、分化和转移过程中 起着重要的调控作用，许多肿瘤的发生、发展和病情轻重与其活性大小密切相关。家族内共 有四个受体；肥R1，肥R2,肥R3和肥R4。该些受体可W相互作用产生异源或同源二聚体，激 活细胞内多条信号转导通路，其中肥R2在细胞信号转导过程中起着重要作用。肥R2的结构 包括胞外生长因子的结合区，亲脂的跨膜区和带有调节駿基末端片段的胞内区。肥R2受体 胞内区有酪氨酸蛋白激酶PTK活性，自身也具有若干酪氨酸残基Tyr磯酸化位点。特异性 生长因子与HER2受体结合后可诱导二聚体化并激发受体的交叉磯酸化，磯酸化的受体可 W把细胞外的生长信号迅速转导至核内，刺激控制与细胞分裂有关的基因表达。
[0007] 肥R2定位于人染色体17q21，编码分子量为185kD的跨膜蛋白，具有酪氨酸激酶RTK活性，正常情况下处于非激活状态，参与细胞正常分化的调节，通常只在胎儿期表达， 成年后，仅在极少数正常组织内微量表达。正常细胞中肥R2基因为2个拷贝，基因突变 可将其激活，其扩增将导致转录上调，蛋白合成增加，从而抑制肿瘤细胞调亡，促进肿瘤细 胞增殖，上调血管内皮生长因子VEGF/血管通透性因子VPF，促进肿瘤新生血管生成，增加 肿瘤细胞侵袭力，破坏机体组织抗侵袭屏障等[ArtufelMV，ValeroAC，LladoRR，etal. MolecularProtocolforHer-2/neuanalysisinbreastcarcinoma[J].ClinTransl 化col, 2005, 7. (11) : 504-511.]。肥R2蛋白的过度表达也在细胞的分裂、增殖、转化、促进肿 瘤的转移、侵袭、粘附中发挥重要作用出ynes肥,StemDF.HiebiologyoferbB-2/neu/ 肥R-2anditsroleincancer[J].BiochemBio地ysActa, 1994, 1198(2-3):165-184.]。 [000引除可发生基因突变或扩增外，上调肥R2的表达也可激肥R2下游的两个主要信号 转导途径；MAPK通路，PI3K/Akt通路，从而引发瀑布式连锁反应，调节调亡相关基因，促进 细胞无限增殖分化，抑制调亡，从而发生癌变。前者主要参与细胞的有丝分裂，后者主要影 响细胞的存活和调亡。肥R2可通过MAPK途径活化Ets转录因子家族成员ER81而上调人 端粒末端转移酶逆转录酶hTERT，进而导致细胞端粒末端转移酶异常活化，使细胞转化并 进入永久增歹直状态[GoueliBS,JanknechtR.Upregulationofthecatalytictelomerase subunitbythetranscriptionfactorERSlandoncogenicHER2/Neu,Ras,orRaf.Mol CellBiol, 2004, 24:25-35. ]。PI3K活化后，可催化磯脂酷肌醇PI生成PIP2和PIP3,它们 是细胞内重要的第二信使，能激活下游的蛋白激酶Akt/PKB，进一步导致下游BAD蛋白的磯 酸化，从而阻止BAD与调亡蛋白Bd-2、Bel-化组成复合物，同时还诱导叉头转录因子1 磯酸化，从而抑制原调亡基因的表达。
[0009] 另外，肥R2癌基因也是肿瘤转移驱动因子，肥R2过表达能通过启动多种转移相关 机制而增加肿瘤细胞转移能力，如细胞迁移率、体外侵袭力、W型胶原酶活性等，还可W影响 某些黏附分子如上皮细胞巧黏蛋白等的合成，从而促进转移。Carter等（CarterW，^^ng J, Boswell C, et al.HER-2/neu over-expression induces endothelial cell retraction[J].Int Cancer, 2001，91(3) :295-299.)研究认为，肥R2过表达可使内皮细胞 收缩，细胞间隙增宽，肿瘤细胞易于从内皮细胞间穿越，肿瘤细胞发生移位或转移。多数研 究认为，肥R2基因扩增和（或）蛋白过表达往往提示肿瘤恶性程度高，转移能力强。
[0010] 肥R2的过表达常与肿瘤的发生有关，例如：
[0011] (1)胃癌：胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，预后差，进展期胃癌5年生存率 仅为5%~20%,中位生存时间不超过1年。不同的研究小组检测肥R2蛋白在胃癌中过 表达的比率变异为7%~43%。肥R2蛋白在胃癌中的阳性表达与肿瘤分化程度、Lauren分 型及WK)分型有关，与年龄、性别、肿瘤发生部位及临床分期不相关。
[001引 似乳腺癌：研究表明，肥R2在20%~30%的原发性乳腺浸润性导管癌中有基因 的扩增和蛋白的过度表达。肥R2的高表达常导致细胞的恶性转移，因此肥R2阳性的乳腺 癌浸润性强，无病生存期短，预后差。体外实验显示，抑制肥R2的表达可导致肿瘤细胞 的调亡。
[0013] (3)卵巢癌；卵巢癌是妇科肿瘤致死的主要原因。卵巢癌中肥R2的过表达与乳腺 癌中相似，占 15%~30%。Verri等（VerriE,GuglielminiP,PuntoniM,etal.肥R2/ neuoncoproteinoverexpressioninepithelialovariancancer:evaluationofits prevalenceandprognosticsignificance[J].Oncology, 2005, 68:154-161.)白勺石开究 显示，肥R2阳性（2+/3+)患者比阴性患者（0/1+)总生存期显著降低（29个月vs48个 月，P<0. 05)。观察m、IV期的卵巢癌20个卵巢细胞株发现，均存在肥R2蛋白过表达。 [0014] (4)前列腺癌；前列腺癌发生时属于雄激素依赖性，在接受药物或手术去势治疗 后肿瘤退缩，但最终会转变为雄激素非依赖性而继续生长，该是目前前列腺癌治疗中最主 要的问题。研究表明，肥R2是前列腺癌从激素依赖型转变为激素非依赖型过程中的主要介 导者。Signoretti等（SignorettiS,MontironiR,ManolaJ,etal.Her-2-neuexpression andprogressiontowardandrogenindependenceinhumanprostatecancer[J].JNatl CancerInst, 2000, 92:1918-1925.)研究分析不同临