一种抗cd3/抗cd19双特异性抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗体药物开发和生产技术领域。具体地，本发明涉及抗⑶3/抗⑶19 双特异性抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] B淋巴细胞白血病和恶性淋巴瘤是原发于骨髓造血系统和淋巴结并弥漫全身的恶 性肿瘤。传统的放化疗虽然有一定疗效，但没有选择性，对正常组织的损伤很大。近年来，生 物治疗方法广泛应用于肿瘤治疗，尤其是单克隆抗体，如rituximab (muuamh，并因其特 异靶向性、高亲和性而收到了良好效果。单抗通过Fc段与效应细胞表面活性受体Fe YR I / Fc γ RIII结合,从而介导杀伤作用,但具有免疫杀伤作用的T细胞因为表面缺乏上述受体而 不能被有效介导，从而削弱了机体对肿瘤的免疫效应。
[0003] 双特异性抗体（bispecific T cell engagers, BiTEs)是一种以T细胞作为效应 细胞的双特异性单链抗体，它具有两个抗原结合臂，可以同时和T细胞及靶细胞结合，并激 活细胞毒性T细胞杀伤病变细胞。和其它双特异性抗体相比，BiTEs的分子柔韧性更好，能 更好地促进CD3复合体和肿瘤靶标的连接，并且它不受T细胞受体和靶细胞上MHC I类分 子的约束，不需要共刺激分子的参与，是一种极具应用潜力的抗体形式。
[0004] BiTEs采用单链抗体技术，将两个不同抗体的重链及轻链可变区连接在一条多肽 链上，其基本的形式是V-linker-Vm-linker-Vf^-linker-Vu。BiTEs具有两个抗原结合部 位，可以同时和T细胞及病变细胞表面的抗原分子结合，从而有效地激活静止的T细胞来达 到杀伤病变细胞的目的。由于其独特的结构形式和特性，BiTEs可以用于克服其它双特异 性抗体在肿瘤治疗上的缺陷。双特异性抗体是通过鼠源性单克隆抗体的化学偶联、双杂交 瘤和基因工程3个发展阶段所制备的一种非天然抗体或抗体杂合分子，随着生物技术的日 益进步，国内外双特异性抗体的相关研究日趋深入，其在临床治疗中作为一种新的二次导 向系统具有潜在的应用价值。
[0005] 非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin, s lympho-ma，NHL)是一组起源于淋巴组织并弥漫 全身的恶性肿瘤，其发病率和死亡率已居恶性肿瘤第5位。大部分NHL来源于B淋巴细胞 (B-NHL)。⑶3是T淋巴细胞表面特异分子，通过它可以募集具有杀伤作用的T淋巴细胞，而 CD19是B淋巴细胞表面特异标志，分子量为95X IO3的穿膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族 成员，与B细胞活化和信号的转导有关，在前B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、成熟B淋巴细 胞、激活的B淋巴细胞中表达，在浆细胞、淋巴多能干细胞以及其他组织中均无表达。大多 数NHL起源于B淋巴细胞，95 %以上的B细胞NHL表达⑶19抗原，且⑶19抗原比较暴露， 人体血清中也无游离的CD19存在，因此CD19可作为治疗B细胞淋巴瘤的靶点。单抗应用 于肿瘤治疗由于其分子量大、半衰期长，很难穿透肿瘤细胞发挥杀伤作用。而微型双特异 性抗体具有分子量小、半衰期短且具有较好的肿瘤细胞穿透性，本身细胞毒作用低。T细胞 表面抗原CD3和肿瘤细胞表面相关表达抗原的双特异性微型抗体介导的抗肿瘤治疗，以及 体外致敏的树突状细胞（dendritic cells，DCs)诱导的相对特异的细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxic T lymphocyte，CTL)对肿瘤的杀伤等，被认为是传统的手术治疗、放化疗方法 之外最有希望清除残余肿瘤细胞和微小转移病灶从而根治肿瘤的辅助治疗措施，许多动物 实验和临床试验已经证实了该生物治疗措施的疗效。
[0006] 本发明的抗⑶3/抗⑶19双特异性抗体是在抗⑶3scFv和抗⑶19scFv载体基础 上构建而成。CD19是较为理想的肿瘤相关抗原，它表达于除干细胞以外的B淋巴细胞发育 的各个阶段，因此B细胞来源的恶性细胞均有⑶19表达，⑶3是T淋巴细胞表面特异分子。 因此本发明提供了一种新型抗CD3/抗CD19双特异性抗体的构建，以期能够获得比已有抗 CD3/抗CD19双特异性抗体家族的其他抗体更好的通过桥接作用介导T细胞高效特异杀伤 B淋巴细胞来源的肿瘤细胞。
【发明内容】
[0007] 本发明构建了大容量的天然人源噬菌体抗体库，从中筛选获得了全人源抗CD3单 链抗体和抗CD19单链抗体。
[0008] 本发明的技术方案是：一种抗⑶3/抗⑶19双特异性抗体，它包含全人源抗⑶3单 链抗体和全人源抗CD19单链抗体的结合结构域，其中相应的重链可变区（V h)和相应的轻 链可变区（\)从N-未端到C-未端按照如下顺序排列：
[0009] Vh (CD 19)-Vl (CD 19)-Vh (CD3)-Vl (CD3)或
[0010] VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)。
[0011] 本发明公开的全人源抗⑶3单链抗体，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO :7所 示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO :8所示。
[0012] 本发明公开的全人源抗⑶19单链抗体，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 15 所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 16所示。
[0013] 本发明的抗⑶3/抗⑶19双特异性抗体通过构建真核或原核表达载体，转化入相 应的真核或原核细胞内进行重组表达。
[0014] 本发明还公开了上述表达载体转化的宿主细胞，为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌， 中华仓鼠卵巢细胞（CHO)、小仓鼠肾细胞（BHK)、C0S细胞、小鼠 NSO胸腺瘤细胞等哺乳动物 细胞。
[0015] 本发明抗⑶3/抗⑶19双特异性抗体的制备方法：将上述构建的表达载体转化至 上述的宿主细胞中，在适合所述全人源单克隆抗体表达的条件下培养转有上述表达载体的 宿主细胞，对培养物进行分离纯化获得上述的双特异性抗体。
[0016] 本发明通过试验证明：该抗体可以应用于治疗肿瘤的治疗药物的制备中。上述的 肿瘤可以为：非霍奇金淋巴瘤、B细胞白血病或霍奇金淋巴瘤等。同时通过现有的研究推 测：该抗体还有望应用于自身免疫性疾病的治疗药物的制备中。
[0017] 本发明的有益效果是：本发明的抗⑶3/抗⑶19双特异性抗体对人⑶3和⑶19分 子具有高亲和力，具有介导激活T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的作用。且抗体分子的重链和轻 链是全人源的，尽管嵌合的或人源化的也可以使用，但是用于人体时，全人源的可以避免很 多副作用，例如HAM和HACA反应引起的那些副作用。
【附图说明】
[0018] 图I :针对⑶3和⑶19的单链双特异性抗体的表达和纯化的蛋白质级分的代表性 SDS-PAGE分析。其中，泳道1为Marker ;泳道2为CHO细胞表达上清；泳道3为二步纯化样 品1 ;泳道4为二步纯化样品2。
[0019] 图2A、B、C、E、F、G :FACS分析抗CD3/抗CD19的单链双特异性抗体与Nalm6细胞 和Jurkat细胞结合活性。应用流式细胞仪进行间接免疫荧光测定。其中，图2A为Nalm6 细胞在PBS中孵育的阴性对照，图2B为Nalm6细胞与抗CD3/抗CD19的单链双特异性抗体 的结合结果，图2C为Nalm6细胞与HIT19a单抗的结合结果（阳性对照），图2E为Jurkat 细胞在PBS中孵育的阴性对照，图2F为Jurkat细胞与抗CD3/抗CD19的单链双特异性抗 体的结合结果，图2G为Jurkat细胞与HIT3a单抗的结合结果（阳性对照）。结果表明抗 CD3/抗CD19双特异性抗体能与Nalm6和Jurkat细胞特异性结合，说明该双功能抗体具有 与⑶3和⑶19靶抗原结合能力。
[0020] 图3D、H :FACS分析抗CD3/抗CD19的单链双特