单克隆抗体纯化工艺方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物领域，特别是涉及单克隆抗体的纯化工艺方法。
【背景技术】
[0002] 1997年，美国基因泰克公司成功研发出第一个人源化的单克隆抗体药物，迈出了 单抗药物产业化的第一步。短短10多年历史，抗体药物呈现出锐不可挡的发展态势，有几 个数字可以说明抗体药物的地位和发展前景：2010年全球治疗用单抗药物的销售总额达 到 440亿美元，如果加上100亿美元的单抗诊断和研究试剂，单抗药物的市场总量已经达到 550亿美元，2011年单抗药物的市场总量已经达到628亿美元。而在此前的2009年和2008 年，该数字分别为400亿美元和370亿美元(数据来源于国家统计局)。当前，几乎所有大型 制药公司都有单抗研发项目。
[0003] 虽然世界经济下滑风险趋势的加大对单克隆抗体药物的增长有所影响，但单克隆 抗体药物的兴起已经不可阻挡，随着单克隆抗体药物研究的不断深入，新药的不断推出，未 来，全球单克隆抗体药依旧会保持较高的增长率。分析预测，到2015年，全球单克隆抗体药 销售额有望达980亿美元左右。然而，目前抗体药物单批产量最高才达到千克级，而抗体药 物的单剂用量是微克、毫克级。可见抗体药物的价值远超过黄金。如此昂贵的产品，制造工 艺就显得格外重要，工艺的任何不完善都可能造成极大的损失。
[0004] 抗体药物的制造又以下游工艺最为复杂繁琐。下游工艺包含多个步骤，目前常用 的是亲和层析、阳离子交换层析和阴离子交换层析的液相色谱分离方法。虽然都是采用这 几种层析方法，但是具体的参数不同、填料选择不同都会产生完全不同的结果。
[0005] 亲和层析作为层析分离的第一步，一般作用是捕获发酵上清中的产品。基于特异 性免洗吸附的原理，经过亲和层析后的产品一般可以达到大于80%的单体纯度，同时还能 保证较高的回收率。然而抗体药物不仅需要保证单体纯度，还需要尽可能的减少宿主蛋白 和DNA的残留。大多数抗体产品的纯化工艺都把宿主蛋白（HCP)和DNA的去除依托在后续 步骤，但从绝对去除量上来看，未和层析才是去除宿主蛋白和DNA最多的步骤，所以在未和 层析这步去除尽可能多的宿主蛋白和DNA会大大减轻后续步骤的压力。
[0006] 亲和层析洗脱收集液经过低pH病毒灭活后，用碱性缓冲液中和时一般会较混浊， 这种情况一般为少量残留的HCP和DNA在pH4 - 6时产生共沉淀导致。如果将这部分杂质 去除可能会稍微降低一点回收率但却可以去除更多的HCP和DNA，同时也更有利于提高后 续除病毒过滤膜的载量，从而降低成本。
[0007] 阳离子交换层析主要用于去除高聚物，同时能进一步去除宿主蛋白和DNA。常规的 方法是低盐上样后，用高盐洗脱，选择适合的盐浓度将目的蛋白洗脱，从而达到分离效果。 但是常规洗脱模式分辨率较低，只能稍许提高目的蛋白纯度，对于与目的蛋白电荷差异较 小的酸碱性类似物分离效果较差。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是提供一种单克隆抗体纯化工艺方法，它可以提高单克 隆抗体产品的纯度。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明的单克隆抗体纯化工艺方法，步骤包括：
[0010] 1)亲和层析；
[0011] 2)调节亲和层析洗脱液的pH值至3. 3~3. 8,进行病毒灭活；
[0012] 3)调节pH值至中性，进行深层过滤；
[0013] 4)阴离子交换层析；
[0014] 5)阳离子交换层析。
[0015] 较佳的，步骤1)的亲和层析在上样后，洗脱前，用pH值5. 0~5. 5、浓度1~3M的 高浓度盐溶液洗涤层析柱。例如，可以先用20mM柠檬酸-柠檬酸钠(或醋酸-醋酸钠）和 IM氯化钠的混合溶液洗涤层析柱，再用20mM柠檬酸-柠檬酸钠(或醋酸-醋酸钠）洗涤层 析柱。其中，氯化钠也可以用氯化钾或硫氰酸钾代替。
[0016] 步骤3)所述深层过滤可以采用0. 1~0. 5 μπι孔径的二级深层过滤器。
[0017] 较佳的，步骤5)的阳离子交换层析在洗脱前，可以先用高pH值的缓冲液（pH值 6. 0~9. 0)洗涤阳离子交换层析柱，然后在目的蛋白峰出来前换成低pH值的平衡液。
[0018] 与现有纯化方法相比，本发明的单克隆抗体纯化工艺方法具有以下优点和有益效 果：
[0019] 1.通过在亲和层析中加入洗涤步骤，有效地去除了高聚物、片段、HCP和DNA等杂 质，提高了抗体纯度，同时避免了多次稀释和调节pH。
[0020] 2.通过在亲和层析洗脱液低pH灭活并中和后，加入深层过滤步骤，进一步去除了 宿主蛋白、DNA和高聚物，提高了抗体的纯度。经过滤澄清处理的产品后期纳滤去除病毒时 载量较高，不容易堵塞。而没有经过深层过滤的产品后期纳滤易堵膜，进行去病毒验证实验 时也很难通过。
[0021] 3.通过在阳离子交换层析中，增加高pH盐洗涤步骤，去除酸性和碱性杂质，使产 品的CEX主峰纯度提高了至少5%以上。
【具体实施方式】
[0022] 为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合具体的实施例，对本 发明的技术方案进行详细的说明。实施例中涉及的各项指标采用以下检测方法：SEC (单体 纯度)采用分子排阻高效液相色谱法检测，CEX (电荷纯度)采用阳离子交换高效液相色谱法 检测，残留HCP采用酶联免疫吸附法检测，残留DNA采用定量聚合酶链反应检测，残留ProA (蛋白质A)采用酶联免疫吸附法检测。
[0023] 实施例1赫赛汀单克隆抗体纯化
[0024] 1.蛋白质A亲和层析
[0025] 步骤1，用3倍柱体积的注射用水淋洗层析柱，然后用3倍柱体积的NaOH (50mM) 和NaCl (IM)的混合溶液消毒层析柱，再用3倍柱体积的注射用水淋洗层析柱。
[0026] 步骤2,用5倍柱体积的缓冲液（20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠+150mM NaCl， PH7.4)平衡层析柱。
[0027] 步骤3,上样，让样品在柱上保留4分钟。
[0028] 步骤4,用20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠+150mM NaCl，pH7. 4淋洗至A280基线， 然后用5倍柱体积的缓冲液（20mM柠檬酸-柠檬酸钠 +IM NaCl，pH5. 5)洗涤层析柱，再用 3倍柱体积的缓冲液（20mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH5. 5)洗涤层析柱。
[0029] 通过在步骤4中增加两次缓冲液洗涤步骤，大大减少了亲和层析洗脱液中HCP的 残留。未增加洗涤步骤前，亲和层析洗脱液中HCP的残留量一般在IO 3Ppm级别，增加洗涤 步骤后，HCP残留量降低60%-80%，具体数据见表1 :
[0030] 表1亲和层析加入洗涤步骤后的HCP残留量
[0032] 由表1可见，亲和层析加入适当的洗涤步骤后，HCP残留量显著降低，从8374ppm降 低至 2520ppm。
[0033] 步骤5,用缓冲液（20m