一种单克隆抗体IgG质谱测序方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种单克隆抗体IgG质谱测序方法。
【背景技术】
[0002] 目前，单克隆抗体IgG的制备多是通过杂交瘤细胞制备得到，送样就需要通过高 通量的筛选得到能产生高特异性和灵敏度的杂交瘤细胞株，并用此杂交瘤细胞株产生高质 量的单克隆抗体IgG。杂交瘤细胞的高通量筛选工作量庞大，同时要保证筛选到的杂交瘤细 胞的稳定性，需要严格的储存条件。因此可借用基因工程的手段，获取高特异性和灵敏度的 单克隆抗体，送就需要通过测序获取优质单克隆抗体IgG的蛋白序列，从而推导出其基因 序列，借此，通过基因重组的方式制备高品质的单克隆抗体IgG。鉴于质谱技术在蛋白领域 的应用越来越广泛，同时单抗制备技术发展趋势的需求，需要一种准确的高效测定单克隆 抗体IgG序列的新方法，因而需要开发一种合适的单克隆抗体测序技术，用于优质单克隆 抗体IgG的制备。
【发明内容】
[0003]为了解决W上技术问题，本发明提供一种单克隆抗体IgG质谱测序方法，将单克 隆抗体IgG的测序简化为CDR1/2/3序列测定时，单克隆抗体IgG测序难度迅速下降。
[0004] 本发明通过W下技术方案实现：
[0005] -种单克隆抗体IgG质谱测序方法，包括W下步骤：
[0006] (1)将单克隆抗体IgG还原烷基化；
[0007] (2)通过电泳方法将还原烷基化的所述单克隆抗体IgG分离重链和轻链；
[000引（3)胶内酶切单克隆抗体IgG的重链和轻链得到多肤片段；
[0009] (4)酶切得到的多肤片段加样到LC-MS/MS仪器；
[0010] (5)通过NanoLC指纹图谱分析找出CDR1/2/3序列；
[0011] (6)CDRl/2/3 序列测序。
[0012] 在上述技术方案中，所述步骤（1)中的还原烷基化采用DTT-IAM模式。
[0013] 在上述技术方案中，所述步骤（2)中的电泳方法为常规SDS-PAGE电泳法。
[0014] 在上述技术方案中，所述步骤（3)中的胶内酶切单克隆抗体IgG的重链和轻链采 用常规in-geldigestion方法。
[0015] 在上述技术方案中，所述步骤（4)中加入质谱仪的酶切多肤样本量为5-15μL。
[0016] 本发明通过LC-MS/MS法结合纳升级液相色谱法（NarwLC)将单克隆抗体IgG的测 序简化为CDR1/2/3序列测定，通过NanoLC指纹图谱的分析可W把CDR1/2/3潜在的多肤谱 图锁定到某些区域，然后详细分析送些谱图而获得最终的CDR1/2/3多肤序列信息，然后将 单克隆抗体IgG中的保守序列与最终的CDR1/2/3多肤序列进行拼接即可得到完整的单克 隆抗体IgG氨基酸序列，使单克隆抗体IgG测序难度迅速下降。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细描述。
[001引 实施例一
[001引NGAL抗体质谱测序：
[0020]NGAL抗体质谱测序包括W下步骤；1、将自制的NGAL单克隆抗体（抗体的重链氨 基酸序列见序列表1，抗体的轻链氨基酸序列见序列表2)进行还原烷基化；2、SDS-PA(iE电 泳经过还原烷基化的NGAL单克隆抗体IgG，分离重链和轻链；3、分别胶内酶切NGAL单克隆 抗体IgG的重链和轻链得到多肤片段；4、酶切得到的多肤上LC-MS/MS仪器；5、nanoLC指纹 图分析；6、谱图鉴定和CDR1/2/3鉴定。具体每个步骤的操作如下：
[0021] 1、NGAL单克隆抗体还原烷基化
[0022] 单克隆抗体IgG还原烷基化采用DTT-IAM模式，孤T值ithiot虹eitol，二硫苏糖 醇）用于还原二硫键，而IAM(贿己醜氨）用于封闭琉基。该方法具体的操作步骤如下： ①取20μL的IgG抗体溶液（即20μg)用于还原烷基化操作；②加入0. 2μLDTT，56°C 水浴45min;⑨冰浴5min;彻底降温到室温；④黑暗条件下，加入2μLIAM,反应60min; ⑤1300化pm,离必5min，去掉沉淀；⑧取出上清，上清用于后续的SDS-PAGE电泳。
[002引 2、SDS-PAGE电泳分离抗体的重链和轻链
[0024]SDS-PAGE电泳经过还原烷基化的单克隆抗体IgG,分离重链和轻链中，SDS-PAGE 电泳采用常规的SDS-PAGE电泳方法。
[0025] 3、胶内酶切NGAL单克隆抗体IgG的重链和轻链
[0026] 电泳分离完成之后分别用膜酶、胃蛋白酶和弹性蛋白酶对电泳分离得到的重链和 轻链进行胶内酶切，其具体的酶切过程及参数如下：
[0027] 膜酶胶内酶切：采用膜酶对单克隆抗体IgG的重链和轻链进行胶内酶切得到多肤 片段时，胶内酶切单克隆抗体IgG采用常规的in-geldigestion方法。该方法具体的操作 步骤如下；①清洗和脱色：将蛋白质点用切胶仪切胶，置于96孔板中。在含有胶粒的每个孔 中加入200/A1脱色液（lOOmmol/L硫代硫酸钢和30mmol/L铁氯化钟溶液按照1 ;1混合而 成），静置30min后，弃去上清液。然后加200/μL水清洗，静置30min后弃上清液。重复该 步骤直至胶粒变为无色；②脱水干燥；在胶粒中加入200μL己腊静置30min后，弃上清液。 重复该步骤至凝胶完全脱水变白。将己腊吸出舍弃后，将胶粒置于37°C至完全干燥；⑨酶 液泡胀；测序级的膜蛋白酶用20mmol/L碳酸氨倭溶液配制为浓度12. 5ng/mL后，加入适量 酶液于胶粒中，并于4°C放置30min使胶粒完全泡涨。然后吸出多余的酶液弃去，W防止质 谱检测时出现过多的膜蛋白酶自身降解的肤段；④酶解：加约5μL的25mmol/L碳酸氨倭 溶液覆盖胶粒，W防止溶液在酶解过程中干涧。置于37°C控温箱内保温12~16h;⑤提 取：酶解后的胶粒用60μL的0. 1 %TFA和50%己腊提取3次，每次20min，合并提取液；⑧ 浓缩；真空浓缩仪条件下抽干。
[0028] 采用胃蛋白酶和弹性蛋白酶对单克隆抗体IgG的重链和轻链进行胶内酶切得到 多肤片段时，其与采用膜酶进行胶内酶切时不同点在于：在④酶解时采用的缓冲液不同，胃 蛋白酶在④酶解时采用的是5%TFA;采用弹性蛋白酶进行④酶解时所用的缓冲液是抑= 9的化isbuffer。膜酶、胃蛋白酶和弹性蛋白酶胶内酶切时除了④酶解时缓冲液不同外， 其余的参数和操作步骤均一样。
[0029] 4、酶切得到的多肤上LC-MS/MS仪器
[0030] 采用各种酶完成胶内酶切过程之后，将酶切得到的多肤片段分别上LC-MS/MS仪 器，所述的质谱仪为各种型号的质谱仪，优选ABSCIEX公司的化ipleT0F5600-plus质谱 仪，进入质谱仪的酶切多肤样本量为5-15μL优选为10μL。
[0031] 5、NanoLC指纹图分析
[0032]NanoLC指纹图分析在于多肤样本进入质谱仪并获得质谱数据W后需分析IgG的 重链和轻链的指纹图，将IgG中保守序列的保留时间、电荷、峰强度和上样量进行一一对 应，然后确定单克隆抗体IgG的指纹图。指纹图的分析可W锁定IgGl/2/3的亚型。IgG至少 有四种亚型，比如人类的IgGl/2/3/4、小鼠的IgGl/2a/2b/3等。不同亚型的差异在于-C00H 端序列。因此，单抗测序的特殊性在于IgG仅仅只有CDR1/2/3区域的序列是可变的，其它 区域的序列都是保守的。因此，IgG蛋白质测序相比普通的蛋白质测序难度低很多。IgG 包含重链（VDJ重组）和轻链（VJ重组）两个长链多肤，两条多肤通过二硫键连接到一起 产生完整的IgG抗体。IgG酶解后，产生很多的多肤，因为保守区是一样的，因此，同一物种 的保守区酶切结果是一致的（至少非常相似）。不同的多肤序列来自CDR1/2/3区域的多 肤，送些多肤在NanoLC的图谱上表现出偏移，送些偏移的多肤就是CDR1/2/3多肤。送是 多肤NanoLC指纹图的关键信息，通过NanoLC指纹图可W获取到潜在的CDR1/2/3序列的保 留时间、峰强度和m/z信息（保留时间数据见表一和表二），然后可W专口挑选送些多肤进 行MS/MS鉴定。
[0033] 表一NGAL单克隆抗体IgG重链各酶解谱图保留时间
[0034]
[0039]
[0040] 6、谱图鉴定和CDRl/2/3鉴定
[0041] 谱图鉴定和CDR1/2/3鉴定时，将单克隆抗体IgG的测序简化为CDR1/2/3序列测 定时，单克隆抗体IgG测序难度迅速下降。通过NanoLC指纹图的分析可W把CDR1/2/3潜 在的多肤谱图锁定到某些区域，然后详细分析送些谱图而获得最终的CDR1/2/3多肤序列 信息。然后将单克隆抗体IgG中的保守序列与最终的CDR1/2/3多肤序列进行拼接即可得 到完整的单克隆抗体IgG氨基酸序列。各种酶切NGAL单克隆抗体的重链及轻链谱图鉴定 结果及多肤拼接结果如下表Η和表四所示：
[0042] 表ΗNGAL单克隆抗体IgG重链各酶解谱图鉴定结果
[0043]
[0045] 表四NGAL单克隆抗体IgG轻链各酶解谱图鉴定结果
[0046]
[0048] 使用proteincoveragesummarize!·软件进行多肤（p巧tide)和IgG抗体序列进 行覆盖率分析。结果发现重链序列几乎完全配对成功（除Fc端有一个氨基酸未能配对，但 是Fc是已知序列，对测序毫无影响），即可变区被完全测通；而轻链序列覆盖率在97. 66%， 未能匹配成功的也是保守区的序列，该序列也是已知序列，而可变区也完全被测通。
[0049] 最后所应说明的是，W上实施例仅用W说明本材料的技术实施方案而非限制，尽 管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可W对本 发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应 涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1. 一种单克隆抗体IgG质谱测序方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将单克隆抗体IgG还原烷基化； (2) 通过电泳方法将还原烷基化的所述单克隆抗体IgG分离重链和轻链； (3) 胶内酶切单克隆抗体IgG的重链和轻链得到多肽片段； (4) 酶切得到的多肽片段加样到LC-MS/MS仪器； (5) 通过NanoLC指纹图谱分析找出⑶R1/2/3序列； (6)CDRl/2/3序列测序。2. 如权利要求1所述的单克隆抗体IgG质谱测序方法，其特征在于，所述步骤（1)中的 还原烷基化采用DTT-IAM模式。3. 如权利要求1所述的单克隆抗体IgG质谱测序方法，其特征在于，所述步骤（2)中的 电泳方法为常规SDS-PAGE电泳法。4. 如权利要求1所述的单克隆抗体IgG质谱测序方法，其特征在于，所述步骤（3)中的 胶内酶切单克隆抗体IgG的重链和轻链采用常规in-geldigestion方法。5. 如权利要求1所述的单克隆抗体IgG质谱测序方法，其特征在于，所述步骤⑷中加 入质谱仪的酶切多肽样本量为5-15μL。
【专利摘要】本发明涉及一种单克隆抗体IgG质谱测序方法，包括以下步骤：将单克隆抗体IgG还原烷基化；通过电泳方法将还原烷基化的所述单克隆抗体IgG分离重链和轻链；胶内酶切单克隆抗体IgG的重链和轻链得到多肽片段；将酶切得到的所述多肽片段加入到LC-MS/MS质谱仪获取指纹图谱；通过指纹图谱分析找出CDR1/2/3序列；CDR1/2/3序列测序。
【IPC分类】G01N30/72, G01N30/06
【公开号】CN105277638
【申请号】CN201410350750
【发明人】沈鹤霄, 华权高
【申请人】沈鹤霄
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年7月22日