专利名称：一种用于蛋白质末端肽段富集与测序的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质的测序方法。具体的说，涉及末端肽段的色谱富集与质谱测序的方法。本发明还涉及用于该方法的试剂盒。
背景技术：
众所周知，蛋白质的末端信息对蛋白质的结构确定及功能阐述都非常重要。一方面，蛋白质的末端序列标签具有很高的特异性。据统计，43％至83％的蛋白质具有独特的N端4残基标签，74％至97％的蛋白质具有独特的C端4残基标签(依物种而异)[Wilkins，M.R.，Gasteiger，E.，Tonella，L.，Ou，K.et al，J.Mol.Biol.1998，278，599-608.]。另一方面，蛋白质的N端序列有助于确证蛋白质的N端加工，C端序列有助于了解蛋白质的信号识别域[Chung，J.J.，Shikano，S.，Hanyu，Y.，Li，M.，Trends Cell Biol.2002，12，146-150.]。
虽然蛋白质的末端肽段包含重要的生物学信息，但在目前蛋白质组研究最常用的“鸟枪法”中，蛋白质末端肽段往往被淹没在酶切产生的大量非末端肽段中，被质谱鉴定的几率非常低。例如，Swiss-prot 46.0版人类蛋白质数据库中的11936个蛋白质理论酶切可产生694584个肽段，平均每个蛋白质可产生约60个肽段，而其中只有2个是末端肽段。所以选择性富集末端肽段，提高其丰度及序列分析的成功率，就非常必要。虽然文献中有一些富集或鉴定蛋白质N端或C端肽段的方法[1.Kosaka，T.，Takazawa，T.，Nakamura，T.，Anal.Chem.2000，72，1179-1185；2.Sechi，S.，Chait，B.T.，Anal.Chem.2000，72，3374-3378；3.Yamaguchi，M.，Nakazawa，T.，Kuyama，H.，Obama，T.et al，Anal.Chem.2005，77，645-651；4.Gevaert，K.，Goethals，M.，Martens，L.，Van Damme，J.et al，Nat.Biotechnol.2003，21，566-569.]，但目前并没有一个简单易行的方法可从复杂的蛋白质混合物中同时富集蛋白质的N端和C端肽段并对其进行有效测序。
发明内容
本发明提供了一种简单有效，既可富集蛋白质末端肽段，又可促进其质谱测序，从而提高蛋白质末端肽段序列分析可靠性的方法。本发明人发现，通过在蛋白质的末端肽段中引入带负电荷的磺酸基，既可以通过阳离子交换色谱分离富集蛋白质的末端肽段，又有利于其质谱测序。
具体的说，本发明提供了一种用于蛋白质末端肽段的富集与测序的方法，该方法包括(1)对蛋白质的末端氨基进行化学修饰
(2)用还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；用烷基化试剂封闭巯基，防止其重新形成二硫键；(3)用化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，产生适于质谱分析的肽段；用试剂对酶切肽段的侧链氨基进行保护；(4)用阳离子交换色谱柱分离富集蛋白质末端肽段；(5)用质谱分析技术分析蛋白质末端肽段，使其裂解产生碎片离子的质谱图；其特征在于所述步骤(1)的处理方法为(a)用磺酸衍生物对蛋白质的末端氨基进行化学修饰，使其带上酸性基团；(b)用一种或多种含游离氨基的化学试剂，对蛋白质的修饰反应进行终止。
其中，步骤(a)所述酸性基团选自2-磺基乙酰基，3-磺基丙酰基，2-磺基苯甲酰基或3-磺基苯甲酰基；步骤(b)所述化学试剂选自三羟乙基氨基甲烷或赖氨酸。
该方法在蛋白质的末端引入较强的酸性基团以改变末端肽段的荷电状态，酶切后通过离子交换色谱分离富集蛋白质的末端肽段，然后通过质谱技术实现蛋白质的鉴定及末端分析。加在蛋白质末端肽段上的酸性基团在离子交换色谱条件下带负电荷，中和了末端肽段中碱性基团所带的正电荷，使大多数N端肽段所带净电荷为零，大部分C端肽段带0或1个正电荷，其它肽段则带2个或多个正电荷，从而实现在离子交换色谱中末端肽段的分离与富集。在质谱分析中，引入的酸性基团可以促进肽段离子的裂解，简化其二级质谱图，从而有助于其序列分析。利用本方法，大大富集了蛋白质的末端肽段，显著提高了末端肽被质谱检出的机会及其在二级质谱中的裂解效率，使碎片离子的信噪比大大提高，二级质谱图的质量明显改善，可根据二级质谱图对蛋白质末端肽进行从头测序。
本发明还提供了一种用于蛋白质末端肽段的富集与测序的试剂盒，该试剂盒含有(a)一种或多种可对蛋白质末端氨基进行修饰，使其带上酸性基团的试剂；(b)一种或多种含游离氨基的化学试剂；其中组分(a)所述试剂优选具有磺酸基的酰化试剂；组分(b)所述化学试剂优选三羟乙基氨基甲烷或赖氨酸。
为方便使用，该试剂盒还可包含以下组分中的一种或多种用于打开蛋白质分子中二硫键的还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)和三羧乙基膦(TCEP)；封闭巯基防止其重新形成二硫键的烷基化试剂，如碘乙酰胺和碘乙酸；蛋白质消化剂，如胰蛋白酶；侧链氨基保护试剂，如O-甲基异脲；此外还可含有国家行政机关批准的使用说明等。
本发明的新方法和试剂盒适用于蛋白质末端肽段的富集和质谱测序，特别适用于生物学、医学和药物学领域中进行蛋白质的鉴定及末端分析。
本发明的方法和试剂盒具有广泛的实用性。用途包括但不限于在医学、药学、农业和畜牧业等领域进行各种动植物和微生物的蛋白质研究。
图1.富集到的马心肌红蛋白末端肽段的质谱图(标明质荷比者从左到右分别为C端和N端肽段)图2.马心肌红蛋白N端肽段(GLSDGEWQQVLNVWGK，1-16)的二级质谱3.富集到的牛乳球蛋白N端肽段的质谱图(标明质荷比者为N端肽段)图4.富集到的牛乳球蛋白C端肽段的质谱图(标明质荷比者为C端肽段)图5.牛乳球蛋白N端肽段(IIVTQTMK，1-8)的二级质谱6.牛乳球蛋白C端肽段(LSFNPTQLEEQCHI，149-162)的二级质谱7.富集到的牛胰岛素末端肽段的质谱图(标明质荷比者从左到右分别为B链C端和A链N端肽段)图8.牛胰岛素B链C端肽段(GFFYTPKA，47-54)的二级质谱图具体实施方式
下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。
实施例1 马心肌红蛋白中末端肽段的富集与测序1.1取1mg马心肌红蛋白，溶于1mL 0.2M pH 8的硼酸盐溶液，加入20mM的邻磺基苯甲酸酐，室温反应1小时后，加入100mM的Tris/HCl终止反应。肌红蛋白不含半胱氨酸残基，故可省去还原烷基化步骤。加入20ug胰蛋白酶，37℃酶切12小时。
1.2在依利特P230液相色谱仪(大连依利特公司)上，用C18-反相色谱柱(200×4.6mm，5um，300，大连依利特公司)与强阳离子交换色谱柱(200×4.6mm，5um，300，大连依利特公司)串联，进行末端肽段的富集。先用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡色谱系统，上样后用10倍柱体积的0.1％三氟乙酸(TFA)洗柱脱盐，再用60％甲醇(含1％乙酸)洗柱并收集不保留的组份进行质谱分析，最后用60％甲醇(含0.5M氯化钠，1％乙酸)洗柱。
1.3质谱分析在装备了氮激光器(337nm)的4700 Proteomics Analyzer质谱仪(美国应用生物系统公司)上进行。先在样品靶上点0.6uL基质溶液(5mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸，用含0.1％TFA的50％乙腈配制)，干后再点0.6uL馏份，自然挥干后进行质谱分析。先用肽标准物进行外部质量校准，质量测量的准确度通常为±0.2Da，在负离子反射模式下采集一级质谱图，可见1998.0和1123.5两个质谱峰，分别对应于N端肽和C端肽的[M-H+]-离子峰(见图1)。然后切换到正离子反射模式下，选择相应肽的[M+H+]+离子作为母离子进行串联质谱分析，可观察到质量很好的二级质谱图，碎片离子以y离子为主。例如，1998.0的质谱图中可观察到y3至y16的所有y型离子(见图2)。
实施例2 牛乳球蛋白末端肽的富集与测序2.1取1mg牛乳球蛋白，溶于0.2mL 0.2M pH 8的硼酸盐溶液(含6M盐酸胍)，加入20mM的邻磺基苯甲酸酐，室温反应1小时后，加入100mM的Tris/HCl终止反应。加入10mM二硫苏糖醇(DTT)，37℃反应1小时后用水稀释6倍，加入20ug胰蛋白酶，37℃酶切12小时。
2.2在依利特P230液相色谱仪(大连依利特公司)上，用C18-反相色谱柱(200×4.6mm，5um，300，大连依利特公司)与强阳离子交换色谱柱(200×4.6mm，5um，300，大连依利特公司)串联，进行末端肽段的富集。先用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡色谱系统，上样后用10倍柱体积的0.1％三氟乙酸(TFA)洗柱脱盐，再用60％甲醇(含1％乙酸)-60％甲醇(含0.5M氯化钠，1％乙酸)进行梯度洗脱并收集“Z＝0”和“Z＝1”馏份。
2.3质谱分析在装备了氮激光器(337nm)的4700 Proteomics Analyzer质谱仪(美国应用生物系统公司)上进行。先在样品靶上点0.6uL基质溶液(5mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸，用含0.1％TFA的50％乙腈配制)，干后再点0.6uL馏份，自然挥干后进行质谱分析。先用肽标准物进行外部质量校准，质量测量的准确度通常为±0.2Da，在负离子反射模式下采集一级质谱图，可见“Z＝0”馏份中有N端肽段(质荷比为1115.6)(见图3)，“Z＝1”馏份中有C端肽段(质荷比为1840.8)(见图4)。然后切换到正离子反射模式下，选择其[M+H+]+离子作为母离子进行串联质谱分析，可观察到质量很好的二级质谱图，碎片离子以y离子为主(见图5，图6)。
实施例3 牛胰岛素末端肽的富集与测序3.1取1mg牛胰岛素，溶于0.2mL 0.2M pH 8的硼酸盐溶液(含6M盐酸胍)，加入20mM的邻磺基苯甲酸酐，室温反应1小时后，加入100mM的Tris/HCl终止反应。加入10mM二硫苏糖醇(DTT)，37℃反应1小时后用水稀释6倍，加入20ug胰蛋白酶，37℃酶切12小时。
3.2在依利特P230液相色谱仪(大连依利特公司)上，用C18-反相色谱柱(200×4.6mm，5um，300，大连依利特公司)与强阳离子交换色谱柱(200×4.6mm，5um，300，大连依利特公司)串联，进行末端肽段的富集。先用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡色谱系统，上样后用10倍柱体积的0.1％三氟乙酸(TFA)洗柱脱盐，再用60％甲醇(含1％乙酸)洗柱并收集不保留的组份进行质谱分析，最后用60％甲醇(含0.5M氯化钠，1％乙酸)洗柱。
3.3质谱分析在装备了氮激光器(337nm)的4700 Proteomics Analyzer质谱仪(美国应用生物系统公司)上进行。先在样品靶上点0.6uL基质溶液(5mg/mLα-氰基-4-羟基肉桂酸，用含0.1％TFA的50％乙腈配制)，干后再点0.6uL馏份，自然挥干后进行质谱分析。先用肽标准物进行外部质量校准，质量测量的准确度通常为±0.2Da，在负离子反射模式下采集一级质谱图，可见胰岛素B链的C端肽(质荷比为1112.5)和A链(质荷比为2521.0)的[M-H+]-质谱峰(见图7)。然后切换到正离子反射模式下，选择其[M+H+]+离子作为母离子进行串联质谱分析，可观察到质量很好的二级质谱图，碎片离子以y离子为主(见图8)。
权利要求
1.一种用于蛋白质末端肽段的富集与测序的方法，该方法包括(1)对蛋白质的末端氨基进行化学修饰(2)用还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；用烷基化试剂封闭巯基，防止其重新形成二硫键；(3)用化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，产生适于质谱分析的肽段；用试剂对酶切肽段的侧链氨基进行保护；(4)用阳离子交换色谱柱分离富集蛋白质末端肽段；(5)用质谱分析技术分析蛋白质末端肽段，使其裂解产生碎片离子的质谱图；其特征在于所述步骤(1)的处理方法为(a)用磺酸衍生物对蛋白质的末端氨基进行化学修饰，使其带上酸性基团；(b)用一种或多种含游离氨基的化学试剂，对蛋白质的修饰反应进行终止。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(a)所述酸性基团选自2-磺基乙酰基，3-磺基丙酰基，2-磺基苯甲酰基或3-磺基苯甲酰基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(b)所述化学试剂选自三羟乙基氨基甲烷或赖氨酸。
4.一种用于蛋白质末端肽段的富集与测序的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有(a)一种或多种可对蛋白质末端氨基进行修饰，使其带上酸性基团的试剂；(b)一种或多种含游离氨基的化学试剂；
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于(a)所述试剂为具有磺酸基的酰化试剂。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于(b)所述化学试剂为三羟乙基氨基甲烷或赖氨酸。
全文摘要
本发明提供了一种用于蛋白质末端肽段的富集与测序的方法和试剂盒。该方法涉及蛋白质末端氨基的修饰、还原烷基化和胰蛋白酶酶切、末端肽段的色谱富集与质谱测序，通过对酶切肽段混合物中末端肽段的富集与测序，获得蛋白质的末端序列信息以进行蛋白质的鉴定及末端分析，主要用于蛋白质组研究。本发明还描述了便于该方法实施的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK101042374SQ20061006507
公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月20日 优先权日2006年3月20日
发明者钱小红, 周春喜, 张养军 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所