专利名称：分析肽的c-末端氨基酸序列的方法
技术领域：
本发明涉及分析肽C-末端氨基酸序列的方法，更具体地，涉及一种包含以下步骤的方法通过化学方法依次释放肽的C-末端氨基酸，通过质谱法测定获得的反应产物的分子量，和基于观察到的分子量的减少阐明肽的C-末端氨基酸序列，所述分子量的减少是由一系列依次消除的氨基酸所导致。本发明另外涉及一种试剂盒，其专门用于上述用于分析用于处理的方法，以通过处理用化学方法依次释放的肽的C-末端氨基酸来制备进行质谱分析的反应产物。
背景技术：
关于从自然界收集的肽和蛋白质，其鉴定的氨基酸序列在研究肽和蛋白质的生物学性质和功能的过程中是必需的信息。当前，基于其相应的基因信息，即，从编码它们的肽的基因组基因或m-RNA生产的c-DNA的核苷酸序列，肽和蛋白质的全长氨基酸序列是作为推断的氨基酸序列来确定。然而，在鉴定从编码肽的基因组基因或m-RNA生产的c-DNA过程中，还需要知道肽的部分氨基酸序列。
通常认为作为对肽的部分氨基酸序列的了解，肽的N-末端氨基酸序列和C-末端氨基酸序列特别有用。具体地解释，例如，在从大量m-RNA制备的c-DNA文库中选择编码预期的肽的c-DNA过程中，如果其N-末端氨基酸序列和C-末端氨基酸序列已知，通过使用基于上述两末端的氨基酸序列生产的核酸探针可以选择目标c-DNA。或者，通过使用基于两末端的氨基酸序列生产的寡核苷酸引物，应用PCR可以选择性地扩增目标c-DNA。
作为分析肽的N-末端氨基酸序列的方法，常规上已经使用使酸作用在肽上通过水解依次释放N-末端氨基酸和鉴定从那里产生的氨基酸的方法。同时，作为分析肽的C-末端氨基酸序列的方法，已经提出一种通过化学方法依次释放其C-末端氨基酸，并基于初始的肽和作为反应产物从那里获得的截短的肽之间的分子量差异鉴定由此释放的C-末端氨基酸的方法。作为通过化学方法依次释放C-末端氨基酸的技术，提出例如一种包含以下步骤的方法在90℃的加热条件下使从高浓度的五氟丙酸(CF3CF2COOH)水溶液或高浓度的七氟丁酸(CF3CF2CF2COOH)水溶液产生的蒸汽作用在干燥的肽上，并通过用所述全氟链烷酸增强的选择性的水解释放C-末端氨基酸[Tsugita，A.等，Eur.J.Biochem.206，691-696(1992)]。还提出一种包括以下步骤的方法代替上述高浓度的全氟链烷酸水溶液，使用五氟丙酸酐[(CF3CF2CO)2O]的乙腈溶液或七氟丁酸酐[(CF3CF2CF2CO)2O]的乙腈溶液，在这样的低温，例如在-18℃的冷却条件下使从溶液产生的蒸汽作用在干燥的肽上，并选择性地释放C-末端氨基酸，其通过使用全氟链烷酸酐加强[Tsugita，A.等，Chem.Lett.1992，235-238；Takamoro K.等，Eur.J.Biochem.228，362-372(1995)]。
在通过使作为其蒸汽提供的全氟链烷酸或全氟链烷酸酐作用在干燥的肽上来选择性地释放C-末端氨基酸的所述技术中，已经报导了在下列反应图解(I)所示的脱水反应中从C-末端氨基酸一度形成作为反应中间体的噁唑酮环结构 然后，全氟链烷酸作用在噁唑酮环上导致下列反应图解(II)所示的反应 结果，完成从那里选择性释放C-末端氨基酸的反应。
随着选择性地释放C-末端氨基酸的上述反应接连进行，在给定的处理时间经过后获得包含一系列反应产物的混合物，其中已经从初始的肽的C-末端分别去除1-10多个氨基酸残基。将包含一系列反应产物的该混合物进行质谱分析来测量来源于反应产物的离子种类的质量，由此可以获得一系列显示质量差异的峰，其反映了C-末端氨基酸序列。具体地解释，在从初始的肽依次释放C-末端氨基酸的反应中形成单独的反应产物；因此，例如，将包括系列中几个成员的一组反应产物进行质谱分析，由此，可以另外集体分析相应的离子种类的质量，其使能够同时测定这几个氨基酸残基的C-末端氨基酸序列，在所述反应产物中多达几个氨基酸残基已经从初始肽中去除。
顺便提及，例如，在生产核酸探针或引物中所用的C-末端氨基酸序列信息，根据编码该氨基酸序列的核苷酸序列，通常可以是大约18-24个碱基和相应地大约6-8个氨基酸。只在极少的情况下需要鉴定高达10多个氨基酸残基的C-末端氨基酸序列。因此，通过从干燥的肽释放C-末端氨基酸的反应，其中以汽相提供全氟链烷酸或全氟链烷酸酐的蒸汽并使作用在其上，制备包含一系列反应产物的处理样品的上述方法适合于上述目的，所述反应产物中包括多达10个氨基酸残基的所有去除。
发明内容
包含以汽相提供全氟链烷酸或全氟链烷酸酐的蒸汽并使它们作用在干燥的肽上的这些步骤的方法是阐明其中C-末端氨基酸序列的有效方法；然而，为了作为广泛使用的通用方法扩展该方法的应用，已经发现该方法有以下所述的实际问题。
在使用高浓度的全氟链烷酸水溶液的上述方法中，其在加热条件下，例如在90℃下使全氟链烷酸作用在干燥的肽上，发生副反应，其中在肽的丝氨酸残基[-NH-CH(CH2OH)-CO-]处，在它α-位的氨基(-NH-)和它β-位的羟基(-OH)之间发生N，O-酰基重排反应，随后发生水解，导致在丝氨酸残基的N-末端发生肽的裂解。取决于使用条件，还发生一种副反应，其中在它的β-位含有羟基(-OH)的苏氨酸残基[-NH-CH(CH(CH3)OH)-CO-]处，基于类似机理发生水解，其导致在苏氨酸残基的N-末端处发生肽的裂解。另外发生一种副反应，其中在肽的天冬氨酸残基[-NH-CH(CH2COOH)-CO-]处，发生从C-末端羧基到它β-位羧基的肽键重排和随后的水解，导致在天冬氨酸残基的C-末端处发生肽的裂解。
当由于这些副反应导致的肽的裂解发生时，C-末端氨基酸的选择性释放同时进行甚至到产生的N-末端肽片段。在一些情况下，源于这些副反应的反应产物的共存可能是在通过质谱分析针对预期反应产物进行的测量中干扰准确度的因素。
另外，即使当未发生肽的裂解但当形成其中肽的N-末端部分与其β-位的羟基(-OH)连接，导致该位点酰胺键丧失的支链类型的肽时，从那里不形成噁唑酮环结构，因此C-末端氨基酸的选择性释放此后不再进行。
同时，在使用全氟链烷酸酐的乙腈溶液的上述方法中，在冷却条件下，例如在-18℃下，使从溶液中产生的全氟链烷酸酐蒸汽作用在干燥的肽上，在所述系统中不存在从溶液中蒸发的水分子，因此，该方法具有这样的优势以致可以有效避免上述副反应的发生。然而，因为所用全氟链烷酸酐的反应性高，当处理稳定升高时更难有效抑制不希望有的副反应；因此，需要将处理温度保持在这样的低温，例如-18℃。换句话说，当处理温度的控制不足时，不希望有的副反应很可能因此增强；因此，从这个角度，在广泛适用性方面该方法还有些缺点，有进一步改善的空间。另外，当与冷却一起发生水冷凝时，产生的水引起所用试剂的变质，即钝化所用的全氟链烷酸酐，其有时可导致反应性降低，因此仍有一些忧虑，即它在实际应用中偶然成为严重的问题。
本发明解决了上述问题，旨在提供依次释放C-末端氨基酸的反应方法，使用该方法，当使用通过形成如上所述的噁唑酮环结构的反应机理从肽释放C-末端氨基酸时，可以容易地抑制不希望有的副反应如沿肽链某处的肽键裂解，另外所述化学处理其本身可以在广泛适用的条件下进行。更具体地，本发明的目的是提供一种通过使用依次释放C-末端氨基酸的反应的新方法，分析肽的C-末端氨基酸序列的方法，其意味着可以避免副反应如当依次释放C-末端氨基酸时肽中间的裂解，因此可以在接近室温的温和温度条件下进行化学处理其本身，不需要加热或冷却的任何精确温度控制。另外，本发明最终目的在于广泛应用该方法分析肽的C-末端氨基酸序列，更具体地，旨在提供一种按照用于从肽上释放C-末端氨基酸的反应的所述新方法依次释放C-末端氨基酸的处理的试剂盒，其专门用于本发明的分析方法中。
本发明人不断地进行深入研究和检验以便解决上述问题。结果，得出结论，在加热条件下，例如90℃，使用高浓度的全氟链烷酸的水溶液以使从那里产生的全氟链烷酸蒸汽作用在干燥的肽上的所述方法的情况下所见的不希望有的副反应，其发生是因为从高浓度的全氟链烷酸水溶液蒸发的全氟链烷酸以及水分子的蒸汽存在于反应系统中，例如在肽的丝氨酸残基[NH-CH(CH2OH)-CO-]处，在所述加热条件下促进它α-位的氨基(-NH-)和它β-位的羟基(-OH)之间的N，O-酰基重排反应，借助于在反应系统中共存的水分子也促进了由此形成的酯的水解。同时，在该方法中，其中在冷却条件下，例如在-18℃下使用全氟链烷酸酐的乙腈溶液以使从那里产生的全氟链烷酸酐的蒸汽作用在干燥的肽上，已经证实尽管在反应系统中不存在水分子，全氟链烷酸酐本身这样的高反应性引起相对于处理温度的升高不希望有的副反应的频率迅速增大。
基于上述发现，本发明人搜索这样的反应条件，即不使用任何作为供应水分子给反应系统的来源的水溶剂，并且另外不使用任何具有象全氟链烷酸酐这样高反应性的试剂，从肽的C-末端氨基酸可以形成作为反应中间体的噁唑酮环结构，然后与噁唑酮环的裂解结合可以完成选择性释放C-末端氨基酸的反应。结果，发现使用通过向链烷酸酐中加入少量全氟链烷酸而获得的混合物，当使来自混合物的均是汽相的全氟链烷酸和链烷酸酐作用在干燥的肽上时，即使在如60℃或更低的处理温度下，可以进行噁唑酮环结构的形成，随后接着是从那里选择性释放C-末端氨基酸的反应，其是由该噁唑酮环的裂解导致。还发现与全氟链烷酸酐相比，即使在与全氟链烷酸共存时，由于链烷酸酐的反应性显著温和，它完全不能导致肽中间的任何裂解。具体地解释，在全氟链烷酸共存的情况下，链烷酸酐作用在存在于肽的丝氨酸残基[-NH-CH(CH2OH)-CO-]或苏氨酸残基[-NH-CH(CH(CH3)OH)-CO-]上的羟基上，优先进行O-酰化反应，导致竞争性地抑制N，O-酰化重排反应。还发现，同时进行N-末端氨基的N-酰化反应，并且还进行例如赖氨酸残基[-NH-CH(CH2CH2CH2CH2NH2)-CO-]的ε-位的氨基的N-酰化反应和酪氨酸残基[-NH-CH(CH2-C6H4-OH)-CO-]的酚式羟基的O-酰化反应。结果，发现由于反应性官能团如侧链上的羟基或氨基经历保护和修饰，所述反应性官能团在重排反应如引发在肽中间裂解的N，O-酰基重排反应中涉及，避免了不希望有的副反应，并且在例如60℃或更低的处理温度下，只选择性地进行其中从C-末端氨基酸形成作为预期反应中间体的噁唑酮环结构的反应，随后接着是与噁唑酮环裂解结合的释放C-末端氨基酸的反应。基于上述发现，本发明人已经完成本发明。
因此，按照本发明的分析肽的C-末端氨基酸序列的方法是一种用于分析被检验的肽的C-末端氨基酸序列的方法，该方法包含以下步骤通过化学方法从被检验的肽顺序释放C-末端氨基酸以制备包含其一系列反应产物的混合物，将一系列反应产物和初始的肽进行质谱分析以测量与其C-末端氨基酸的依次释放相关的分子量的减少，和基于测量的分子量的一系列减少，鉴定依次去除的一系列氨基酸，并排列从C-末端鉴定的氨基酸以获得肽的C-末端氨基酸序列的信息，其中在释放C-末端氨基酸的步骤中所用的处理技术是包含以下步骤的方法在干燥气氛中，在15-60℃范围内选择的温度下，使来自包含链烷酸酐和向其中加入的少量全氟链烷酸的混合物的汽相链烷酸酐和全氟链烷酸作用在被检验的肽的干燥样品上；和进行C-末端氨基酸的释放，其与在肽的C-末端形成5-噁唑酮结构接着裂解5-噁唑酮环的过程结合，所述5-噁唑酮结构由下列通式(III)表示 其中R1是肽的C-末端氨基酸的侧链，R2是刚好位于C-末端氨基酸之前的氨基酸残基的侧链。
另外，作为包含在通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐而获得的所述混合物中的链烷酸酐，优选使用含有2-4个碳原子的链烷酸的对称酸酐。其中，作为所述对称的酸酐，优选含有2-4个碳原子的直链链烷酸的对称酸酐，特别是，适当使用乙酸酐。同时，作为所述全氟链烷酸，优选使用pKa在0.3-2.5范围内的全氟链烷酸。作为全氟链烷酸，可以适当地使用例如含有2-4个碳原子的全氟链烷酸，在剩余的中间，含有2-4个碳原子的直链全氟链烷酸是更适合的。在通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐获得的所述混合物中，理想地在相对于链烷酸酐和全氟链烷酸的总体积的1-20％的体积范围内选择全氟链烷酸的含量。
在使用通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐而获得的所述混合物的处理中，优选所述干燥气氛是其中已经去除氧和水的状态。特别是，更优选干燥气氛是通过将其内部空气抽真空在气密容器内部实现的。另外，在使用通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐而获得的所述混合物的处理中，更优选将温度设置为在15-50℃范围内选择的温度。
在本发明的分析方法中，除了使用通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐而获得的所述混合物的处理步骤以外，可以提供方法另外的水解处理步骤，其包含以下步骤在干燥状态中对包含一系列反应产物的混合物实施去除其中残留的链烷酸酐和全氟链烷酸的后处理，所述反应产物是在依次释放C-末端氨基酸的所述步骤中获得的，然后，进料均是汽相的、碱性的含氮芳环化合物或叔胺化合物和水分子，两者都是通过使用其中溶解碱性的，含氮芳环化合物或叔胺化合物的水溶液而提供的，在所述碱性的，含氮有机化合物的存在下使水分子作用在肽的反应产物上，和在所述水解处理后，在再干燥的后处理之后接着干燥，所述再干燥的后处理是通过去除残留在包含一系列反应产物的混合物中的碱性的，含氮有机化合物和水分子来进行的。
另外在本发明的分析方法中，除了使用通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐而获得的混合物的所述处理步骤以外，在依次释放C-末端氨基酸的步骤之前，可以提供方法以另外的预处理步骤，其是使用来源于构成所述链烷酸酐的链烷酸的酰基对被检验肽的N-末端氨基预先实施N-酰化保护。
通过使用一项技术可以进行对N-末端氨基实施N-酰化保护的预处理步骤，所述技术中肽的氨基的N-酰化是在干燥气氛中在选自10-60℃范围的温度下，通过使来自通过将少量链烷酸加入链烷酸酐而获得的混合物的均是汽相的链烷酸酐和链烷酸作用在被检验的肽的干燥样品上实现的。在该情形中，作为在对N-末端实施N-酰化保护的预处理步骤中所用的链烷酸酐和作为在其后进行的依次释放C-末端氨基酸的步骤中所用的链烷酸酐，使用的可以是相同的链烷酸酐。
本发明还提供制备混合物的方法，所述混合物包含通过使用化学方法从目标肽依次释放C-末端氨基酸可获得的一系列反应产物，其相当于包含在按照本发明分析肽的C-末端氨基酸序列的上述方法中的最典型的步骤；即用于制备混合物的本发明的方法，所述混合物包含通过使用化学方法从肽依次释放C-末端氨基酸可获得的一系列反应产物，所述方法被定义为一种制备混合物的方法，所述混合物包含通过使用化学方法从目标肽依次释放C-末端氨基酸可获得的一系列反应产物，其中进行所述方法以制备混合物，其包含通过化学方法从肽依次释放C-末端氨基酸可获得的一系列反应产物，所述化学方法包含以下步骤在干燥气氛中，在选自15-60℃范围的温度下，使来自链烷酸酐和向其中加入的少量全氟链烷酸的混合物的均是汽相的链烷酸酐和全氟链烷酸作用在目标肽的干燥样品上，和进行C-末端氨基酸的释放，其与在肽的C-末端形成5-噁唑酮结构接着裂解5-噁唑酮环的过程结合，所述5-噁唑酮结构由下列通式(III)表示 其中R1是肽的C-末端氨基酸的侧链，R2是刚好位于所述C-末端氨基酸之前的氨基酸残基的侧链。
另外，本发明提供处理试剂盒，其可专门用于按照本发明依次释放C-末端氨基酸的所述处理技术；即，用于依次释放C-末端氨基酸的处理的本发明试剂盒被定义为一种用于处理反应以通过化学方法从目标肽依次释放C-末端氨基酸的试剂盒，其中用于依次释放C-末端氨基酸的处理的试剂盒是下列组合组成的试剂盒作为依次释放C-末端氨基酸的反应的液体试剂，至少通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐获得的混合物，或分开地组合链烷酸酐和全氟链烷酸以制备混合物，其中容纳被检验目标肽的样品的样品容器，和配有容纳液体试剂的系统的反应器容器，所述中能够储备所述液体试剂，并能够保持该状态以使所述液体试剂不与装在样品容器中的所述肽样品直接接触，并且具有将所述样品容器容纳在里面的容量。
图1是工艺流程图，其举例说明在按照本发明从肽连续释放C-末端氨基酸的处理中使用的详细方法的实例。
图2显示在反应产物的混合物的质谱分析中观察到的谱的实例，所述反应产物是按照从肽依次释放C-末端氨基酸的本发明的处理方法，通过从血管紧张素I肽依次释放C-末端氨基酸而获得的。
图3显示在反应产物的混合物的质谱分析中观察到的谱的另一实例，所述反应产物是按照从肽依次释放C-末端氨基酸的本发明的所述处理方法，通过从血管紧张素I肽依次释放C-末端氨基酸而获得的。
图4显示在反应产物的混合物的质谱分析中观察到的谱的另外实例，所述反应产物是按照从肽依次释放C-末端氨基酸的本发明的处理方法，通过从血管紧张素I肽依次释放C-末端氨基酸而获得的。
实施本发明的最佳方式以下将更详细地解释本发明。
按照本发明的分析肽C-末端氨基酸序列的方法基本上使用这样的技术，其包含以下步骤从肽依次释放C-末端氨基酸以制备含有相对于被检验肽的截短的肽链的一系列反应产物，和基于反应产物的一系列分子量和初始肽的分子量之间的差异，鉴定从那里释放的氨基酸。更具体地，该方法使用质谱分析作为测量一系列反应产物的分子量和初始肽的分子量的方法，其中，优选使用飞行时间类型的质谱仪，例如MALDI-TOF-MS系统，其非常适于在例如在电离步骤中，未发生从组成肽的氨基酸残基去除含有原子部分的片段的条件下进行的测量。
同时，在本发明分析方法中最典型的特征是在从肽依次释放C-末端氨基酸的步骤中，该方法使用这样的处理，其包含以下步骤在干燥气氛中，在选自15-60℃范围内的温度下，使来自链烷酸酐和向其中加入的少量全氟链烷酸的混合物的均是汽相的链烷酸酐和全氟链烷酸作用在目标肽的干燥样品上，和进行C-末端氨基酸的释放，其与在肽的C-末端形成5-噁唑酮结构接着裂解5-噁唑酮环的过程结合，所述5-噁唑酮结构由下列通式(III)表示 其中R1是肽的C-末端氨基酸的侧链，R2是刚好位于所述C-末端氨基酸之前的氨基酸残基的侧链。
形成所述5-噁唑酮环的反应总体上通过下列反应图解(I)表示
特别是，在按照本发明选择性释放C-末端氨基酸的方法的情形中，首先，在由下列反应式(Ia)表示的酮-烯醇互变异构阶段， 通过选择在干燥气氛中，在选自15-60℃范围内的温度下，使均是汽相的并且来自通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐而获得的混合物的链烷酸酐和全氟链烷酸作用在干燥的肽上的步骤，通过使汽相的全氟链烷酸作为针对干燥的肽的质子供体提高了保持烯醇状态的比率。
然后，在烯醇类型中暴露的羟基和C-末端羧基之间形成分子内酯键，以完成5-噁唑酮环的形成。在另一方面，在常规方法的情况下，在其中通过加热至例如90℃，从高浓度的全氟链烷酸水溶液中产生的均是汽相的全氟链烷酸和水分子并且共存的状态下形成分子内酯键。预计同样在该酯化反应中，汽相的全氟链烷酸作为质子供体来诱导在酸催化剂下进行的酯化反应。然而，由于反应是在无溶剂的固相中进行，设置高反应温度。同时，在按照本发明选择性地释放C-末端氨基酸的方法中，将链烷酸酐用作活化C-末端羧基的试剂；发生转化成不对称酸酐的情况，如例如由下列反应式(Ib)举例说明 因此，反应涉及活化的C-末端羧基。结果，该反应可以在温和的温度条件下进行，反应温度可以在15-60℃的范围内选择。附带地，优选选择该反应温度为接近室温或稍微高于室温的温度范围，更具体地，更优选在15-50℃的范围内。
同时，在按照本发明选择性释放C-末端氨基酸的方法中，至于其中所用的全氟链烷酸，利用它的质子给予能力，因此优选使用pKa在0.3-2.5范围内的全氟链烷酸。另外，由于该全氟链烷酸需要以汽相形式提供给干燥的肽，优选选择挥发性优越的全氟链烷酸以便在选自15-60℃的范围内的所述温度下获得所需的蒸汽压。同样从这个观点，含有2-4个碳原子的全氟链烷酸更适合，含有2-4个碳原子的直链全氟链烷酸更加适合。具体地，更期望使用三氟乙酸(CF3COOH)，五氟丙酸(CF3CF2COOH)或七氟丁酸(CF3CF2CF2COOH)。
在另一方面，随着反应的进行用作活化剂的链烷酸酐被消耗；因此，期望在将以汽相提供的链烷酸酐的蒸汽压保持在给定水平的同时进行反应。适合该目的的方法的实例包括这样的方法以便将反应系统保持在密封状态中，由此稳定存在系统中的链烷酸酐的蒸汽压。更具体地，例举这样一种方法，其中将通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐而获得的液体混合物放置在可密封的反应器中；一度将液体混合物冷却以降低它的蒸汽压；在该状态下，抽空反应器内部，然后密封；通过加热至反应温度在反应器中将链烷酸酐汽化。通过使用该方法，存在另外的优势，即可以防止水泄漏到反应器中。另外，当进行抽空以致在反应系统中未残留氧气时，例如，可以防止存在于甲硫氨酸中的硫被氧所氧化和因此导致的它分子量的改变，所述甲硫氨酸包括在组成被检验的肽的氨基酸的残基中。在基于测量分子量的本发明的方法中，更优选这样的氧化抑制以获得更高的准确度。
顺便提及，例如，当被检验的肽包含多个在相邻肽的半胱氨酸之间形成它氧化类型的-S-S-键或在一个肽分子内形成-S-S-键的半胱氨酸时，预先实施常规还原处理以消除这样的键合，由此将肽转化成包含还原形式的半胱氨酸的肽。另外，为了保护它，向存在于肽中的还原形式的半胱氨酸实施例如对它侧链上的巯基(-SH)的羧甲基化或吡啶基乙基化。
只要当加热到反应温度时它们可以产生适当的蒸汽压，多种链烷酸酐可适用为其中所用的链烷酸酐。同时，当反应温度在上述优选范围，例如15-50℃内选择时，优选产生足够蒸汽压的链烷酸酐。因此，优选使用含有2-4个碳原子的对称的链烷酸酐。其中，作为对称酸酐，更优选使用含有2-4个碳原子的直链链烷酸酐的对称酸酐，特别是，适当地使用含有2个碳原子的直链链烷酸，即乙酸的对称酸酐。因为该链烷酸酐用于C-末端羧基的活化，优选酐产生最小的位阻，在这方面上述提及的乙酸等也非常适合。
在所述释放氨基酸的反应中，使链烷酸酐和全氟链烷酸以各自的蒸汽状态作用在干燥的肽上。在干燥的气氛中进行反应以便避免一度形成的5-噁唑酮环被从系统外部进入的水所水解和它恢复到初始结构。在这方面，期望反应通常在密闭反应器中进行。顺便提及，最初注入反应器的链烷酸酐和全氟链烷酸的混合物在室温下是液体混合物，其中链烷酸酐和全氟链烷酸被均匀地混合。在包含链烷酸酐和向其中加入的少量全氟链烷酸的该混合物中，原则上在反应期间不消耗作为催化剂的全氟链烷酸，因此它的含量可以是少量。更具体地解释，与共存的链烷酸酐的蒸汽相比，存在于汽相中的全氟链烷酸的蒸汽可以是相对低的浓度。换句话说，取决于所用链烷酸酐和全氟链烷酸的种类，例如在反应温度下各自的饱和蒸汽压，适当地选择具有可以获得期望分压比率(汽相的浓度比)的混合比率的液体混合物。期望在包含链烷酸酐和向其中加入少量全氟链烷酸的混合物中的全氟链烷酸的含量选自，例如相对于链烷酸酐和全氟链烷酸的总体积，在1-20％体积，优选3-10％体积的范围内。
在按照本发明选择性释放C-末端氨基酸的方法中，得出结论，从一度形成的5-噁唑酮环，例如通过如下列反应式(II’)所示的这样的反应 可以进行C-末端氨基酸的分离和用于下一阶段的反应中间体的形成，结果，以此方式进行C-末端氨基酸的连续释放。因此，在完成该反应后获得的反应产物是混合物，其包含除了含有在C-末端暴露的羧基的那些以外，如上述反应式(II)所示，具有5-噁唑酮环结构的中间产物和一种形式的反应中间体，其中它的C-末端被转化成不对称酸酐的形式。
用至少两步元反应，即一步如反应式(Ib)阐明的5-噁唑酮环结构的形成，和一步如反应式(II’)阐明的通过裂解5-噁唑酮环结构分离C-末端氨基酸，建立在选择性释放C-末端氨基酸的处理步骤中所用的连续反应。因此，总反应速率取决于两步的反应速率，但是主要取决于因此使用的链烷酸酐和全氟链烷酸的分压(汽相中的浓度)以及其中的反应温度。另外，作为通过连续反应形成的一系列反应产物，随着处理时间变长，可以在获得的一系列反应产物中得到的去除的C-末端氨基酸序列的最大长度变长。因此，需要适当地选择以这样连续的方式选择性地释放C-末端氨基酸的处理步骤的处理时间，其主要取决于链烷酸酐和全氟链烷酸的分压(汽相中的浓度)和因此使用的反应温度，和也考虑到被分析的C-末端氨基酸序列的期望长度。
可以安排另外的末端水解处理以便将在C-末端不含暴露的羧基的反应中间体的形式，如上述反应式(II’)所示，其在以这种连续的方式选择性地释放C-末端氨基酸的处理步骤过程中形成，转化成在C-末端含有暴露的羧基的形式。因此，在选择性释放C-末端氨基酸的本发明的方法中，优选除了使用通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐获得的混合物的所述处理步骤以外，提供具有另外水解处理步骤的方法，所述水解处理包含以下步骤以干燥状态对包含在所述依次释放C-末端氨基酸的步骤中获得的一系列反应产物的混合物实施去除其中残留的链烷酸酐和全氟链烷酸的后处理，然后，进料通过使用其中溶解碱性的含氮芳环化合物或叔胺化合物的水溶液提供的均是汽相的碱性含氮芳环化合物或叔胺化合物和水分子，在所述碱性含氮有机化合物存在的条件下使水分子作用在肽的反应产物上，和在所述水解处理之后，再干燥的后处理之后接着进行干燥，所述再干燥的后处理是通过去除均残留在包含一系列反应产物的混合物中的碱性含氮有机化合物和水分子来进行的。通过应用该后处理，反应产物开始成为在C-末端含有暴露的羧基的形式。这些形式在其后进行的质谱分析中产生主峰，其使根据其峰强度用对应于一系列反应产物的分子量鉴定峰的操作更容易。
均是汽相的碱性含氮芳环化合物或叔胺化合物没有能力与例如保持其中它的C-末端已经变成不对称酸酐的这样的形式的产物反应或与其形成任何酰胺键；另外，当制备其水溶液时，碱性含氮芳环化合物或叔胺可以制成均匀溶液；优选其特征适于水解处理的使用。作为可以使用的碱性含氮芳环化合物，优选可以产生适当蒸汽压的单环含氮芳环化合物，例如更适合使用吡啶。作为可以使用的叔胺化合物，优选具有与吡啶所示相同弱碱性的一种，例如可以适当地使用DMAE[(CH3)2N-CH2CH2OH]。当例如使用吡啶时，相对于其水溶液总体积，优选吡啶含量在5-15％体积的范围，更具体地10％体积选择。当使用二甲氨基乙醇(DMAE)时，相对于其水溶液总体积，优选DMAE含量为1-20％体积，更具体地10％体积。
使蒸汽状态的单环含氮芳环化合物或叔胺化合物与水分子一起作用在包含反应产物的干燥的混合样品上。在该后处理中，还期望反应在密封反应器中进行。在所述后处理中，由于使用水分子，需要将它的蒸汽压设置在某一水平或更高。因此，处理温度理想地选自例如60℃或更高的温度，当考虑反应器的机械强度时，在100℃或更低的范围内。为了迅速完成水解的处理，期望选择100℃或稍低的这样的温度。
此外，在按照本发明选择性释放C-末端氨基酸的方法中，除了使用通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐获得的混合物的处理步骤以外，可以在依次释放C-末端氨基酸的所述步骤之前，向该方法提供预处理的步骤，该预处理是使用来源于构成所述链烷酸酐的链烷酸的酰基对被检验肽的N-末端氨基预先实施N-酰化保护。具体地解释，在使用通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐获得的混合物的所述处理步骤中，推测形成其中肽的C-末端羧基被活化的反应中间体。当该反应中间体与相邻肽的N-末端氨基反应与之形成酰胺键时，未获得期望的具有截短的肽链的反应产物。因为反应本身是在固相中进行，该偶然的副反应的频率不是很高。然而，期望预先实施N-酰化以防止副反应。
另外，在使用通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐获得的混合物的所述处理过程中，肽的N-末端氨基通常经历通过链烷酸酐的N-酰化，因此在反应系统中发生N-酰化保护；然而，更理想的是进行旨在N-酰化保护的预处理。
通过使用一项技术可以进行对N-末端氨基实施N-酰化保护的预处理步骤，在所述技术中，在干燥气氛中，在10-60℃的温度下通过使来自通过将少量链烷酸加入链烷酸酐而获得的混合物的均是汽相的链烷酸酐和链烷酸作用在被检验的肽的干燥样品上实现肽的氨基的N-酰化。在该情形中，优选在对N-末端实施N-酰化保护的预处理步骤中所用的链烷酸酐和作为在其后进行的依次释放C-末端氨基酸的步骤中所用的链烷酸酐是相同的链烷酸酐。具体地解释，在对N-末端氨基实施N-酰化保护的预处理反应中，通过向干燥的肽样品提供均是蒸汽状态的链烷酸酐和链烷酸使反应进行；因此，为了获得其适当的蒸汽压，可以适当地使用与在其后进行的依次释放C-末端氨基酸的步骤中使用的链烷酸酐相同的链烷酸酐。另外，因为在干燥气氛中在10-60℃的温度下，链烷酸的反应性太低以致不能导致不希望有的副反应，如肽的裂解，另外由于一起使用的链烷酸在酸催化活性方面显著劣于全氟链烷酸，在预处理中该组合可以提供N-酰化保护给N-末端氨基，具有小得多的引起不希望有的副反应的可能性。
另外，在对肽的N-末端氨基的N-酰化保护步骤中，还同时进行对存在于肽中的赖氨酸残基侧链上的ε-氨基的N-酰化保护。另外，还进行对存在于肽中的丝氨酸和苏氨酸残基侧链上的羟基的O-酰化，由此进行其保护。此外，存在于肽中的酪氨酸残基测链上的酚式羟基也进行部分O-酰化，尽管它的反应性不同。作为其中也发生多个这些酰化保护的预处理步骤的结果，赖氨酸残基侧链上的氨基和丝氨酸以及苏氨酸残基侧链上的羟基全都被保护基团修饰，不再参与不希望有的副反应。同样从这个观点来看通常优选预先进行向肽的N-末端氨基实施N-酰化保护的预处理步骤。
顺便提及，在预处理步骤中组合使用链烷酸酐和链烷酸的过程中，基本上不担心不希望有的副反应，例如肽中间的裂解。然而，优选预处理温度选自10-60℃的范围内，更优选大约室温或稍微高于室温的温度范围内，更具体地在15-50℃的范围内。在另一方面，相对于链烷酸酐和链烷酸总体积，优选在通过将少量链烷酸加入链烷酸酐获得的混合物中的链烷酸含量在2-10％体积的范围内选择，特别是5％体积。
此外，优选以与选择性释放C-末端氨基酸的步骤的上述方法非常类似的方式来进行预处理步骤中反应的程序。即，上述操作程序和适于选择性释放C-末端氨基酸的步骤的条件也适合于预处理步骤中的所述反应步骤。顺便提及，在预处理步骤中的N-酰化反应速率取决于所用链烷酸酐和链烷酸的分压(汽相中的浓度)以及反应温度；因此，期望适当地选择预处理步骤的反应时间，其主要取决于反应温度。当反应温度选择为例如50℃，反应时间选择为1小时内，例如30分钟，由此可以完成对肽的N-末端氨基的N-酰化。在该情形中，更优选加入催化量，例如相对于链烷酸酐和链烷酸总体积0.1-1.0％体积的吡啶，以便增强使用链烷酸酐和链烷酸的酰化反应。由于该吡啶碱起质子受体的作用，例如，更迅速地进行与对氨基的酰化相关的被消除的质子的去除。
更优选地，以其中全部包括预处理步骤，选择性释放C-末端氨基酸的反应步骤和后处理步骤的这样的方式实施按照本发明选择性释放C-末端氨基酸的方法。在图1中举例说明这样的步骤流程图的实例。当每步已经完成时在所述流程中进行干燥操作，以使在每步中使用的试剂不残留在肽样品中。这个干燥操作通常是通过真空蒸馏进行的，由此有时还可以去除在所述反应中为副产物的释放的C-末端氨基酸。图1的步骤流程图举例说明了其中将极高纯度的高效乙酸酐用作其中所用的链烷酸酐的实例。
在另一方面，在图1阐明的步骤流程图中，关于选择性释放C-末端氨基酸的反应步骤中的处理时间，所阐明的是处理时间的范围，其选择是取决于所用的乙酸酐和氟代链烷酸的比例和使用的处理温度，对于其中期望在所述步骤中被截短的C-末端氨基酸序列的氨基酸长度在最大情形下为10多个氨基酸和在最小情形下为3个氨基酸的典型情形而言。通常，当氟代链烷酸的比例较大和处理温度较高时，反应速率较高，由此可以在更短的处理时间内制备已经获得设定为目标的最大的氨基酸序列截短长度的一系列反应产物。
另外，在预处理步骤中，通过使用均是汽相的乙酰酐和乙酸进行对肽N-末端氨基的N-乙酰化。即使在乙酸酐和乙酸的该组合的情形中，也有时担心，可能非常小，发生由上述反应式(Ia)表示的C-末端羧基的活化反应和由此导致的副反应。为了抑制该副反应，可以允许共存少量吡啶蒸汽以在吡啶碱和肽的C-末端羧基之间形成弱加成盐，其可以提供保护效应防止不希望有的副反应的发生。这样的加成盐形成类型的保护容易进行脱保护，其是在完成预处理步骤后通过进行干燥操作以在真空下馏出吡啶碱来进行的，在选择性释放C-末端氨基酸的下一反应步骤中未出现问题。从这些观点来看，为了保护加成盐形成类型，优选加入少量含氮杂环芳香化合物，其可以在减压下容易地馏出并具有弱碱性，如吡啶。另外，由于加成盐形成类型的保护还具有对氨基酸侧链上的羧基的保护功能，它甚至可以同时有效防止源于氨基酸侧链上的羧基的不希望有的副反应。
在分析肽C-末端氨基酸序列的本发明的方法中，通过参考质谱分析测量的数据确定通过依次释放C-末端氨基酸制备的一系列反应产物的分子量和初始肽的分子量，并存在对应于其分子量差异的鉴定的氨基酸。因此，通常期望初始肽以能够测定它分子量的这样的量残留在进行质谱分析测量的混合物中。
具体地解释，用于分析肽C-末端氨基酸序列的本发明的方法可以用于其中C-末端氨基酸序列分析的最大长度长至10和10多个氨基酸的这样的情形。关于作为最大的情形，其分类相应地达到10和10多个数字的系列反应产物的含量，期望最小含量的反应产物的含量至少不小于最大含量的反应产物含量的约1/10。另外，还期望初始肽的残留量至少不少于最大含量的反应产物含量的约1/10。同时，在许多情形中所需C-末端氨基酸序列的信息在10个氨基酸之内，当选择其中大约10个氨基酸可以被释放的处理时间时，可以满足关于含量的上述要求。
同时，将质谱分析用于分子量的测量。更适合使用装备在该条件下运作良好的这样的电离装置以便抑制断裂的质谱分析仪进行测量，所述断裂导致在其中的电离步骤中部分来自组成肽的氨基酸残基的原子部分的分离。另外，由于肽等具有高分子量，优选使用飞行时间类型的质谱仪，例如MALDI-TOF-MS系统，其适合在该高分子量范围内的测量。然而，即使当使用这种类型的质谱仪时，对于允许有效电离的分子量存在上限，因此期望可能进行测量的肽的最大氨基酸不超过20-30个氨基酸的限度。另外，基于测量的分子量差异鉴定相应的氨基酸；因此，为了高精密度地从彼此区别产生1的分子量差异的两个氨基酸残基，例如Asn对Asp，或Gln对Glu，优选用作基准点的最长的肽，即从那里未释放C-末端氨基酸的肽在不超过3,000的范围内，更优选在不超过2,000的范围内。当转换成氨基酸时，优选它的长度最长为30个氨基酸，更优选在不超过20个氨基酸的范围内。
当将分析肽C-末端氨基酸序列的本发明的方法用于具有远超过上述限制的氨基酸长度的肽例如蛋白质时，期望在进行质谱分析之前，通过使用例如具有氨基酸序列裂解位点特异性的蛋白酶进行肽的特异性裂解的处理，以使获得的C-末端肽片段具有在上述范围内的氨基酸长度。即，当将相同的位点特异性的裂解处理应用到初始肽和从那里制备的一系列反应产物时，产生的C-末端肽片段是具有相同N-末端氨基酸但其C-末端氨基酸不同的一系列肽片段。通过使用包含该系列的肽片段的混合物，通过质谱分析的方法鉴定它们的分子量，可以利用分析肽C-末端氨基酸序列的本发明的方法。
然而，当将本发明的分析方法应用到如蛋白质的长肽时，在该情形中，在长肽中，由于蛋白质折叠在半胱氨酸残基之间形成-S-S-键，必须预先将-S-S-键还原以消除半胱氨酸残基之间的桥连；此外，通过羧甲基化等修饰半胱氨酸的还原形式以保护侧链上的巯基(-SH)。同样，在构成二级结构如与蛋白质折叠相关的α-螺旋的区域中，组成酰胺键的氨基酸残基的羰基(C＝O)和亚氨基(-NH-)处于形成分子内氢键的状态。当被保持在该形成分子内氢键的状态中时，可以抑制本发明中使用的反应的进行。考虑到此，期望预先处理肽以转化成其中至少在其C-末端部分不构成二级结构的状态，例如被去折叠处理，其后进行该肽样品的干燥，然后向其实施上述的化学处理。当肽是处于被去折叠处理的形式时，例如，在这样的情形下以致在一系列化学处理步骤已经完成后，在质谱分析的步骤之前需要使用蛋白酶等位点特异性裂解肽，它具有这样的优势以致其中获得的C-末端肽片段通常易于分离。
在用于分析肽的C-末端氨基酸序列的本发明的方法中，基于分子量差异鉴定依次释放的氨基酸。因此，原则上不能区分具有相同分子量的亮氨酸(Leu)残基和异亮氨酸(Ile)残基，其与使用质谱法分析C-末端氨基酸序列的常规方法相同。在另一方面，在释放C-末端氨基酸的反应中，酰胺键转化成烯醇形式和随后形成5-噁唑酮环结构是基本的，如反应式(Ib)所示，因此当其中不存在与羰基(C＝O)一起形成酰胺键的任何亚氨基(-NH-)的环状氨基酸脯氨酸(Pro)已经变成C-末端氨基酸时，不发生释放的进一步反应。换句话说，通过证实即使当处理时间延长时也不发生进一步的C-末端氨基酸的消除，可以预测该阻止的主要因素的氨基酸残基是环状氨基酸脯氨酸(Pro)。
本发明制备包含一系列反应产物的混合物的方法相当于在适于上述解释的分析肽的C-末端氨基酸序列的本发明方法的选择性释放C-末端氨基酸的反应步骤中所用的技术，所述反应产物可以通过使用化学方法从肽依次释放C-末端氨基酸获得。因此，实施方法的优选方式与先前所述相同。该技术不仅可以应用于线性肽来制备用于测定其C-末端氨基酸序列的样品，而且用于环肽以制备用于测定其氨基酸序列的样品，其中通过开环，预先将环肽转化成线性肽形式，其被进行它的C-末端氨基酸序列的测定。具体解释，例如各种微生物生产具有生物活性的环肽类型的化合物，并且可以将所述技术用于制备样品，其用于测定该化合物结构。
即使在用于制备混合物的本发明的所述方法中，所述混合物包含通过使用化学方法从肽依次释放C-末端氨基酸可以获得的一系列反应产物，例如，当存在肽中的丝氨酸残基[-NH-CH(CH2OH)-CO-]和苏氨酸残基[-NH-CH(CH(CH3)OH)-CO-]上的羟基发生N，O-酰基重排时，其随后导致分支，与酰胺键相比，其中的酯键更容易进行裂解。然而，由于均是汽相的链烷酸酐和全氟链烷酸的作用，优选进行在它们侧链上的羟基的O-烷酰基化，其有效地实现了对N，O-酰基重排的竞争性抑制。顺便提及，当进行后处理步骤时，与对于酚式羟基的酯键相比，对于醇式羟基的酯键进行水解更快，因此在最终获得的反应产物中保留高选择性，对于N-末端氨基只N-烷酰基化，对于赖氨酸残基[-NH-CH(CH2CH2CH2CH2NH2)-CO-]ε-位的氨基N-烷酰基化，有时，对于酪氨酸残基[-NH-CH(CH2-C6H4-OH)-CO-]的酚式羟基还有O-烷酰基化。
例如，当许多乙酰化形式的丝氨酸残基和苏氨酸残基被包括在最终获得的反应产物中时，在该多乙酰化产物和脱乙酰化产物之间的分子量差异被排列成分子量42的整数倍，特别地84，126和168别接近于丝氨酸残基[-NH-CH(CH2OH)-CO-]的分子量87，谷氨酰胺残基[-NH-CH(CH2CH2-CONH2)-CO-]的分子量128或谷氨酸残基[-NH-CH(CH2CH2-COOH)-CO-]的分子量129和N-乙酰赖氨酸残基[-NH-CH(CH2CH2CH2CH2NH-COCH3)-CO-]的分子量170。因此，有一些担心多乙酰化的产物的峰可能被错当成主峰，脱乙酰的产物可能被错指定为释放该氨基酸从那里衍生的产物。然而，实际测量是以这样的分析精确度进行以致可以区别分子量仅差1的谷氨酰胺残基和谷氨酸残基；因为与剩余乙酰基的数量差异相关的分子量差异与显示类似分子式的氨基酸残基的分子量相差至少2-3的分子量差异，上述这种错配的可能性在很多情形下不高。然而，优选进行后处理以消除这些不受欢迎的烷酰基剩余物。
用于处理以依次释放C-末端氨基酸的本发明的试剂盒是组合反应容器和一组试剂的试剂盒，所述试剂可以在适于所述反应容器的反应条件下使用，该试剂盒可以适用于专门用于前述制备混合物的本发明的方法的反应，所述混合物包含通过使用化学方法从肽依次释放C-末端氨基酸可以获得的一系列反应产物。用于所述反应的该组试剂包括，作为用于依次释放C-末端氨基酸的反应的液体试剂，至少一种混合物，其是通过少量全氟链烷酸对链烷酸酐，或分开地链烷酸酐和全氟链烷酸组合制备混合物而获得的。因为相同类型的反应器还可以用于预处理步骤以及上面解释的后处理步骤，可以装配试剂盒以另外包含在预处理步骤中和后处理步骤其中所用的试剂。优选试剂盒选择组合物和使用适合于上述解释的反应条件的这些试剂的量。
关于容纳被处理的目标肽样品的样品容器，因为其中进料包含肽样品的溶液，然后进行干燥的处理，其后进行期望的处理，样品容器可以以用于冷冻干燥处理的微型瓶或用于同时处理多个肽样品的多孔平板类型的形式形成。
可以向反应容器提供容纳液体试剂的系统，其能够储备用于所述反应的液体试剂或者每种液体试剂分别结合在其组成试剂盒中，能够向容纳在所述样品容器中的肽样品以给定速率进料所述反应的液体试剂，并能够保持这样的状态以致避免它们彼此直接接触，并且反应容器具有容纳所述样品容器在内部的容量。优选地，以这样的形式设计反应容器以致可以抽空内部，在完成反应后在减压下可以馏去其中剩余的液体试剂，在反应期间可以使结构气密。另外，要求反应容器以这样的材料制成以致当在反应容器中产生试剂的蒸汽时，试剂和容器壁之间未发生反应。因此，适当地使用这样的容器，其通过使用在化学反应中广泛用于反应器的玻璃材料形成。对于在封闭状态操作中所用的旋塞，适当地使用由如Teflon等的材料制成的旋塞。
实施例以下通过实施例具体描述本发明。这些实施例是实施本发明的最好方式的实例，然而，本发明决不受由此阐明的这些具体的实施方案所限制。
为了证实按照本发明分析肽C-末端氨基酸序列的上述方法的有效性，对包含10个氨基酸的人血管紧张素I分析C-末端氨基酸序列。
关于人血管紧张素I，其是在本实施例中检验的肽，已知它的氨基酸序列为Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu。使用该肽，证实通过按照本发明的分析方法分析C-末端氨基酸序列的鉴定的精确度。
首先，将包含10pmol可商购的人血管紧张素I的肽溶液进料到微型瓶中并进行冷冻干燥处理。将包含干燥肽样品的小瓶放入玻璃制成的具有磨合塞子的气密试管类型的反应器，其具有装备有用于密封的Teflon-制备的旋塞阀的抽空汽门。分开地，将给定量的下列液体试剂放置在玻璃制成的反应器中。
作为预处理的试剂，使用300μl包含5％体积乙酸的乙酸酐。在已经将包含干燥的肽样品的小瓶装配在玻璃制成的反应器中以后，在冷却条件下将反应器内部抽空，然后在气密状态下密封。
将气密状态的整个反应器保持在50℃下1小时，以使来自反应器中液体试剂的均是汽相的乙酸酐和乙酸作用在干燥的肽样品上。通过使在乙酸共存下作为酰化试剂的乙酸酐作用在干燥的肽样品上，进行对于肽的N-末端氨基的选择性乙酰化。结果，肽被转化成N-乙酰化的人血管紧张素I。在该预处理已经完成后，在减压下馏去残留在反应器中的未反应乙酸酐，乙酸等，并干燥获得的N-乙酰化的人血管紧张素I。
(释放C-末端氨基酸的操作)接下来，以将装有制备的N-乙酰化的人血管紧张素I干燥样品的小瓶类似地装配在玻璃制成的具有磨合塞子的气密试管类型的反应器中的状态，再将给定量的下列液体试剂放置在玻璃制成的反应器中。
作为用于选择性释放C-末端氨基酸反应的液体试剂，使用300μl包含5％体积三氟乙酸的乙酸酐。在已经将包含干燥样品的小瓶装配在玻璃制成的反应器中以后，在冷却条件下将反应器内部抽空，然后在气密状态下密封。
将气密状态的整个反应器保持在40℃下16小时，以使来自反应器中液体试剂的均是汽相的乙酸酐和三氟乙酸作用在干燥样品上。在该情况下，因为乙酸酐在三氟乙酸的共存下起乙酰化试剂的作用，对于酪氨酸(Tyr)侧链上的酚式羟基进行O-乙酰化。同时，在肽的C-末端，进行由下列反应式(Ia)表示的酮-烯醇的互变异构，其被用作质子供体的三氟乙酸促进 并转化成不对称酸酐和形成环酯，其通过乙酸酐作用在C-末端羧基上而形式并由下列反应式(Ib)表示
由此将C-末端一度转化成5-噁唑酮结构。另外，在上述反应中副产物的乙酸(CH3COOH)或共存的三氟乙酸的帮助下噁唑环被裂解，C-末端氨基酸作为N-乙酰化的氨基酸[Ac-NH-CH(R1)-COOH]被消除，从刚好位于C-末端酸之前的氨基酸残基[-NH-CH(R2)-CO-]，它的末端羧基重新开始暴露。另外，进行下一步的反应，已经在C-末端重新暴露的前面的下一个氨基酸也被转化成5-噁唑酮结构。
因此，亮氨酸(Leu)，组氨酸(His)和苯丙氨酸(Phe)从人血管紧张素I的C-末端依次释放以得到反应产物，其中脯氨酸(Pro)暴露在C-末端。脯氨酸包含环状结构中的氨基氮；因此，当从那里形成肽键时，不发生由以上所示的反应式(Ia)表示的酮-烯醇互变异构。因此，反应不能进行进一步转化成由反应式(Ib)表示的5-噁唑酮结构。结果，在允许蒸汽相乙酸酐在三氟乙酸的共存下作用的条件下，没有选择性释放位于C-末端的脯氨酸(Pro)。即，在本实施例中获得的反应产物仅是三种截短的肽，其中亮氨酸(Leu)，组氨酸(HiS)和苯丙氨酸(PHe)已经依次释放。在另一方面，关于所述三种截短的肽的C-末端，它们是混合的状态，包括保持5-噁唑酮结构的那些，或甚至从那里被促进转化成不对称酸酐，除了被转化成羧基的那些以外。
在完成选择性释放C-末端氨基酸的处理以后，在减压下馏去残留在反应器中的未反应的乙酸酐，三氟乙酸等，并干燥残留的N-乙酰化人血管紧张素I和获得的反应产物的混合物。
接下来，以将装有N-乙酰化的人血管紧张素I和获得的反应产物的混合物的干燥样品的小瓶类似地装配在玻璃制成的具有磨合塞子的气密试管类型的反应器中的状态，再将给定量的下列液体试剂放置在玻璃制成的反应器中。
由于在上述混合物中，肽反应产物的C-末端处于混合状态，其包括保持5-噁唑酮结构的那些，或甚至从那里被促进转化成不对称酸酐，除了被转化成羧基的那些以外，后处理是旨在通过对它们实施水解处理，将它们转化成其中肽的C-末端全部变成羧基的状态的处理。即，将碱性的含氮有机化合物的水溶液用作后处理的液体试剂，使从溶液中产生的均是汽相的碱性含氮有机化合物和水分子作用在预先干燥的所述混合物上。在本实施例中，将300μl其中含有10％体积吡啶的水溶液用作水解后处理的液体试剂；在包含干燥样品的小瓶已经被置入玻璃制备的反应器中以后，在冷却条件下抽空反应器的内部，然后在气密状态下密封。
在100℃下将气密状态的整个反应器加热30分钟，以使来自反应器液体试剂的汽相吡啶和水分子作用在干燥的样品上。在吡啶碱的共存下通过水分子的作用，不对称酸酐和5-噁唑酮结构进行水解，由此它们被转化成在C-末端具有羧基的形式。还进行对于酪氨酸(Tyr)侧链上的O-乙酰化的酚式羟基的酯键水解，由此进行其部分脱乙酰化(脱保护)。同时，在N-乙酰化，即乙酰基在N-末端氨基上被取代过程中，在上述条件下未发生酰胺键的水解。因此，在后处理之后获得的反应产物是N-乙酰化的产物，其中肽的N-末端被乙酰基修饰。因此，在反应产物中，肽的N-末端被修饰以乙酰基并且C-末端具有暴露的羧基；但它们仍保持该状态以致在酪氨酸(Tyr)侧链上包含O-乙酰化的那些被部分保留。
在已完成后处理之后，在减压下馏去反应器中残留的水分子，吡啶，等；干燥N-乙酰化的人血管紧张素I和在后处理之后获得的反应产物的混合物。
(表征在后处理之后产生的反应产物)将N-乙酰化的人血管紧张素I和在后处理之后产生的反应产物的混合物进行质谱分析以测量其中包含的单个肽的分子量，所述混合物是通过进行如上所述的一系列化学处理来制备的。
在本实施例中，使用飞行时间类型的质谱仪，具体地是MALDI-TOF-MS系统，在干燥的混合物样品上(对于C1/3分析)进行主要离子种类的质量测量，其反映单个肽的分子量，和它们的相对信号强度，并随后比较它们。对于从单独预处理获得的N-乙酰化的人血管紧张素I的干燥样品，在相同条件下分别进行质谱分析以测定来自用作参比的N-乙酰化人血管紧张素I的主要离子种类的质量。
图2显示对于包含反应产物的混合物测量的质谱，通过在本实施例提及的所述化学处理方法处理所述反应产物以依次释放C-末端氨基酸。分别测量来自N-乙酰化人血管紧张素I的主要离子种类的质量，参照所述峰的测量质量，鉴定对应于图2的质谱中测量的重要的峰的反应产物。表1显示测量的峰的质量，它们与由于初始N-乙酰化人血管紧张素I导致的峰质量的差异，和基于其上鉴定的氨基酸残基，其在单独反应产物中被去除，以及各种形式的单独的反应产物。
表1
由于初始N-乙酰化的人血管紧张素I导致的峰伴随质量大约42的峰。后面的峰据判断是由于被另外的乙酰基修饰而导致，即在酪氨酸(Tyr)的侧链上具有O-乙酰化的那些。假定每个伴随质量大约42的峰的剩余的三个峰是由于其C-末端依次释放氨基酸的那些产物导致，鉴定将产生它的测量质量差异的天然存在的氨基酸残基。因为在释放这三种氨基酸后未进行另外的释放，推断从C-末端的第四个氨基酸残基是脯氨酸。顺便提及，亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)具有相同的分子量，不能在通过质谱法的分析中彼此区分；然而，在表1中，它们表示为亮氨酸(Leu)。
通过上述证实实验确认，通过进行按照本发明的选择性释放C-末端氨基酸的处理，在温和的处理条件下获得其中已从初始肽上依次去除C-末端氨基酸的一系列反应产物，并且可以高精确度地分析肽的C-末端氨基酸序列。
在本实施例中，证实即使当在依次释放C-末端氨基酸的反应期间温度轻微变化，也未发生可导致严重问题的副反应的进行，因为在按照本发明选择性释放C-末端氨基酸的处理技术中使用温和处理条件。特别是，释放C-末端氨基酸的反应使用的处理温度，其包括在实施例1中所述的一系列化学处理中，从40℃变至50℃，将在这两种情形中获得的反应产物互相比较。
对于每个操作选择与实施例1中所述的操作方法和条件相同的方法和条件，除了关于通过使用向其中加入5％体积三氟乙酸的乙酸酐的释放反应的所述温度改变以外。
图3显示对于包含反应产物的混合物测量的质谱，所述反应产物是通过以本实施例所述的化学处理的所述方式连续释放C-末端氨基酸的处理获得的。表2中总结的是对应于图3质谱中测量的重要峰的反应产物比较(assignment)的结果。图3的质谱和图2的质谱之间的比较证实即使当释放处理的温度从40℃升高到50℃，在已经从C-末端去除三种氨基酸以后未进行进一步的去除，并且未发生副反应如肽中间的裂解。
表2
在实施例1和实施例2的所述情形中，进行预处理操作以便为了保护它修饰肽的N-末端氨基。在本实施例中，证实即使当不进行预处理时，也未发生导致严重问题的副反应，因为在按照本发明的化学处理方法中，在进行依次释放C-末端氨基酸的处理步骤时，预先将所用的肽样品干燥成固相，通过提供用在反应中的均是汽相的乙酸酐和三氟乙酸促进反应。
具体解释，省略实施例1中所述的预处理，对人血管紧张素I的干燥样品进行释放C-末端氨基酸的反应操作和随后的后处理操作。在该情形下，在释放C-末端氨基酸的反应操作中，处理温度选为如实施例2的50℃。
在操作中，由于乙酸酐和三氟乙酸是以汽相提供来产生反应，除了释放C-末端氨基酸的反应以外，同时进行对肽的N-末端氨基的N-乙酰化和对酪氨酸侧链上酚式羟基的的O-乙酰化。另外，出现这样的副产物，其具有对于肽N-末端氨基和其中酪氨酸侧链上的酚式羟基的三氟乙酰基修饰，其可能归因于这样的现象，当同时作用乙酸酐和三氟乙酸时，还可发生两个之间的交换反应。
图4中显示对于包含反应产物的混合物观察到的质谱，所述反应产物是由通过如本实施例解释的所述化学处理方法连续释放C-末端氨基酸的处理产生。表3中总结的是对应于图4所示质谱中测量的重要峰的反应产物比较的结果。图4的质谱和图3的质谱之间的比较证实即使当未进行预处理时，也同时进行对肽的N-末端氨基的N-乙酰化，在已经从C-末端去除三个氨基酸以后未发生进一步的去除，并且无副反应如肽中间的裂解。顺便提及，被三氟乙酰基修饰的N-末端氨基的酰胺键在后处理中比用乙酰基修饰的那些容易地多的被部分水解；因此，观察到质量小约42的副峰，对应于其中N末端氨基未被N-酰化的反应产物。即，在实施例1和实施例2中，由于在预处理步骤中对肽的N-末端氨基进行乙酰基修饰，不存在其中N-末端氨基被代替乙酰基的三氟乙酰基修饰的反应产物；然而，在本实施例中，还形成一部分其中用三氟乙酰基修饰N-末端氨基的反应产物。在图4的谱图中，的确观察到归因于用三氟乙酰基修饰N-末端氨基的平行峰，其质量比由于具有用乙酰基修饰N-末端氨基的修饰的峰大约54。
表3
另外，明确地证实除了对肽N-末端氨基的N-乙酰化，同时进行对酪氨酸侧链上的酚式羟基的O-乙酰化。同时，由于反应在固相中进行，有效避免这样的不希望有的副反应，即在依次释放C-末端氨基酸的反应中形成的活化的反应中间体，例如不对称的酸酐，将作用在肽的N-末端氨基和酪氨酸侧链上的酚式羟基上。相反，由以均是汽相提供的乙酸酐和三氟乙酸产生的N-乙酰化和O-乙酰化迅速进行。结果，证实依次释放C-末端氨基酸的反应以这样的状态进行以致为了保护它肽已经被原位修饰。
工业适用性在按照本发明的肽C-末端氨基酸序列的分析方法中，作为依次释放肽C-末端氨基酸的方法，使用的是这样的技术，其包含以下步骤在干燥气氛中，在选自10-60℃范围内的温度下，使来自通过将少量链烷酸酐加入全氟链烷酸获得的混合物的均是汽相的链烷酸酐和全氟链烷酸作用在干燥固态的被检验的肽上，并进行C-末端氨基酸的释放，其与形成其5-噁唑酮结构，接着裂解5-噁唑酮环以制备一系列反应产物的过程结合。在该技术中，由于所用的链烷酸酐本身具有低反应性，可以在温和的温度条件，如选自15-60℃范围内的温度，优选室温或稍微高于其的温度，例如选自15-50℃的温度下依次释放肽的C-末端氨基酸，而不引起不希望有的副反应如肽中间酰胺键的裂解。就此而论，由于在肽中间无酰胺键的裂解，可以避免将由所述酰胺键裂解产生的肽片段和来源于获得的目标反应产物中的肽片段的反应产物混合。另外，在该温和条件下使用反应，可以实现更优越的氨基酸最大长度的调整和控制，所述氨基酸是为了C-末端氨基酸测序而被切离。因此，根据这些优点如优异的可控性和温和的反应条件，例如在依次释放肽的C-末端氨基酸的方法中，反应温度在广泛范围内可容许的变化，按照本发明分析肽C-末端氨基酸序列的方法符合具有广泛适用件的分析方法。
权利要求
1.一种分析被检验肽的C-末端氨基酸序列的方法，该方法包含以下步骤通过化学方法从所述肽顺序释放C-末端氨基酸以制备包含其一系列反应产物的混合物，将该系列反应产物和初始肽进行质谱分析以测量与其C-末端氨基酸依次释放相关的分子量的减少，和基于测量的分子量的一系列减少鉴定依次去除的一系列氨基酸，并从C-末端排列鉴定的所述氨基酸以获得所述肽C-末端氨基酸序列的信息，其中在释放C-末端氨基酸的步骤中所用的处理技术是包含下列步骤的方法在干燥气氛中，在选自15-60℃范围的温度下，使均是汽相的链烷酸酐和全氟链烷酸，其是来自于包含链烷酸酐和向其中加入的少量全氟链烷酸的混合物，作用在被检验的肽的干燥样品上；进行C-末端氨基酸的释放，其与在肽的C-末端形成5-噁唑酮结构接着裂解5-噁唑酮环的过程结合，所述5-噁唑酮结构由下列通式(III)表示 其中R1是肽的C-末端氨基酸的侧链，R2是刚好位于C-末端氨基酸之前的氨基酸残基的侧链。
2.权利要求1中要求的方法，其中将含有2-4个碳原子的链烷酸的对称酸酐用作包含在所述混合物中的链烷酸酐，所述混合物通过将少量全氟链烷酸加入所述链烷酸酐获得。
3.权利要求2中要求的方法，其中将含有2-4个碳原子的直链链烷酸的对称酸酐用作所述含有2-4个碳原子的链烷酸的对称酸酐。
4.权利要求1中要求的方法，其中将乙酸酐用作包含在所述混合物中的链烷酸酐，所述混合物通过将少量全氟链烷酸加入所述链烷酸酐获得。
5.权利要求1中要求的方法，其中将pKa在0.3-2.5范围内的全氟链烷酸用作包含在所述混合物中的全氟链烷酸，所述混合物通过将少量所述全氟链烷酸加入所述链烷酸酐获得。
6.权利要求1中要求的方法，其中将含有2-4个碳原子的全氟链烷酸用作包含在所述混合物中的全氟链烷酸，所述混合物通过将少量所述全氟链烷酸加入所述链烷酸酐获得。
7.权利要求6中要求的方法，其中将含有2-4个碳原子的直链全氟链烷酸用作所述含有2-4个碳原子的全氟链烷酸。
8.权利要求1中要求的方法，其中在通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐获得的所述混合物中，相对于所述链烷酸酐和全氟链烷酸的总体积，所述全氟链烷酸的含量在1-20％体积的范围选择。
9.权利要求1中要求的方法，其中在使用通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐获得的所述混合物的处理中，所述干燥气氛是其中氧气以及水已经被去除的状态。
10.权利要求9中要求的方法，其中所述干燥气氛是通过抽空其内部空气在气密容器内部实现的。
11.权利要求1中要求的方法，其中在使用通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐获得的所述混合物的处理中，将温度设定在选自15-50℃范围的温度。
12.权利要求1中要求的方法，其中除了使用通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐获得的所述混合物的处理步骤以外，向方法提供另外的水解处理步骤，其包含以下步骤在干燥状态中，对包含一系列反应产物的混合物实施去除其中残留的所述链烷酸酐和全氟链烷酸的后处理，所述反应产物是在依次释放C-末端氨基酸的所述步骤中获得的，然后，进料均是汽相的碱性含氮芳环化合物或叔胺化合物和水分子，两者都是通过使用其中溶解了碱性含氮芳环化合物或叔胺化合物的水溶液而提供的，在所述碱性含氮有机化合物的存在条件下使所述水分子作用在肽的反应产物上，和在所述水解处理后，在再干燥的后处理之后接着进行干燥，所述再干燥的后处理是通过去除均残留在包含一系列反应产物的所述混合物中的碱性含氮有机化合物和水分子来进行的。
13.权利要求1或12中要求的方法，其中除了使用通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐而获得的所述混合物的所述处理步骤以外，在依次释放所述C-末端氨基酸的步骤之前，可以提供给方法以另外的预处理步骤，其是使用来源于构成所述链烷酸酐的链烷酸的酰基对所述被检验肽的N-末端氨基预先实施N-酰化保护。
14.权利要求13中要求的方法，其中通过使用技术可以进行对N-末端氨基实施N-酰化保护的预处理步骤，在所述技术中肽中氨基的N-酰化是在干燥气氛中在选自10-60℃范围的温度下通过使均是汽相的来自通过将少量所述链烷酸加入所述链烷酸酐而获得的混合物的链烷酸酐和链烷酸作用在所述被检验的肽的干燥样品上实现的。
15.权利要求14中要求的方法，其中作为在对N-末端实施N-酰化保护的预处理步骤中所用的所述链烷酸酐和作为在其后进行的依次释放C-末端氨基酸的步骤中所用的链烷酸酐，使用的可以是相同的链烷酸酐。
16.一种制备混合物的方法，所述混合物包含通过使用化学方法从目标肽依次释放C-末端氨基酸可获得的一系列反应产物，其中实施该方法来制备包含通过化学方法从所述肽依次释放C-末端氨基酸可获得的一系列反应产物的所述混合物，其包含以下步骤在干燥气氛中，在选自15-60℃范围的温度下，使来自所述链烷酸酐和向其中加入的少量所述全氟链烷酸的混合物的均是汽相的链烷酸酐和全氟链烷酸作用在所述目标肽的干燥样品上，和进行C-末端氨基酸的释放，其与在肽的C-末端形成5-噁唑酮结构接着裂解5-噁唑酮环的过程结合，所述5-噁唑酮结构由下列通式(III)表示 其中R1是所述肽的C-末端氨基酸的侧链，R2是刚好位于所述C-末端氨基酸之前的氨基酸残基的侧链。
17.一种通过化学方法从目标肽依次释放C-末端氨基酸的反应处理试剂盒，其中依次释放C-末端氨基酸的处理试剂盒是下列组合装配的试剂盒作为依次释放C-末端氨基酸的反应的液体试剂，至少通过将少量全氟链烷酸加入链烷酸酐获得的混合物，或分开地组合所述链烷酸酐和全氟链烷酸以制备所述混合物，其中容纳所述被处理目标肽的样品的样品容器，和装配有容纳液体试剂的系统的反应器容器，所述系统中能够储备所述液体试剂，并能够保持该状态以使所述液体试剂不与装在所述样品容器中的所述肽样品直接接触，并且具有将所述样品容器容纳在里面的容量。
全文摘要
本发明提供通过应用反应技术从那里依次释放C－末端氨基酸来分析肽C－末端氨基酸序列的方法，当顺序释放肽的C－末端氨基酸时，该方法可以抑制如在肽中间位置裂解肽键的不希望有的副反应，并允许在广泛适用的条件下进行其化学处理。在按照本发明的方法中，在干燥空气中，在15－60℃范围选择的温度下，使来自包含链烷酸酐和向其中加入的少量全氟链烷酸的混合物的均是汽相的链烷酸酐和全氟链烷酸作用在被检测肽的干燥样品上；由此C－末端氨基酸的释放是由连续形成5－噁唑酮结构，接着裂解5－噁唑酮环产生；然后基于获得的一系列反应产物的分子量减少通过分析鉴定C－末端的氨基酸序列。
文档编号G01N33/68GK1556925SQ0380111
公开日2004年12月22日 申请日期2003年3月24日 优先权日2002年3月25日
发明者宫崎贤司, 次田晧, 高桥直行, 锅谷卓司, 山崎敏正, 上条宪一, 一, 司, 正, 行 申请人:日本电气株式会社, 东京理化器械株式会社