专利名称：基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备及应用。具体是基于氨基化钠基蒙脱石和纳米多孔金膜构建的夹心型电化学免疫传感器，用于测定多种肿瘤标志物，属于功能材料和生物传感技术领域。
背景技术：
肿瘤标志物在癌症的早期诊断中具有重要的实用价值。肿瘤标志物是一种在肿瘤细胞的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生、或者由机体对肿瘤细胞的反应而产生的，反应肿瘤存在和生长的一类物质。包括蛋白质、激素、酶、多胺及癌基因产物等。肿瘤标志物在临床中应用广泛，在正常人群中的癌症筛查、有症状者的癌症辅助诊断、癌症的临床阶段的分期、癌症疾病进程的预后评估治疗方案、判断癌症是否复发中起着极其重要的作用。目前临床研究较多的肿瘤标志物有癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、a-L-岩藻糖苷酶(AFU)、前列腺特异性抗原(PSA)、糖类抗原125 (CA-125)、糖类抗原15_3 (CA 15-3)、糖类抗原199(CA-199)、糖类抗原724(CA-724)、糖类抗原242 (CA-242)、人绒毛膜促性腺激素(卢-HCG)、甲状腺球蛋白(TG)。检测肿瘤标志物的方法主要有放射免疫测定法、酶免疫分析测定法、化学发光免疫分析等，这些检测方法具有如下特点
(I)放射免疫测定法该法在生物医学各个领域已得到广泛的应用，其具有操作简便、成本低等优点，但其放射性污染严重，灵敏度低，使其应用受到限制。(2)酶免疫分析测定法该法标记物制备简单，有效期长，对环境无污染等特点，得到了迅速地普及和发展，但因酶容易失活，导致其信号时间短，降低了方法的灵敏度和重现性。(3)化学发光免疫分析测定法该法具有灵敏度高、选择性强、重现性好、易于操作等优点，但其影响化学发光分析检测结果的因素较多，稳定性较差，且在发生化学反应之后，样品的发光无法再现。因此，发明一种检测限低、灵敏度高、特异性强、重现性好的肿瘤标志物传感器至
关重要。近年来，纳米材料在单分子水平的各种探针技术、纳米集成阵列器件、电极表面修饰等方面的研究取得了突飞猛进的发展参见(a) Lai G. S. ; Yan F. ; Wu J. ; Leng C.;Ju H. X. Anal. Chem., 2011，83，2726-2732. (b) Du D. ; Wang L. M. ; Shao Y. Y. ; WangJ. ; Engelhard M. H. ; Lin Y. H. Anal. Chem. , 2011，83，746-752.。氨基化钠基蒙脱石是一种性能优越的纳米材料，具有比表面积大、孔隙度高、生物相容性好、吸附性能好的特点，氨基化后可实现对一抗良好的结合能力，使之可固载和标记更多生物分子；此外其低廉的价格大大降低了传感器的成本。纳米多孔金膜具有比表面积大、导电性好的特点，加之其良好的生物相容性，可用于修饰电极以增大电极的有效面积，同时可直接固载抗体。本发明将以上氨基化钠基蒙脱石和纳米多孔金膜两种纳米材料用于电化学免疫传感器的构建中，赋予电化学免疫传感器更为突出的特色。首先采用纳米多孔金膜固定一抗，由于纳米多孔金膜具有三维连续开孔结构和大的比表面积，有利于固定更多的一抗，而且纳米多孔金膜良好的生物相容性，可以与一抗直接结合，避免了交联剂的使用；然后采用吸附硫堇后的氨基化钠基蒙脱石标记二抗和辣根过氧化物酶，提高了其电极表面的电子传递效率，降低了检测限、增加了传感器的检测灵敏度。按照以上方法制备的电化学免疫传感器，利用钠基蒙脱石具有较大的比表面积和孔隙度、良好的生物相容性，加之氨基化后可实现对一抗良好的结合能力，使之可固载更多抗体和酶。利用纳米多孔金膜良好的三维连续开孔结构及生物相容性，可以直接固定大量肿瘤标志物一抗，同时具有良好的催化活性，能进一步提高电子传递效率等，进而显著改善传感器的灵敏度。经对现有肿瘤标志物检测专利技术的检索发现，目前CN200910212772. 0公开了 一种用于检测甲胎蛋白的电化学发光免疫传感器，该传感器的检测限达到0. 035 ng/mL，线性范围为0.01 20 ng/mL。CN201110199112.0公开了一种检测磷化蛋白的电化学免疫传感器，其检测限为0. 01 ng/mL，线性范围为 0. 02 20 ng/mL。CN03113053. 4公开了一种检测CA-125无试剂安培免疫传感器。本发明分别采用纳米多孔金膜和氨基化钠基蒙脱石作为电极修饰和二抗标记材料，降低了传感器的检出限，对多种肿瘤标志物的检测限在3.0 ^3.7 pg/mL之间。由此可以看出，其方法的灵敏度得到显著提高，灵敏度均优于以上三种方法，可以准确定量检测多种肿瘤标志物。本发明利用免疫反应的高特异性，结合纳米多孔金膜和氨基化钠基蒙脱石制备了一种夹心型电化学免疫传感器并用来检测多种肿瘤标志物。本发明具有灵敏度高、特异性好、检测成本低、能快速检测多种肿瘤标志物等优势，且本发明制备过程简单，操作过程简便，有效克服了目前肿瘤标志物检测方法的不足。
发明内容
本发明的技术任务之一是为了克服现有检测肿瘤标志物技术中的不足，如仪器复杂、成本高、检测过程繁琐等缺点，提供一种高灵敏和特异性的电化学免疫传感器的制备方法，其制备技术成熟可靠；
本发明的技术任务之二是提供该电化学免疫传感器的应用，所述电化学免疫传感器能高灵敏、特异性、低成本、快速检测多种肿瘤标志物。 为了实现上述目的，本发明是通过以下措施来实现的。1.基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备，其特征在于，包括以下步骤
(1)纳米多孔金膜的制备；
(2)氨基化钠基蒙脱石的制备；
(3)基于氨基化钠基蒙脱石标记的二抗的制备；(4)肿瘤标志物传感器的制备。(I)纳米多孔金膜的制备
1)在25 35°C恒温条件下，将金/银重量比为1:1 1. 2的银金合金薄膜漂浮在1(T15 mol L—1硝酸液面上4 7 min，将银腐蚀掉，制成纳米多孔金膜；
2)将纳米多孔金膜用超纯水洗涤至其pH=7.O。(2)氨基化钠基蒙脱石的制备
1)称取10.00 g蒙脱石，放入大烧杯中，加入100 mL蒸馏水，搅拌2 3 h，置于平稳不受振动的实验台上，静置；待分层后，取出上清液，即为蒙脱石悬浮液；将上述悬浮液加入到250 mL的0.50 mol !/1NaCl溶液中，搅拌12 24 h，静置；分层后，吸出上清液；再加入250 mL的0.50 mol L^1NaCl溶液，搅拌12 h，静置，吸出上清液；将蒙脱石悬浮液在离心机 上以8000 r HiirT1的速度离心12 min，倒掉上清液；重复操作，直至上清液中没有Cl_为止；将洗涤后的试样在烘箱中于70 80°C下干燥，干燥后的试样研成粉末，过100目筛，得到提纯钠化后的蒙脱石；
2)将1.0g钠基蒙脱石转移到80 mL异丙醇和I mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中，加热到80°C并持续2 h，使氨基修饰钠基蒙脱石的表面，得到氨基化钠基蒙脱石。(3)基于氨基化钠基蒙脱石标记的二抗的制备
1)用PH7.0的PBS分散氨基化的钠基蒙脱石(Na-Mont)，形成分散均匀的石墨烯悬浮
液；
2)将上述悬浮液与Img mr1的硫堇溶液(TH)混合，37°C下震荡12 h后离心，弃去上清液，并将其重新分散于PBS中，得到Na-Mont-TH ；
3)将Na-Mont-TH与戊二醛溶液混合，震荡，再加入Img辣根过氧化物酶(HRP)和0. 01mg肿瘤标志物二抗(Ab2),振荡反应6h后，离心，弃去上清液，并将其重新分散于ImL pH
7.0 的 PBS 中，得到 Na-Mont-TH-HRP-Ab2，将 Na-Mont-TH-HRP-Ab2 贮存于 4°C下。(4)肿瘤标志物传感器的制备
1)在检测前，将直径4mm的玻碳电极依次用1. 0,0. 3和0. 05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，超纯水冲洗干净，将电极置于5 mmol I/1铁氰化钾溶液中，在-0.2 0. 6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV ；
2)用纳米多孔金膜修饰于玻碳电极表面，室温干燥；
3)将6UL 10 Ug mL—1肿瘤标志物一抗(Ab1)滴涂到步骤2)室温干燥的纳米多孔金膜修饰的玻碳电极表面，保持湿润0.5 1. 5 h，置于4°C湿润条件下晾干，用pH 7.0的PBS缓冲溶液洗去未结合上的Ab1 ；
4)用3UL T2 wt%牛血清白蛋白(BSA)滴涂到步骤3)肿瘤标志物一抗修饰的电极表面，4°C下湿润条件下晾干，封闭非特异性活性位点，用pH 7.0的PBS缓冲溶液洗去未结合上的BSA ；
5)将6UL肿瘤标志物抗原滴涂在步骤4)得到的电极表面，保持湿润孵育0.5 1. 5 h，4 °C下湿润条件下晾干；
6)用6uL Na-Mont-TH-HRP-Ab2滴涂在步骤5)得到的电极表面，保持湿润0. 5 1. 5 h，4 °C下湿润条件下晾干，用pH 7.0的PBS缓冲溶液洗去未结合上的Na-Mont-TH-HRP-Ab2,得到肿瘤标志物传感器。
2.本发明所述的制备的肿瘤标志物传感器，其特征在于，用于肿瘤标志物的检测，包括以下步骤
(1)工作曲线的绘制；
(2)肿瘤标志物的检测。(I)中所述的工作曲线的绘制，包括以下步骤
1)将所制备的肿瘤标志物传感器作为工作电极、饱和甘汞电极作为参比电极、钼丝电极作为辅助电极，组成三电极系统，结合电化学工作站CHI 760D，用循环伏安法以100 mVs—1在PBS溶液中进行扫描测定，选择-0. 3 V为检测电位，记录响应电流Z0 ；
2)待背景电流稳定后，在PBS中加入1.0mmol L—1 H2O2，进行循环伏安扫描，记录电流
Ii ;
3)根据上述步骤I)和步骤2)所得的电流差值AJ=I0-1i与肿瘤标志物抗原溶液浓度之间的线性关系，绘制工作曲线。3.本发明所述的肿瘤标志物传感器，其特征在于，所述的肿瘤标志物选自下列目前发病率高的肿瘤标志物之一癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、a-L-岩藻糖苷酶(AFU)、前列腺特异性抗原(PSA)、糖类抗原125(CA-125)、糖类抗原15_3(CA 15_3)、糖类抗原199(CA-199)、糖类抗原724 (CA-724)、糖类抗原242 (CA-242)、人绒毛膜促性腺激素(J3 -HCG)、甲状腺球蛋白(TG)。本发明的有益成果
与现有技术相比，本发明的的制备方法及应用，其突出的特点是
(1)将纳米介孔材料和贵金属纳米材料引入到电化学免疫传感器的制备中，有效的提高了电化学免疫传感器的灵敏度和生物相容性；
(2)利用廉价、易得的钠基蒙脱石，大大降低了免疫传感器的成本。通过对钠基蒙脱石进行氨基功能化，使其更有利于固定抗体和酶，同时保持其良好的生物活性；
(3)利用纳米多孔金膜良好的三维连续开孔结构及生物相容性，可直接固定一抗；其良好的催化性能又显著提高了传感器的灵敏度；
(4)使用完全相同的材料和修饰方法，利用抗原与抗体的特异性结合，只需改变抗体种类即可实现多种肿瘤标志物的高灵敏、特异性检测，此方法简单、经济，有利于促进传感器的商品化。 ( 5 )本发明制备的电化学免疫传感器用于肿瘤标志物的检测，试剂用量少，检测速度快，灵敏度高，特异性好，便于检测。
图1为钠基蒙脱石的扫描电镜图。图2为基于氨基化钠基蒙脱石标记的二抗的制作过程。图3为基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备过程。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备，包括以下步骤
(I)在30°C下，将金/银质量比为1:1银金合金薄膜漂浮在10 mol I/1硝酸液面上4 min，将银腐蚀掉，制成纳米多孔金膜。将纳米多孔金膜用超纯水洗涤至其pH=7. O。(2)称取10. 00 g蒙脱石，放入大烧杯中，加入100 mL蒸馏水，搅拌2 h，置于平稳不受振动的实验台上，静置；待分层后，取出上清液，即为蒙脱石悬浮液；将上述悬浮液加入到250 mL的0.50 mol L^1NaCl溶液中，搅拌12 h，静置；分层后，吸出上清液；再加入250mL的0.50 mol L^1NaCl溶液，搅拌12 h，静置，吸出上清液；将蒙脱石悬浮液在离心机上以8000 r HiirT1的速度离心12 min，倒掉上清液；重复操作，直至上清液中没有Cl_为止；将洗涤后的试样在烘箱中于70°C下干燥，干燥后的试样研成粉末，过100目筛，得到提纯钠化后的蒙脱石，即为钠基蒙脱石。(3)将1. 0 g钠基蒙脱石转移到80 mL异丙醇和I mL 3_氨基丙基三乙氧基硅烷 的混合溶液中，加热到80°C并持续2 h，使氨基修饰钠基蒙脱石的表面，得到氨基化钠基蒙脱石，该纳米材料的形貌见图1 ;由图1可以就看出，氨基化钠基蒙脱石呈现明显的层状结构，说明氨基化处理后并未改变蒙脱石的层状结构。(4)用pH 7.0 PBS分散氨基化的钠基蒙脱石(Na-Mont)，形成分散均匀的石墨烯悬浮液。将上述悬浮液与I mg mL—1的硫堇溶液(TH)混合，37°C下震荡12 h后离心，弃去上清液，并将其重新分散于PBS中，得到Na-Mont-TH。将Na-Mont-TH与戊二醛溶液混合、震荡，再加入I mg辣根过氧化物酶(HRP)和0. 01 mg肿瘤标志物二抗(Ab2X振荡反应6h后，离心，弃去上清液，并将其重新分散于ImL pH 7.0 PBS中，得到Na-Mont-TH-HRP-Ab2，贮存于4°C下，该氨基化钠基蒙脱石标记的二抗的制备过程见图2。(5)将直径4 mm的玻碳电极依次用1. 0,0. 3和0. 05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol L—1铁氰化钾溶液中，在-0. 2 0. 6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV。(6)根据图3基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备过程进行制备。将纳米多孔金膜修饰于玻碳电极表面，室温干燥。将6 u L 10 UgmL1肿瘤标志物一抗滴涂到纳米多孔金膜修饰的电极表面，保持湿润I h，用pH 7.0 PBS缓冲溶液洗去未连接上的Ab1置于4°C湿润条件下晾干。将浓度为3 L I wt%牛血清白蛋白滴涂到肿瘤标志物一抗修饰的电极表面，用PH 7.0 PBS缓冲溶液洗去未连接上的BSA，4°C下湿润条件下晾干。将6 UL肿瘤标志物抗原滴涂在牛血清白蛋白修饰的电极表面，保持湿润孵育0.5 h，4°C下湿润条件下晾干。将步骤(3)制备的6 uL Na-Mont-TH-HRP-Ab2肿瘤标志物二抗复合物溶液滴涂于肿瘤标志物抗原修饰的电极表面，保持湿润0.5 h，用pH 7.0 PBS缓冲溶液洗去未连接上的Ab1,4°C下湿润条件下晾干。实施例2
基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备，包括以下步骤
(I)在30°C下，将金/银质量比为1:1.1银金合金薄膜漂浮在12 mol I/1硝酸液面上5 min，将银腐蚀掉，制成纳米多孔金膜。将纳米多孔金膜用超纯水洗涤至其pH=7. O。(2)称取10. 00 g蒙脱石，放入大烧杯中，加入100 mL蒸馏水，搅拌2.5 h，置于平稳不受振动的实验台上，静置；待分层后，取出上清液，即为蒙脱石悬浮液；将上述悬浮液加入到250 mL的O. 50 mo I T1NaCl溶液中，搅拌18 h，静置；分层后，吸出上清液；再加入 250 mL的O. 50 mo I T1NaCl溶液，搅拌12 h，静置，吸出上清液；将蒙脱石悬浮液在离心机上以8000 r HiirT1的速度离心12 min，倒掉上清液；重复操作，直至上清液中没有Cl_为止； 将洗涤后的试样在烘箱中于75°C下干燥，干燥后的试样研成粉末，过100目筛，得到提纯钠化后的蒙脱石，即得到钠基蒙脱石。
(3)将1. O g钠基蒙脱石转移到80 mL异丙醇和I mL 3_氨基丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中，加热到80°C并持续2 h，使氨基修饰钠基蒙脱石的表面，得到氨基化钠基蒙脱石。
(4)用pH 7.0 PBS分散氨基化的钠基蒙脱石(Na-Mont)，形成分散均匀的石墨烯悬浮液。将上述悬浮液与I mg mL—1的硫堇溶液(TH)混合，37 °C下震荡12 h后离心，弃去上清液，并将其重新分散于PBS中，得到Na-Mont-TH。将Na-Mont-TH与戊二醛溶液混合、 震荡，再加入I mg辣根过氧化物酶(HRP)和O. 01 mg肿瘤标志物二抗(Ab2)。振荡反应6h 后，离心，弃去上清液，并将其重新分散于ImL pH 7.0 PBS中，得到Na-Mont-TH-HRP-Ab2，贮存于4°C下，该氨基化钠基蒙脱石标记的二抗的过程见图2。·
(5)将直径4 mm的玻碳电极依次用1. 0,0. 3和O. 05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol L—1铁氰化钾溶液中， 在-0. 2 0. 6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV。
(6)根据图3基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备过程进行制备。 将纳米多孔金膜修饰于玻碳电极表面，室温干燥。将6 μ L 10 UgmL1肿瘤标志物一抗滴涂到纳米多孔金膜修饰的电极表面，保持湿润I h，用pH 7.0 PBS缓冲溶液洗去未连接上的Ab1置于4°C湿润条件下晾干。将浓度为3 UL 1.5 wt%牛血清白蛋白滴涂到肿瘤标志物一抗修饰的电极表面，用PH 7. O PBS缓冲溶液洗去未连接上的BSA，4°C下湿润条件下晾干。将6 μ L肿瘤标志物抗原滴涂在牛血清白蛋白修饰的电极表面，保持湿润孵育I h，4 °C下湿润条件下晾干。将步骤(3)制备的6 μ L Na-Mont-TH-HRP-Ab2肿瘤标志物二抗复合物溶液滴涂于肿瘤标志物抗原修饰的电极表面，保持湿润I h，用pH 7.0 PBS缓冲溶液洗去未连接上的Ab1,4°C下湿润条件下晾干。
实施例3基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备，包括以下步骤(I)在35°C下，将金/银重量比为1:1. 2银金合金薄膜漂浮在15 mol I/1硝酸液面上7 min，将银腐蚀掉，制成纳米多孔金膜。将纳米多孔金膜用超纯水洗涤至其pH=7. O。
(2)称取10. 00 g蒙脱石，放入大烧杯中，加入100 mL蒸馏水，搅拌3 h，置于平稳不受振动的实验台上，静置。待分层后，取出上清液，即为蒙脱石悬浮液。将上述悬浮液加入到250 mL的0.50 mol PNaCl溶液中，搅拌24 h，静置。分层后，吸出上清液；再加入250 mL的0.50 mol PNaCl溶液，搅拌12 h，静置，吸出上清液。将蒙脱石悬浮液在离心机上以 8000 r HiirT1的速度离心12 min，倒掉上清液。重复操作，直至上清液中没有Cl_为止。将洗涤后的试样在烘箱中于80°C下干燥，干燥后的试样研成粉末，过100目筛，得到提纯钠化后的蒙脱石，即为钠基蒙脱石。
(3)将l.Og钠基蒙脱石转移到80 mL异丙醇和I mL 3_氨基丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中，加热到80 °C并持续2 h，使氨基修饰钠基蒙脱石的表面。
(4)用pH 7.0 PBS分散氨基化的钠基蒙脱石(Na-Mont)，形成分散均匀的石墨烯悬浮液。将上述悬浮液与I mg mL—1的硫堇溶液(TH)混合，37°C下震荡12 h后离心，弃去上清液，并将其重新分散于PBS中，得到Na-Mont-TH。将Na-Mont-TH与戊二醛溶液混合、震荡，再加入I mg辣根过氧化物酶(HRP)和0. 01 mg肿瘤标志物二抗(Ab2X振荡反应6h后，离心，弃去上清液，并将其重新分散于ImL pH 7.0 PBS中，得到Na-Mont-TH-HRP-Ab2，贮存于4°C下，该氨基化钠基蒙脱石标记的二抗的过程见图2。(5)将直径4 mm的玻碳电极依次用1. 0,0. 3和0. 05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol L—1铁氰化钾溶液中，在-0. 2 0. 6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV。(6)根据图3基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备过程进行制备。将纳米多孔金膜修饰于玻碳电极表面，室温干燥。将6 u L 10 UgmL1肿瘤标志物一抗滴涂到纳米多孔金膜修饰的电极表面，保持湿润1.5 h，用pH 7.0 PBS缓冲溶液洗去未连接上的Ab1置于4°C湿润条件下晾干，。将浓度为3 UL 2 七％牛血清白蛋白滴涂到肿瘤标志物一抗修饰的电极表面，用pH 7. 0 PBS缓冲溶液洗去未连接上的BSA，4°C下湿润条件下晾 干。将6 U L肿瘤标志物抗原滴涂在牛血清白蛋白修饰的电极表面，保持湿润孵育1. 5 h，4°C下湿润条件下晾干。将步骤(3)制备的6 uL Na-Mont-TH-HRP-Ab2肿瘤标志物二抗复合物溶液滴涂于肿瘤标志物抗原修饰的电极表面，保持湿润1. 5 h，用pH 7.0 PBS缓冲溶液洗去未连接上的Ab1,4°C下湿润条件下晾干。实施例4
实施例1 3制备的基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器，用于肿瘤标志物检测，包括以下步骤
(1)工作曲线的绘制；
(2)肿瘤标志物的检测；
(I)中所述工作曲线的绘制，包括以下步骤
1)将参比电极一饱和甘汞电极、对电极一钼丝电极和工作电极正确连接在电化学工作站上，用循环伏安法以100 mV s—1在PBS溶液中进行扫描测定，选择-0.3 V为检测电位，记录响应电流Z0 ；
2)待背景电流稳定后，在PBS中加入1.0mmol L—1 H2O2，进行循环伏安扫描，记录电流
Ii ;
3)根据上述步骤I)和步骤2)所得的电流差值AJ=I0-1i与肿瘤标志物抗原溶液浓度之间的线性关系，绘制工作曲线。实施例5乳腺癌肿瘤标志物检测
一种乳腺癌肿瘤标志物传感器的制备及应用，包括以下步骤
(1)选择乳腺癌肿瘤标志物，联合检测CA-125、CA15-3、CEA和衫-HCG,按照实施例1所述的步骤构建电化学免疫传感器；
(2)按照实施例4所述的步骤进行检测，乳腺癌肿瘤标志物的检测技术指标见表I。表I乳腺癌肿瘤标志物的检测技术指标 表I乳腺癌肿瘤标志物的检测技术指标
权利要求
1.基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备及应用，其特征在于，包括以下步骤 (1)纳米多孔金膜的制备； (2)氨基化钠基蒙脱石的制备； (3)基于氨基化钠基蒙脱石标记的二抗的制备； (4)肿瘤标志物传感器的制备。
2.根据权利要求1所述的基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备，所述纳米多孔金膜的制备，其特征在于，包括以下步骤 (1)在25 35°C恒温条件下，将金/银质量比为1:1 1. 2的银金合金薄膜漂浮在.10~15 mol I/1硝酸液面上4 7 min，将银腐蚀掉，制成纳米多孔金膜； (2)将纳米多孔金膜用超纯水洗涤至其pH=7.0。
3.根据权利要求1所述的基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备，其特征在于，所述氨基化钠基蒙脱石的制备，包括以下步骤 (1)称取10.00 g蒙脱石，放入大烧杯中，加入100 mL蒸馏水，搅拌2 h，置于平稳不受振动的实验台上，静置；待分层后，取出上清液，即为蒙脱石悬浮液；将上述悬浮液加入到250 mL的O. 50 mol !/1NaCl溶液中，搅拌12 24 h，静置；分层后，吸出上清液；再加Λ250 mL的O. 50 mol T1NaCl溶液，搅拌12 h，静置，吸出上清液；将蒙脱石悬浮液在离心机上以8000 r HiirT1的速度离心12 min，倒掉上清液；重复操作，直至上清液中没有Cl_为止；将洗涤后的试样在烘箱中于7(T80°C下干燥，干燥后的试样研成粉末，过100目筛，得到提纯钠化后的蒙脱石； (2)将1.0g钠基蒙脱石转移到80 mL异丙醇和I mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中，加热到80°C并持续2 h，使氨基修饰钠基蒙脱石的表面，得到氨基化钠基蒙脱石。
4.根据权利要求1所述的基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备，其特征在于，所述基于氨基化钠基蒙脱石标记的二抗的制备，包括以下步骤 (1)用pH7.0的PBS分散氨基化的钠基蒙脱石(Na-Mont)，形成分散均匀的石墨烯悬浮液； (2)将上述悬浮液与Img πιΓ1的硫堇溶液(TH)混合，37°C下震荡12 h后离心，弃去上清液，并将其重新分散于PBS中，得到Na-Mont-TH ； (3)将Na-Mont-TH与戊二醛溶液混合，震荡，再加入Img辣根过氧化物酶(HRP)和O.01 mg肿瘤标志物二抗(Ab2),振荡反应6h后，离心，弃去上清液，并将其重新分散于ImLpH 7. O 的 PBS 中，得到 Na-Mont-TH-HRP-Ab2，贮存于 4°C下。
5.根据权利要求1所述的基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器，其特征在于，所述肿瘤标志物传感器的制备，包括以下步骤 (1)在检测前，将直径4mm的玻碳电极依次用1. 0,0. 3和O. 05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，超纯水冲洗干净，使电极表面呈镜面； (2)用纳米多孔金膜修饰玻碳电极表面，室温干燥； (3)将6μ L 10 μ g mL—1肿瘤标志物一抗(Ab1)滴涂到步骤(2)室温干燥的纳米多孔金膜修饰的玻碳电极表面，保持湿润O. 5 1. 5 h，置于4°C湿润条件下晾干，用pH 7.0的PBS缓冲溶液洗去未结合上的Ab1 ；(4)用3μ L 1^2 wt%牛血清白蛋白(BSA)滴涂到步骤(3)得到的电极表面，4°C下湿润条件下晾干，封闭非特异性活性位点，用PH 7. O的PBS缓冲溶液洗去未结合上的BSA ； (5)将6μ L肿瘤标志物抗原滴涂在步骤(4)得到的电极表面，保持湿润孵育O. 5^1. 5h，4°C下湿润条件下晾干； (6)将6uL Na-Mont-TH-HRP-Ab2滴涂在步骤(5)得到的电极表面，保持湿润0.5 1.5 h，4 °C下湿润条件下晾干，用pH 7. O的PBS缓冲溶液洗去未结合上的Na-Mont-TH-HRP-Ab2，得到肿瘤标志物传感器。
6.根据权利要求1-5所述的基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器，其特征在于，所述肿瘤标志物传感器用于检测肿瘤标志物，包括以下步骤 (1)工作曲线的绘制； (2)肿瘤标志物的检测。
7.根据权利要求6所述的基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器，其特征在于，所述工作曲线的绘制，包括以下步骤 (1)将制备好的电极作为工作电极、饱和甘汞电极作为参比电极、钼丝电极作为辅助电极，组成三电极系统，电化学工作站，采用循环伏安法以100 mV S—1在PBS溶液中进行扫描测定，选择-O. 3 V为检测电位，记录响应电流I0 ； (2)待背景电流稳定后，在PBS中加入1.O mmol Γ1 H2O2，进行循环伏安扫描，记录电流Ii ; (3)根据所述步骤(I)和步骤(2)所得的电流差值AJ=/,-Ji与肿瘤标志物抗原溶液浓度之间的线性关系，绘制工作曲线。
8.根据权利要求1-7所述的基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器，其特征在于，所述肿瘤标志物选自下列目前发病率高的肿瘤标志物之一癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、a -L-岩藻糖苷酶(AFU)、前列腺特异性抗原(PSA)、糖类抗原125 (CA-125)、糖类抗原 15-3 (CA 15-3)、糖类抗原 199 (CA-199)、糖类抗原 724(CA_724)、糖类抗原 242(CA_242)、人绒毛膜促性腺激素(卢-HCG)、甲状腺球蛋白TG。
全文摘要
本发明基于氨基化钠基蒙脱石和纳米多孔金膜构建的夹心型电化学免疫传感器，属于功能材料和生物传感技术领域。本发明通过对钠基蒙脱石进行氨基功能化，使其更有利于固定抗体和酶，同时保持其良好的生物活性；利用纳米多孔金膜良好的三维连续开孔结构及生物相容性，可直接固定一抗，其良好的催化性能又显著提高了传感器的灵敏度；利用廉价、易得的钠基蒙脱石，大大降低了传感器的成本。本发明能实现多种肿瘤标记物的高灵敏、特异性、快速准确检测。
文档编号G01N27/26GK102998449SQ20121036179
公开日2013年3月27日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者魏琴, 杜斌, 辛晓东, 吴丹, 张勇, 李贺, 王志玲, 马洪敏 申请人:济南大学