专利名称：抗人Ⅲ型前胶原氨基末端肽的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，具体地涉及针对m型前胶原氨基末端肽的单克隆抗体。本发明 还涉及所述抗体在检测样品in型别'胶原氨基末端肽水平中的应用，以及利用所述抗体检测样 品m型前胶原氨基末端肽水平的试剂盒及该抗体在肝纤维化疾病诊断中的可能应用。
背景技术：
m型前胶原氨基末端肽是肝纤维化的重要血清学指标。它是m型前胶原分泌到细胞外后 被蛋白酶切下的氨基端肽段。血清中的m型前胶原氨基末端肽与肝纤维化形成的活动程度密 切相关，其升高程度与炎症、坏死和肝纤维化程度有关。与体内沉积的胶原无关。而是反映 肝纤维化发生和发展的动态过程。m型前胶原氨基末端肽持续升高的慢性活动性肝炎，提示 病情可能会恶化并向肝硬变形成发展，而in型前胶原氨基末端肽降至正常可预示病情缓解， 说明该指标不仅在肝纤维化早期诊断上有价值，在慢性肝病的预后判断上也有意义。临床上对m型前胶原氨基末端肽的检测多采用免疫学方法，主要有放射免疫法和elisa 方法。目前国内外关于ni型前胶原氨基末端肽的研究均是利用in型甜胶原氨基末端肽的多克 隆抗体进行，未见in型前胶原氨基末端肽单克隆抗体的报道。多克隆抗体的特异性差，应用 于放免检测或elisa检测时背景偏高，质量不易控制，难以在临床诊断中推广。单克隆抗体在临床检测中的应用广泛，可以在免疫组化、elisa等多种方法中使用，具有特异性强、敏感性高的优点。目前，临床迫切需要高特异性的m型前胶原氨基末端肽单克隆抗体以及由此 衍生出的检测试剂盒，以便对肝纤维化疾病进行早期诊断，指导临床治疗。发明内容本发明人通过亲和纯化的方法获得纯化的in型前胶原氨基末端肽，并通过杂交瘤技术获 得in型前胶原氨基末端肽的单克隆抗体。本发明以纯化m型前胶原为原料，通过蛋白酶切割，通过谷胱甘肽琼脂糖柱亲和层析获 取其纯化氨基端片段。参照Kohler和Milstein建立的B淋巴细胞杂交瘤技术(KohlerG, MilsteinC ， Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity . Nature . 1975 Aug7 ; 256 (5517 ):495 — 7.)，本发明用纯化的III型前胶原氨基末端肽免疫BALB / c小鼠。将免疫小 鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，制备杂交瘤细胞。用ELISA方法筛选阳性细胞克隆。本发明人经过多次试验，获得了多株阳性细胞克隆。对这些阳性克隆所分泌的单克隆抗体进行分析鉴定，发现一株杂交瘤细胞株。经鉴定，所述单克隆抗体的亚类是IgG。本发明进一步涉及所述m型前胶原氨基末端肽单克隆抗体在检测样品ni型前胶原氨基末端肽水平中的应用。所用检测方法主要为免疫学方法中的ELISA、免疫荧光、放射免疫分析等。本发明提供一种检测样品中ffl型前胶原氨基末端肽水平的elisa试剂盒，包括用in型前 胶原氨基末端肽多克隆抗体包被的微孔板，ni型前胶原氨基末端肽标准抗原，辣根过氧化物 酶标记的in型前胶原氨基末端肽单克隆抗体，标记酶的相应显色底物，以及适宜的缓冲液。 该试剂盒适用于检测血液或组织液中的in型前胶原氨基末端肽水平。本发明还提供一种肝纤维化疾病的诊断方法，其特征为用本发明的单克隆抗体体外检测 血清中in型前胶原氨基末端肽的表达水平。在本发明的一个具体实施方案中，如上所述，应 用本发明所述in型前胶原氨基末端肽单克隆抗体对取自肝纤维化患者的血清进行常规ELISA 实验，检测血清中ni型前胶原氨基末端肽的水平。如其水平显著高于正常参考值，则提示被 检者可能患有肝纤维化。本发明还提供一种肝纤维化疾病患者的病情监测方法，包括用本发明的单克隆抗体在体 外检测肝纤维化患者样本中in型前胶原氨基末端肽水平的动态变化。在本发明的一个具体实 施例中，如上所述，应用本发明所述m型前胶原氨基水端肽单克隆抗体对取自肝纤维化患者 的血清进行常规ELisA实验，检测血清中ni型前胶原氨基末端肽的水平。如果治疗效果好， 则与治疗前相比患者血清中的in型前胶原氨基末端肽水平降低；如果病情出现反复，则血清 中m型前胶原氨基末端肽的水平增高。
具体实施方式
本发明将结合具体实例作进一步详述。本发明用纯化的in型前胶原氨基末端肽作为免疫原，获得了m型前胶原氨基末端肽单克 隆抗体。具体步骤如下(1) 制备免疫小鼠脾细胞用纯化的ni型前胶原氨基术端肽与等量佐剂充分混匀免疫，分别注入BALB / c小鼠颈背部两侧、腹股沟部皮下；每只每次剂量为20—80 pg，间隔2—4周，同法重复注入至少1次；第一次免疫用弗氏完全佐剂、第二次改用弗氏不完全佐剂、第三次不用佐剂；最后一次免疫后两周，测小鼠血清中III型前胶原氨基末端肽抗体滴度，将显示有足够高抗体滴度的小鼠作为免疫脾细胞的来源。(2) 制备骨髓瘤细胞选用SP2/0骨髓瘤细胞，在进行细胞融合前，将其在常规培养液中培养3—4天。(3) 细胞融合将按步骤(1)中得到的免疫小鼠脾细胞沉淀与按步骤(2)中得到的骨髓瘤细胞沉淀分别用1640培养液悬浮，并将脾细胞与骨髓瘤细胞按数量比5: 10混合，然 后离心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按体积比l: 2加入浓度为50 %的聚乙二醇， 再静置1—2分钟后离心去上清液，并缓慢加入沉淀物体积的25 —35倍的HAT培养液悬 浮融合细胞，最后补加HAT液至沉淀物体积的140—160倍，再将融合细胞按100ul/孔加入 至96孔培养板中，每孔中再加100ulHAT液小鼠腹水细胞(约l一2X10SM/孔)作为饲养细 胞。将上述培养孔置于浓度为3—7 %的二氧化碳培养箱中，在温度为35—38 °C条件下培 养10—14小时，从第3天开始，每隔2—3天用每孔半量HAT液换液一次。当观察培养孔中出现杂交细胞集落时，再在每孔加半量HA培养液，取培养上清液，用 ELISA方法筛选阳性细胞克隆。将上述抗人III型前胶原氨基末端肽抗体阳性、滴度高的杂交 瘤转移到另一块96孔板中进行克隆。通过经有限稀释该杂交瘤使一孔中只含有一个单一杂 交瘤细胞的方法来进行克隆。克隆过程中采用1640培养液，并用ELISA检测克隆细胞孔上 清培养液中抗体及滴度。对抗体阳性、滴度高的孔继续进行克隆3—4次，直至再次克隆时， 所有克隆孔均呈抗体阳性，筛选具有一个稳定抗体滴度的克隆作为产生抗人III型前胶原氨基 末端肽抗体的杂交瘤细胞系。(4) 制备单克隆抗体将上述步骤(3)中得的杂交瘤细胞，注入经降植烷处理的雌性 小鼠(4至8周龄)腹腔内，2至3周后收集腹水，离心除去固体成份，其上清液即含有抗人in型前胶原氨基末端肽单克隆抗体。如果需要进一步纯化，可采用硫酸铵沉淀和亲和层析方法纯化。经鉴定，所述单克隆抗体的亚类是IgG。本发明进一步涉及所述iii型前胶原氨基末端肽单克隆抗体在检测样品m型前胶原氨基末端肽水平中的应用。所用检测方法主要为免疫学方法中的ELISA、免疫荧光、放射免疫分析 等。在本发明的一个具体实施方案中，使用ELISA方法检测血清中III型前胶原氨基末端肽的水平。所用试剂盒包括用纯化的ni型前胶原氨基末端肽多克隆抗体包被的微孔板，m型前胶 原氨基末端肽标准抗原，由辣根过氧化物酶标记的所述ni型前胶原氨基末端肽单克隆抗体。标记酶的相应显色底物TMB，以及适宜的缓冲液。在微孔板用于作标准抗原曲线的各孔中依次加入不同浓度的标准抗原溶液，在样品孔中 加入待测血清样品，温育一段时间以使in型前胶原氨基末端肽与m型前胶原氨基末端肽多克 隆抗体充分结合。洗涤微孔板，加入辣根过氧化物酶标记的ni型前胶原氨基末端肽单克隆抗 体，以使ni型前胶原氨基末端肽单克隆抗体固定于微孔板上的in型前胶原氨基末端肽充分结合。洗涤微孔板，加入TMB显色底物液，室温避光显色。用酶标仪读取每个反应孔的OD450nm值。绘制标准曲线，计算待测样品中in型前胶原氨基末端肽的浓度。本发明还提供一种肝纤维化疾病的诊断方法，其特征为用本发明的单克隆抗体体外检测血清中m型前胶原氨基末端肽的表达水平。在本发明的一个具体实施方案中，如上所述，应用本发明所述III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体对取自肝纤维化患者的血清进行常规ELISA 实验，检测血清中III型前胶原氨基末端肽的水平。如其水平显著高于正常参考值，则提示被 检者可能患有肝纤维化。本发明还提供一种肝纤维化疾病患者的病情监测方法，包括用本发明的单克隆抗体在体外检测肝纤维化患者样本中in型前胶原氨基末端肽水平的动态变化。在本发明的一个具体实 施例中，如上所述，应用本发明所述m型前胶原氨基末端肽单克隆抗体对取自肝纤维化患者 的血清进行常规EusA实验，检测血清中in型前胶原氨基末端肽的水平。如果治疗效果好， 则与治疗前相比患者血清中的ni型前胶原氨基末端肽水平降低；如果病情出现反复，则血清 中m型前胶原氨基末端肽的水平增高。
权利要求
1、一种人III型前胶原氨基末端肽的单克隆抗体。
2、 权利要求1中的单克隆抗体在检测样品中人III型前胶原氨基末端肽水平的应用。
3、 一种以免疫学方法检测样品III型前胶原氨基末端肽水平的试剂盒，其含有权利要求l 中的单克隆抗体。
4、 一种检测样品中m型前胶原氨基末端肽水平的ELisA试剂盒，包括用in型前胶原氨 基末端肽多克隆抗体包被的微孔板，ni型前胶原氨基末端肽标准抗原，辣根过氧化物酶标记 的权利要求i所述单克隆抗体，标记酶的相应显色底物，以及适宜的缓冲液。
5、 一种肝纤维化疾病的诊断方法，其特征为用权利要求i的抗体体外检测患者组织样 本中ni型前胶原氨基末端肽水平。
全文摘要
本发明提供一种针对III型前胶原氨基末端肽的单克隆抗体。本发明还提供了检测样品III型前胶原氨基末端肽水平的ELISA试剂盒。与已有的III型前胶原氨基末端肽多克隆抗体相比，本发明的单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的特点。应用该抗体开发的ELISA试剂盒可对肝纤维化病人的III型前胶原氨基末端肽水平进行检测，用于早期诊断肝纤维化，判断慢性肝病预后，以指导临床治疗。还可对肝纤维化疾病患者进行病情监测。
文档编号G01N33/577GK101333253SQ20071004289
公开日2008年12月31日 申请日期2007年6月28日 优先权日2007年6月28日
发明者周季余 申请人:上海贝西生物科技有限公司