定量检测n末端脑钠肽前体的试剂条和试剂卡的制作方法
【专利摘要】一种用于定量检测N末端脑钠肽前体的试剂条，包括在底板上依次顺序搭接粘贴的样品结合垫、包被膜及吸水纸，所述样品结合垫上同时包被有由两种不同粒径荧光微球标记的抗N末端脑钠肽前体的第一抗体和由生物素标记的抗N末端脑钠肽前体的第二抗体，所述第一抗体和第二抗体分别特异性识别N末端脑钠肽前体的不同表位，所述包被膜上包被有相间隔的检测带和质控带，所述检测带固定有亲和素，所述质控带固定有抗鼠IgG的抗体。本实用新型还涉及一种用于定量检测N末端脑钠肽前体的试剂卡。本实用新型的试剂条和试剂卡能够实现快速检测、携带方便且具有高灵敏性和准确性。
【专利说明】定量检测N末端脑钠肽前体的试剂条和试剂卡
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种用于免疫检测的试剂条/试剂卡，具体涉及一种应用两种不同粒径荧光微球定量检测N末端脑钠肽前体(ΝΤ-ρι.οΒΝΡ)的荧光免疫层析试剂条/试剂卡。
【背景技术】
[0002]脑钠肽(BNP)是脑钠肽前体原的蛋白酶裂解产物，脑钠肽前体原在心肌细胞内合成，其脱去信号肽成为脑钠肽前体(proBNP)分子，ProBNP在转化酶依赖反应中形成两个多肽——具有生物活性的BNP以及生理活性不大确定的N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)。这其中，BNP是一种肽类激素，它具有排钠利尿、舒张血管以及抗肾素的作用。ΒΝΡ、ΝΤ-ρι.οΒΝΡ以及未分解的ProBNP都会被分泌到血液中并在血液中循环。
[0003]据报道，健康成年人中BNP的血浆水平在13.9-36.7pg/ml之间，NT-proBNP值在68-243pg/ml之间，而其在心脏病患者的样品中均会升高，如心力衰竭、急性冠状动脉综合症、左心室肥厚、心肌病、心脏瓣膜疾病、心房纤维性颤动和心脏淀粉样变性等。心衰患者血楽BNP浓度可增至几个ng/ml，而NT-proBNP浓度可高达几十个ng/ml。且心衰患者血液中这两种多肽的浓度与疾病的严重程度成正比。因此，血液中ΝΤ-ρι.οΒΝΡ的检测被广泛用于鉴定心衰患者和检测心衰的严重程度。
实用新型内容
[0004]抟术问题
[0005]目前现有技术中缺乏能够实现快速检测、携带方便且具有高灵敏性和准确性的测定NT-proBNP的试剂条和/或试剂卡。针对现有技术中存在的对目前N末端脑钠肽前体检测试剂条/试剂卡改进的需求，本实用新型提供了一种定量检测N末端脑钠肽前体的试剂条和试剂卡。
[0006]技术方案
[0007]一方面，本实用新型提供了一种定量检测N末端脑钠肽前体的试剂条，其特征在于，所述试剂条包括底板和在底板上依次顺序搭接粘贴如下部件:
[0008]i)同时包被有由两种不同粒径荧光微球标记的抗N末端脑钠肽前体的第一抗体和由生物素标记的抗N末端脑钠肽前体的第二抗体的样品结合垫，其中所述第一抗体和第二抗体分别特异性识别N末端脑钠肽前体的不同表位，
[0009]ii)包被有相间隔的检测带和质控带的包被膜，其中所述检测带固定有亲和素，所述质控带固定有抗鼠IgG的抗体，和
[0010]iii)吸水纸。
[0011]在一个实施方式中，所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小范围在50nm-400nm 之间。
[0012]在一个实施方式中，所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小分别为10rnn和 300nm。
[0013]在一个实施方式中，所述荧光微球上具有选自以下的荧光物质:Cy3荧光素、Cy5荧光素、异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明和四甲基异硫氰酸罗丹明。
[0014]在一个实施方式中，所述焚光微球上具有Cy5焚光素。
[0015]另一方面，本实用新型提供了一种定量检测N末端脑钠肽前体的试剂卡，其特征在于，所述试剂卡包括:
[0016]i)前述任意实施方式中所述的定量检测N末端脑钠肽前体的试剂条；和
[0017]ii)包覆所述试剂条的外壳，其中所述外壳包括彼此连接的以下部件:
[0018]i1-Ι)设置有加样区和检测区的扣盖，其中所述加样区开口在所述样品结合垫的上方以暴露出所述样品结合垫的部分区域，所述检测区开口在所述包被膜的上方以暴露出所述检测带和所述质控带的全部区域，和
[0019]i1-2)基座。
[0020]在一个实施方式中，所述扣盖由塑料制成。
[0021]在一个实施方式中，所述基座由塑料制成。
[0022]有益效果
[0023]本实用新型的试剂条和试剂卡的主要优点包括:
[0024]通过将样品垫和结合垫合二为一，形成单一的样品结合垫，从而大幅简化了生产工艺及流程；
[0025]两种不同粒径的荧光微球的使用克服了单荧光微球存在的低值灵敏度和检测线性范围无法兼顾的问题；
[0026]通过引入生物素亲和素级联放大系统，进一步提高了检测灵敏度；
[0027]将应用两种不同粒径荧光微球定量检测ΝΤ-ρι.οΒΝΡ的荧光免疫层析试剂条组装于彼此相互紧扣的扣盖和基座中，形成试剂卡。试剂卡易于携带、保存及在荧光检测仪中读数。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1本实用新型的试剂条的俯视图。
[0029]图2本实用新型的试剂条的侧视图。
[0030]图3本实用新型的试剂卡的俯视图。
[0031]附图标记:
[0032]I底板、2样品结合垫、3包被膜、4吸水纸、5大粒径荧光微球、6小粒径荧光微球、7检测带、8质控带、9扣盖、10基座、11加样区和12检测区。
【具体实施方式】
[0033]下文中将参照附图来更详细地描述示例性实施方式。所述附图用于图示说明本实用新型，而非对其进行限制。在附图中，为了清楚的说明，放大了试剂条部分区域的尺寸及其相对比例。
[0034]图1是本实用新型的试剂条的俯视图。如图1所述，本实用新型的试剂条包括在底板I上依次顺序搭接粘贴的样品结合垫2、包被膜3及吸水纸4，样品结合垫I上同时包被有由两种不同粒径荧光微球5和6标记的NT-proBNP第一抗体和由生物素标记的识别不同表位的NT-proBNP第二抗体，包被膜3上包被有相间隔的检测带7和质控带8，检测带7固定有亲和素，质控带8固定有抗鼠IgG的抗体。
[0035]样品结合垫2用于接收和结合样品，其在试剂条的结构中与包被膜3搭接。相比于传统采用将样品垫和结合垫分开设计的方法，本实用新型的试剂条将二者结合为一体，从而大大简化了生产工艺及流程。样品结合垫2的材料可由选自玻璃纤维素膜或者聚酯膜、棉纤的材料制成，优选由玻璃纤维素膜制成。
[0036]样品结合垫2上布置有与N末端脑钠肽前体反应的抗体。具体地，本实用新型的样品结合垫2上布置有两种抗N末端脑钠肽前体的抗体，即第一抗体和第二抗体，其中第一抗体由两种不同粒径荧光微球5和6分别标记，第二抗体由生物素标记。第一抗体和第二抗体分别识别N末端脑钠肽前体的不同抗原表位。大粒径的荧光微球5标记的抗体有利于低值的检测以达到灵敏度的要求，而小粒径的荧光微球6标记的抗体使得检测的线性范围可覆盖高值区域。
[0037]在一个实施方式中，所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小范围在50nm-400nm之间，优选地，所述两种不同粒径大小的焚光微球的粒径大小分别为10nm和300nm。由于采用两种粒径大小的荧光微球，本实用新型的试剂条可同时实现高灵敏度和宽检测线性范围的要求。
[0038]在一个实施方式中，所述焚光微球上具有选自以下的焚光物质:Cy3焚光素、Cy5荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(TAMRA)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)。在一个实施方式中，荧光微球上具有Cy5荧光素。
[0039]包被膜3用于布置与检测带7和质控带8。包被膜3位于样品结合垫2和吸水纸4之间，且分别与样品结合垫2和吸水纸4搭接。包被膜3可由选自由硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜、玻纤硝纤混合膜的材料制成，优选由硝酸纤维素膜制成。
[0040]检测带7上固定有亲和素。本实用新型的试剂条通过采用双抗体夹心法并同时引入生物素-亲和素级联放大系统，进一步提高了检测灵敏度。质控带8固定有抗鼠IgG的抗体。质控带8用于确定反应体系是否成立，并通过计算检测带7与质控带8的荧光信号值以精确进行定量。
[0041]吸水纸4可由选自由棉绒、玻纤的材料制成，优选由棉绒制成。
[0042]图2是显示本实用新型的试剂条的侧视图。对图2不再进行重复描述。
[0043]图3是本实用新型的试剂卡的俯视图。
[0044]如图3所述，本实用新型还提供了一种试剂卡，所述试剂卡包括前述的试剂条和包覆试剂条的外壳，试剂卡的外壳包括扣盖9和基座10，扣盖9上设置有加样区11和检测区12，加样区11开口在样品结合垫2的上方，以暴露出样品结合垫2的部分区域，检测区12开口在包被膜3的上方，以暴露出检测带7和质控带8的全部区域。扣盖10和基座11均可由诸如塑料制成。
[0045]试剂卡易于携带和保存，可实现在相应的荧光检测仪中对试剂条检测结果的分析。
[0046]实施例
[0047]以下实施例用于说明本实用新型，但不应理解为限于在此阐述的实施例。
[0048]下述实施例中，所述NT-proBNP第一抗体、NT-proBNP第二抗体、抗鼠IgG抗体、Cy3焚光素标记的焚光微球、Cy5焚光素标记的焚光微球、异硫氰酸焚光素(FITC)标记的焚光微球、四乙基罗丹明(TAMRA)标记的荧光微球、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的荧光微球、亲和素、生物素、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、N，f -二环己基碳二亚胺(DCC)、吡啶、牛血清白蛋白(BSA)、Tween-20、海藻糖、玻璃纤维素膜、聚酯膜、硝酸纤维素膜、高强度吸水纸均为市售产品。
[0049]所述应用两种不同粒径荧光微球定量检测N末端脑钠肽前体的荧光免疫层析试剂条和试剂卡的制备方法为:
[0050]I)样品结合垫的制备
[0051]A、样品结合垫的预处理
[0052]将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入样品结合垫处理液(含有1% BSA和0.1%Tween-20的0.1Μ，ρΗ8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有1% BSA和0.1% Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3_5小时后，于35_39°C鼓风干燥箱中烘干3-5小时。
[0053]B、标记抗体的两种不同粒径荧光微球的制备
[0054]将NT-proBNP第一抗体以0.1M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液4°C透析过夜，调整浓度为 2mg/ml-5mg/ml。
[0055]使用0.05M，pH4.5-5.0的2_ (N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤50_200nm的小粒径焚光微球(选自Cy3焚光素标记的焚光微球、Cy5焚光素标记的焚光微球、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荧光微球、四乙基罗丹明(TAMRA)标记的荧光微球、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的荧光微球中的任意一种)，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤荧光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的第一抗体，使第一抗体与荧光微球的质量比为I: 8至I: 60，室温反应2小时后，加入含有10%BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤荧光微球，用含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
[0056]使用0.05M，pH4.5-5.0的2_ (N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤200_500nm的大粒径焚光微球(选自Cy3焚光素标记的焚光微球、Cy5焚光素标记的焚光微球、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荧光微球、四乙基罗丹明(TAMRA)标记的荧光微球、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的荧光微球中的任意一种)，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤荧光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的第一抗体，使第一抗体与荧光微球的质量比为1: 20至1: 80，室温反应2小时后，加入含有10% BSA的0.02M，PH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤荧光微球，用含有1% BSA和0.1%Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
[0057]将上述标记第一抗体的两种不同粒径的荧光微球按1: 10到10: I的比例进行混匀，即制备出标记抗体的两种不同粒径荧光微球。
[0058]C、生物素化抗体的制备
[0059]将NT-proBNP第二抗体以0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液4°C透析过夜，调整浓度为 5mg/ml-10mg/ml。
[0060]生物素的预活化:准确称取300mg生物素溶解于8ml的二甲基甲酰胺(DMF)中，室温条件下加入183mg的N-轻基琥泊酰亚胺(NHS)，304mg的N，N' - 二环己基碳二亚胺(DCC)及0.1ml的吡啶，将反应混合物在室温下搅拌24小时。过滤除去反应产生的尿素，滤液浓缩后通过硅胶柱色谱纯化，在异丙醇中重结晶得到的白色固体即为预活化的生物素。
[0061]用二甲基甲酰胺(DMF)溶解预活化的生物素，使其终浓度为0.05M，并加入到透析过的第二抗体中，使得第二抗体与生物素的摩尔比为1: 10-1: 25，室温反应I小时，以0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液4°C透析过夜。
[0062]D、样品结合垫的制备
[0063]将上述步骤B制备获得的标记抗体的两种不同粒径荧光微球与步骤C制备获得的生物素化抗体充分混勾，使用定量喷膜仪以2 μ l/cm-8 μ 1/cm均勾喷涂于上述步骤A中预处理过的玻璃纤维素膜或者聚酯膜上，于35_39°C鼓风干燥箱中烘干2-4小时，加入干燥剂封存备用。
[0064]2)包被膜的制备
[0065]A、检测带的制备:使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02M，ρΗ7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将亲和素稀释到lmg/ml-5mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以1.2 μ I/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于35-39°C鼓风干燥箱中烘干2_4小时。
[0066]B、质控带的制备:使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02M，ρΗ7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将抗小鼠IgG稀释到0.5mg/ml-3mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以
0.8 μ 1/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于35-39°C鼓风干燥箱中烘干2_4小时。
[0067]C、包被膜的制备:用封闭液(含有1-10% BSA和1-10 %海藻糖的0.01-0.02M，PH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将含有检测带和质控带的硝酸纤维素膜封闭1_2小时，取出后置35-39°C鼓风干燥箱中烘干2-4小时，封袋备用。
[0068]3)试剂条的组装
[0069]在湿度小于30%，温度20_30°C条件下进行试剂条的组装。底板选用PVC材料，在底板同一面的方向顺次连接且相邻部位部分重叠的样品结合垫、包被膜及吸水纸，重叠区域的重叠长度为1_3_。在包被膜粘覆底板时，检测带的位置靠近样品结合垫，质控带的位置靠近吸水纸。吸水纸为高强度吸水纸。组装好后进行裁剪，形成宽度为0.2cm-lcm的试剂条。
[0070]4)试剂卡的组装
[0071]在湿度小于30%，温度20_30°C条件下进行试剂卡的组装。将上述试剂条置于塑料基座的中间位置，使试剂条的底板与塑料基座相连，并扣合塑料扣盖。扣盖上设置有加样孔和检测孔，加样孔开口于样品结合垫的上侧，暴露出样品结合垫的部分区域，检测孔开口于包被膜的上侧，暴露出检测带和质控带的全部区域。
[0072]5)校准品及待检样品的测定
[0073]将100 μ I的标准品或者待检样品加入到试剂卡的加样孔，进行免疫层析反应，10-15分钟后将试剂卡置于专门的荧光检测仪中，通过读取荧光信号的大小进行定量测定。
[0074]本实用新型所提供的应用两种不同粒径荧光微球定量检测N末端脑钠肽前体的荧光免疫层析试剂条和试剂卡兼顾了低值灵敏度和检测的线性范围，且可以实现快速、单人份定量检测，加之体积小、易于携带和保存，为临床使用提供了极大便利。另外，相比传统的检测ΝΤ-ρι.οΒΝΡ的含有样品垫、结合垫、包被膜、吸水纸四个部分的荧光层析试剂条，本实用新型所提供的试剂条仅含有样品试剂垫、包被膜、吸水纸三个部分，因此其更加简化，制备方法更加简单，可以实现批量生产，有利于大规模推广应用，具备广阔的市场前景。
[0075]以上实施例仅仅是为了清楚地说明所做的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上可以做出其他的改进和润饰，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申的显而易见的改进和润饰仍处在本实用新型的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种定量检测N末端脑钠肽前体的试剂条，其特征在于，所述试剂条包括底板以及在底板上依次顺序搭接粘贴如下部件: i)同时包被有由两种不同粒径荧光微球标记的抗N末端脑钠肽前体的第一抗体和由生物素标记的抗N末端脑钠肽前体的第二抗体的样品结合垫，其中所述第一抗体和第二抗体分别特异性识别N末端脑钠肽前体的不同表位， ?)包被有相间隔的检测带和质控带的包被膜，其中所述检测带固定有亲和素，所述质控带固定有抗鼠IgG的抗体，和iii)吸水纸。
2.如权利要求1所述的试剂条，其特征在于，所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小范围在50nm-400nm之间。
3.如权利要求2所述的试剂条，其特征在于，所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小分别为10nm和300nm。
4.一种定量检测N末端脑钠肽前体的试剂卡，其特征在于，所述试剂卡包括: i)权利要求1-3之一所述的定量检测N末端脑钠肽前体的试剂条；和 ?)包覆所述试剂条的外壳，其中所述外壳包括彼此连接的以下部件:?-D设置有加样区和检测区的扣盖，其中所述加样区开口在所述样品结合垫的上方以暴露出所述样品结合垫的部分区域，所述检测区开口在所述包被膜的上方以暴露出所述检测带和所述质控带的全部区域，和i1-2)基座。
5.如权利要求4所述的试剂卡，其特征在于，所述扣盖由塑料制成。
6.如权利要求4所述的试剂卡，其特征在于，所述基座由塑料制成。
【文档编号】G01N33/68GK204228723SQ201420674227
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】刘勇, 祁双, 程海, 宋小力, 宋芳, 朱世伟, 李鼎锋, 戈军 申请人:江苏达骏生物科技有限公司