专利名称：作为血管肽酶抑制剂的带有n－末端2－酰硫基的二肽衍生物的制作方法
发明概述本发明涉及下面所描述的新型血管肽酶抑制剂，其可用作血管紧张素转化酶(ACE)和中性肽链内切酶(NEP，EC 3.4.24.11)的双重抑制剂。本发明的化合物特别可用于治疗和/或预防对ACE和NEP的抑制有响应的情况，特别是心血管病症，如高血压、单独的收缩期高血压、肾衰(包括水肿和盐潴留)、肺水肿、左心室肥大、心衰(包括充血性心衰)和动脉粥样硬化。本发明的化合物还可用于降低哺乳动物升高的胆固醇血浆水平。此外，其还可以抑制内皮缩血管肽转化酶(ECE)并可用于治疗和/或预防对ECE的抑制有响应的情况。
由于其对中性肽链内切酶的抑制作用，本发明的化合物还可以用于治疗疼痛、抑郁、某些精神病情况和认识病症。其它可能的适应症包括治疗心绞痛、月经前综合征、梅尼埃尔氏病、醛甾酮过多症、高钙尿症、腹水、青光眼、哮喘和胃肠病症如腹泻、过敏性肠综合征和胃酸过多。
由于其对ECE的抑制作用，本发明的化合物还可用于治疗和/或预防内皮缩血管肽依赖性的情况和疾病，包括脑缺血(中风)、蛛网膜下出血、创伤性脑损伤、脑血管痉挛、动脉肥大、再狭窄、雷诺氏病、心肌梗死、肥胖；以及前列腺增生、偏头痛、糖尿病(糖尿病性肾病)、先兆子痫、青光眼和移植排斥反应如在主动脉或实体器官移植中的排斥反应；以及勃起功能障碍。
本发明的详细说明本发明涉及式I的化合物
其中R表示氢、低级烷基、碳环或杂环芳基-低级烷基或环烷基-低级烷基；R1表示低级烷基、环烷基、碳环或杂环芳基、或联芳基；或R1表示(环烷基、碳环芳基、杂环芳基或联芳基)-低级烷基；alk表示低级亚烷基；R3表示氢或酰基；R4表示氢、取代或未取代的低级烷基、碳环或杂环芳基、(碳环或杂环芳基)-低级烷基、环烷基、环烷基-低级烷基、联芳基、联芳基-低级烷基；氧杂环烷基、硫杂环烷基、氮杂环烷基、或(氧杂环烷基、硫杂环烷基或氮杂环烷基)-低级烷基；R5表示氢或低级烷基；或R4和R5和与之相连的碳原子一起表示亚环烷基、苯并-稠合的亚环烷基；或5-或6-元(氧杂亚环烷基、硫杂亚环烷基或氮杂亚环烷基)，各基团都可以是未取代的或被低级烷基或芳基-低级烷基所取代；R6表示低级烷基、碳环或杂环芳基、(碳环或杂环芳基)-低级烷基、环烷基、环烷基-低级烷基、联芳基或联芳基-低级烷基；R7表示低级烷基、(碳环或杂环芳基)-低级烷基、环烷基-低级烷基或联芳基-低级烷基；或R6和R7和与之相连的碳原子一起表示3-至10-元亚环烷基，其可以被低级烷基或芳基-低级烷基所取代或者可以与一个饱和或不饱和的5-至7-元碳环稠合；或表示5-或6-元(氧杂亚环烷基、硫杂亚环烷基或氮杂亚环烷基)，其均可以是未取代的或被低级烷基或芳基-低级烷基所取代；或2，2-亚降冰片基；X表示-O-、-S(O)n-、-NHSO2-或-NHCO-
n是0、1或2；且COOR2表示羧基或以可药用酯的形式衍生化的羧基；或由其中R3是氢的所述化合物衍生的二硫化物衍生物；或其可药用的盐。
本发明还涉及包含所述化合物的药物组合物；所述化合物的制备方法；中间体；和在哺乳动物中治疗对ACE和NEP的抑制有响应的病症的方法，该方法包括给需要进行该类治疗的哺乳动物施用所述的化合物。
本发明还包括具有游离羧基、巯基或羟基的本发明化合物的任何前体药物衍生物，所说前体药物衍生物可通过溶剂分解或在生理学条件下转化成游离羧基、巯基和/或羟基化合物。前体药物衍生物有例如游离羧酸的酯和硫醇、醇或苯酚的S-酰基和O-酰基衍生物，其中所述的酰基具有文中所定义的含义。
可药用的酯优选是前体药物的酯衍生物，其可通过溶剂分解或在生理学条件下被转化成式I的游离羧酸。
可药用的前体药物酯优选是例如低级烷基酯、芳基-低级烷基酯、α-(低级烷酰氧基)-低级烷基酯如新戊酰氧基甲酯，和α-(低级烷氧基羰基、4-吗啉基羰基、1-哌啶基羰基、1-吡咯烷基羰基或二-低级烷基氨基羰基)-低级烷基酯。
可药用盐是得自可药用碱的本发明任何酸性化合物、例如其中COOR2表示羧基的化合物的盐。该类盐有例如碱金属盐(例如钠盐、钾盐)、碱土金属盐(例如镁盐、钙盐)、胺盐(例如氨丁三醇盐)。
根据取代基的性质，式I的化合物可以具有两个或多个不对称碳原子。本发明也包括所得的非对映异构体和光学对映体。在式Ia中表示了优选的构型。
其中带有取代基-alk-X-R1和R4的不对称碳一般具有S-构型。
优选的是其中R和R5表示氢；R1表示低级烷基、C5-或C6-环烷基、碳环或杂环芳基或(碳环或杂环芳基)-低级烷基；alk表示低级亚烷基；X表示-O-或-S(O)n，其中n表示0或2；R3表示氢或酰基；R4表示取代或未取代的低级烷基、氧杂环烷基、氧杂环烷基-低级烷基或(碳环或杂环芳基)-低级烷基；R5表示氢；或R4和R5和与之相连的碳原子合在一起表示C5或C6-亚环烷基；R6和R7表示低级烷基；或R6和R7和与之相连的碳原子合在一起表示5-或6-元亚环烷基；COOR2表示羧基或以可药用酯的形式衍生化的羧基的式I和Ia的化合物；得自其中R3是氢的所述化合物的二硫化物衍生物；和其可药用的盐。
进一步优选的是其中R和R5表示氢；R1表示碳环或杂环芳基或(碳环或杂环芳基)-低级烷基；R3表示氢或取代或未取代的低级烷酰基；R4表示低级烷基、环烷基、四氢吡喃基或C1-C4-低级烷氧基-低级烷基；R6和R7都表示C1-C4-烷基并且是相同的；X表示-O-或-S-；alk表示亚甲基；COOR2表示羧基、低级烷氧基羰基、(二-低级烷基氨基羰基)-低级烷氧基羰基或(4-吗啉基羰基、1-哌啶基羰基或1-吡咯烷基羰基)-低级烷氧基羰基的所述式I或Ia的化合物；和其可药用的盐。
特别优选的是其中R和R5表示氢；R1表示碳环芳基或碳环芳基-低级烷基，其中所述的碳环芳基表示苯基或被一个或两个羟基、低级烷酰氧基、低级烷基、低级烷氧基、三氟甲基、三氟甲氧基或卤代所取代的苯基；R3表示氢、低级烷酰基或被低级烷氧基所取代的低级烷酰基；R4表示低级烷基、4-四氢吡喃基或C1-C4-低级烷氧基-C1-C4-低级烷基；R6和R7表示甲基；X表示-O-；alk表示亚甲基或亚乙基；并且COOR2表示羧基或低级烷氧基羰基的所述式I或Ia的化合物；和其可药用的盐。其一个实施方案涉及其中R3表示氢或低级烷酰基的化合物。
进一步优选的化合物是其中R和R5表示氢；R1表示苯基、氟苯基、苄基或氟苄基；R3表示氢、低级烷酰基或被低级烷氧基所取代的低级烷酰基；R4表示异丙基、叔丁基、1-甲氧基乙基或4-四氢吡喃基；R6和R7表示甲基；x表示-O-；alk表示亚甲基；和COOR2表示羧基或低级烷氧基羰基的上述的式I和Ia的化合物；和其可药用的盐。其一个实施方案涉及其中R3表示氢或低级烷酰基的化合物。
特别优选的实施方案涉及其中R和R5表示氢；R1表示苄基；R3表示氢、乙酰基或甲氧基乙酰基；R4表示异丙基或叔丁基；R6和R7表示甲基；X表示-O-；alk表示亚甲基；并且COOR2表示羧基或乙氧基羰基的式I或Ia的化合物；或其可药用的盐。
除非特别说明，否则所述定义或文中所联用的定义在本发明的范围内具有如下的含义。
芳基表示单环或双环的碳环或杂环芳基。
单环的碳环芳基表示取代或未取代的苯基，其优选地是苯基或被一至三个取代基所取代的苯基，优选被低级烷基、羟基、低级烷氧基、酰氧基、卤素、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、氨基、低级烷酰基氨基、低级烷基-(硫基、亚磺酰基或磺酰基)、低级烷氧基羰基、单-或二-低级烷基氨基甲酰基、或单-或二-低级烷基氨基所取代；或被低级亚烷基二氧基所取代的苯基。
双环的碳环芳基表示1-或2-萘基或优选地表示被低级烷基、低级烷氧基或卤素所取代的1-或2-萘基。
单环的杂环芳基优选地表示取代或未取代的噻唑基、嘧啶基、三唑基、噻吩基、呋喃基或吡啶基。
取代或未取代的呋喃基表示2-或3-呋喃基或优选地表示被低级烷基所取代的2-或3-呋喃基。
取代或未取代的吡啶基表示2-、3-或4-吡啶基或优选地表示被低级烷基、卤素或氰基所取代的2-、3-或4-吡啶基。
取代或未取代的噻吩基表示2-或3-噻吩基或优选地表示被低级烷基所取代的2-或3-噻吩基。
取代或未取代的嘧啶基表示例如2-嘧啶基或被低级烷基所取代的2-嘧啶基。
取代或未取代的噻唑基表示例如2-噻唑基或被低级烷基所取代的2-噻唑基。
取代或未取代的三唑基表示例如1，2，4-三唑基或优选地表示被低级烷基所取代的1，2，4-三唑基。
双环杂环芳基优选表示未被取代或被羟基、低级烷基、低级烷氧基或卤素取代的吲哚基、苯并噻唑基、喹啉基或异喹啉基，优选3-吲哚基、2-苯并噻唑基或2-或4-喹啉基。
芳基-低级烷基中的芳基优选苯基或被一个或两个低级烷基、低级烷氧基、羟基、低级烷酰氧基、卤素、三氟甲基、氰基、低级烷酰基氨基或低级烷氧基羰基所取代的苯基；还可以是取代或未取代的萘基。
芳基-低级烷基优选是苄基或1-或2-苯乙基，其在苯基上可任选地被一个或两个低级烷基、低级烷氧基、羟基、低级烷酰氧基、卤素或三氟甲基所取代。
本文中，分别在有机基团或化合物中涉及的术语“低级”定义的是其具有最多7个并包括7个碳原子，优选具有最多4个并包括4个碳原子，并有利地包括一个或两个碳原子。其可以是直链或支链的。
取代或未取代的低级烷基指的是低级烷基或被例如卤代、羟基、低级烷氧基、氨基、(单-或二-低级烷基)氨基、酰基氨基、1-低级烷基-4-哌嗪基、4-吗啉基、1-哌啶基、1-吡咯烷基等等所取代的低级烷基。
低级亚烷基指的是优选地具有1至4个碳原子的直链或支链碳链，其可以被例如低级烷氧基所取代，例如-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2CH2-等等。
低级烷基优选包含1-4个碳原子，其可以是直链或支链的并且表示例如乙基、丙基、丁基或有利地是甲基。
低级烷氧基优选包含1-4个碳原子，其可以是直链或支链的并且表示例如甲氧基、丙氧基、异丙氧基或有利地是乙氧基。
环烷基表示饱和的环烃基，其优选包含5-至7-个环碳原子，并优选是环戊基或环己基。
氧杂环烷基优选表示5-至7-元氧杂环烷基，例如，四氢吡喃基，如4-四氢吡喃基。
硫杂环烷基优选表示5-至7-元硫杂环烷基，例如，四氢噻喃基，如4-四氢噻喃基。
氮杂环烷基优选表示5-至7-元氮杂环烷基，例如，其中的氮可以被低级烷基或芳基-低级烷基所取代的吡咯烷基或哌啶基。
术语环烷基-低级烷基优选表示(环戊基或环己基)-甲基、1-或2-(环戊基或环己基)乙基、1-、2-或3-(环戊基或环己基)丙基或1-、2-、3-或4-(环戊基或环己基)-丁基。(氧杂环烷基、硫杂环烷基或氮杂环烷基)-低级烷基与此类似。
低级烷氧基羰基优选在其中的烷氧基部分包含1至4个碳原子并表示例如甲氧基羰基、丙氧基羰基、异丙氧基羰基或有利地是乙氧基羰基。
亚环烷基是3-至10-元，优选地为5-或6-元环，并表示环烷烃连接基团，其中所连接的两个基团连接到该环烷烃环的相同碳上。
5-或6-元氧杂亚环烷基表示四氢呋喃或四氢吡喃连接基团，即亚四氢呋喃基或亚四氢吡喃基，其中所连接的两个基团连接于各环的相同碳原子上，例如在其3-或4-位上。
5-或6-元硫杂亚环烷基表示四氢噻吩或四氢噻喃连接基团，其中所连接的两个基团连接于各环的相同碳原子上，例如在其3-或4-位上。
5-或6-元氮杂亚环烷基表示吡咯烷或哌啶连接基团，其中所连接的两个基团连接于各环的相同碳原子上，例如，在其3-或4-位上，并且该氮可以被低级烷基，例如甲基或被芳基-低级烷基，例如苄基所取代。
苯并-稠合的亚环烷基表示，例如，1，1-或2，2-四氢萘亚基或1，1-或2，2-2，3-二氢化茚亚基。
卤素(卤代)优选表示氟或氯，但也可以是溴或碘。
酰基得自羧酸并优选表示未取代的或取代的低级烷酰基、碳环芳基-低级烷酰基、芳酰基、低级烷氧基羰基或芳基-低级烷氧基羰基，有利地是取代或未取代的低级烷酰基或芳酰基。
低级烷酰基优选地是乙酰基、丙酰基、丁酰基或新戊酰基。
取代或未取代的低级烷酰基，例如表示低级烷酰基或被例如，低级烷氧基羰基、低级烷酰氧基、低级烷酰硫基、低级烷氧基、低级烷硫基、羟基、二-低级烷基氨基、低级烷酰基氨基、4-吗啉基、1-哌啶基、1-吡咯烷基、1-低级烷基-4-哌嗪基、芳基或杂芳基所取代的低级烷氧基。
芳酰基是碳环或杂环芳酰基，优选地是单环的碳环或单环的杂环芳酰基。
单环的碳环芳酰基优选地是苯甲酰基或被低级烷基、低级烷氧基、卤素或三氟甲基所取代的苯甲酰基。
单环的杂环芳酰基优选地是吡啶基羰基或噻吩基羰基。
酰氧基优选地是取代或未取代的低级烷酰氧基、低级烷氧羰基氧基、单环的碳环芳酰氧基或单环的杂环芳酰氧基。
芳基-低级烷氧基羰基优选地是单环的碳环-低级烷氧基羰基，有利地是苄氧基羰基。
联芳基表示被单环的碳环或单环的杂环芳基所取代的单碳环芳基，并且优选地表示联苯基，有利地是未被取代或在一个或两个苯环上被低级烷基、低级烷氧基、卤素或三氟甲基所取代的4-联苯基。
联芳基-低级烷基优选地是4-联苯基-低级烷基，有利地是4-联苯基-甲基。
本发明的新型化合物是抑制血管紧张素I转化成升高血压的物质——血管紧张素II的ACE抑制剂，因此其可降低哺乳动物的血压。此外，本发明的化合物还表现出抑制NEP的作用，因此其加强了心钠素(ANF)的心血管(例如利尿和尿钠排泄)作用。该联合作用对哺乳动物的心血管病症，特别是高血压、心脏病症如充血性心衰和肾衰有益。本发明化合物在治疗所述的心血管病症时进一步有益的作用是ECE的抑制作用。
利用哺乳动物，例如小鼠、大鼠、狗、猴或离体器官、组织或其制备物在体外和体内试验中证实了上面所列举的性质。所述的化合物可以以溶液的形式，例如优选地以水溶液的形式用于体外试验，并且可以进行肠内、胃肠外给药，有利地以口服(p.o.)或静脉内(i.v.)给药的形式，例如混悬液或水溶液的形式用于体内试验。体外试验所用剂量为约10-6摩尔至10-9摩尔浓度。根据给药途径，体内试验所用剂量可以为约0.01至50mg/kg，有利地为约0.1至25mg/kg。
在体外试验中最适当的是本发明的游离羧酸。该试验化合物被溶解于二甲基亚砜、乙醇或0.25M碳酸氢钠溶液中，并用水将该溶液稀释至所需浓度。
可以使用与Biochem.Pharmacol.，第20卷，1637页(1971)中所给出的方法相似的方法来证明本发明化合物对ACE的体外抑制作用。用于ACE试验的缓冲液为300mM NaCl，100mM KH2PO4(pH 8.3)。通过向包含体积为150μL的酶和药物的管中加入100μL苯甲酰氨基乙酰-组氨酰基-亮氨酸(2mg/mL)来开始反应，将该管在37℃下培养30分钟。通过加入0.75mL0.6N NaOH来终止反应。向该管中加入100μL新制备的O-邻苯二醛溶液(在甲醇中，2mg/mL)，将管中的内含物进行混合并将其在室温下静置。在10分钟后，向其中加入100μL 6N的HCl。将该管进行离心，在360nM下对上清液的光密度进行读数。用结果对药物浓度作图以测定IC50，即，给出的活性为不含药物的对照样品活性的一半时的药物浓度。
一般而言，本发明的化合物表现出的ACE抑制的IC50为约0.1-50nM。
例如，本发明实施例6(a)的化合物在ACE体外试验中表现出的IC50为约20nM。
在口服或静脉内给药的体内试验中，可通过测量其对血管紧张素I在血压正常的大鼠体内诱导的血压升高的响应的抑制作用来证明ACE的抑制作用。
将化合物静脉内给药的体内试验是用血压正常的清醒的雄性大鼠进行的。分别对股动脉和股静脉进行插管，用于在血管紧张素I的静脉内给药或本发明化合物的静脉内或口服给药时直接测量血压。在血压基本稳定后，以15分钟的间隔静脉内注射300ng/kg血管紧张素I进行攻击3或4次，测定血压升高的响应。在试验化合物静脉内或口服给药后15、30、60和90分钟，然后每个小时直至6小时再次测定血压响应，并与开始的反应相比。任何观察到的所述血压升高响应的降低都是ACE抑制的象征。
例如，在以10mg/kg的剂量静脉内给药时，实施例6(a)的化合物在3小时内抑制了血管紧张素I诱导的血压升高响应。同样，实施例1(a)的化合物在以11.8mg/kg的剂量口服给药时，在6小时内抑制了血管紧张素I诱导的血压升高响应。
NEP(EC 3.4.24.11)的体外抑制作用按照如下描述进行测定采用改良的Orlowski和Wilk(1981)所述的方法，通过底物戊二酰基-Ala-Ala-Phe-2-萘基酰胺(GAAP)的水解测定NEP 3.4.24.11的活性。该培养混合物(总体积125μL)包含4.2μL蛋白(按照Maeda等人，1983的方法所制备的大鼠肾皮质膜)、50mM tris缓冲剂(在25℃下pH为7.4)、500μM底物(终浓度)和亮氨酸氨基肽酶M(2.5μg)。将该混合物在25℃下培养10分钟，然后向其中加入100μL坚牢紫酱(fast garnet)(250μg坚牢紫酱/mL 10％吐温20在1M pH4.2的醋酸钠中的溶液)。在540nm下用分光光度法对酶活性进行测定。将NEP 24.11活性的一个单位定义为在25℃和7.4的pH下，每分钟释放1nmol的2-萘胺。测定了IC50值，即将2-萘胺的释放抑制50％时所需的试验化合物的浓度。
还可以用ANF作为底物来对NEP活性进行测定。采用3-分钟反相-HPLC分离，通过测定大鼠-ANF(r-ANF)的消失来测定ANF降解活性。将在pH为7.4的50mM tris HCl中的酶的等分试样在37℃下预培养2分钟，通过加入总体积为50μL的4nmol r-ANF来开始进行反应。在4分钟后，通过加入30μL 0.27％三氟醋酸(TFA)来终止反应。将活性的一个单位定义为在37℃和7.4的pH下，每分钟水解1nmol的r-ANF。测定了IC50值，即将ANF的水解抑制50％时所需试验化合物的浓度。
一般而言，本发明的化合物在NEP抑制中表现出的IC50为约0.1-50nM。
例如，实施例6(a)的化合物在GAAP体外试验中表现出约5nM的IC50。
可以用如下所述的方法测定本发明的化合物对大鼠血浆ANF浓度的影响
将雄性Sprague-Dawley大鼠(275-390g)用氯胺酮(150mg/kg)/乙酰丙嗪(10％)进行麻醉并将导管安装在股动脉和静脉中以分别获得血液样品和注入ANF。用一种旋转系统对大鼠进行束缚并在以清醒、未麻醉的状态进行研究前使其恢复24小时。
在试验中，在存在和不存在NEP抑制的情况下测定血浆ANF水平。在研究的当天，在整个实验的5小时期间内，对所有的大鼠用ANF以450ng/kg/分钟的剂量连续静脉内输注。在开始输注后60分钟，获得用于基准ANF测量的血样(0时间)，然后将大鼠随机分为用试验化合物或赋形剂进行处理的组。在将试验化合物进行给药后第30、60、120、180和240分钟再次采集血样。
通过特异性放射免疫分析对血浆ANF浓度进行测定。将血浆用包含50mM tris(pH6.8)、154mM NaCl、0.3％牛血清白蛋白、0.01％EDTA的缓冲液进行稀释(x12.5，x25和x50)。向100μL兔抗rANF血清中加入一百微升标准品[rANF(99-126)]或样品并将其在4℃下培养16小时。然后向反应混合物中加入10000cpm[125I]rANF并将其在4℃下培养16小时。然后向反应混合物中加入10000cpm[125I]rANF并将其在4℃下继续培养24小时。向该反应混合物中加入与顺磁性颗粒偶联的山羊抗兔IgG血清并通过使该混合物暴露于一种有引力的磁性支架而使结合的[125I]rANF聚集成团。将上清液轻轻倒出并用γ计数器对该团进行计数。所有的测定都是一式两份地进行的。将血浆ANF水平表示为在只接受了ANF(450ng/kg/分钟，静脉内)的用赋形剂进行处理的动物中所测定的这些值的百分比。
例如，在以11.8mg/kg的剂量口服给药时，实施例1(a)的化合物使血浆ANF水平增加了约70％。
可以例如用自发性高血压大鼠(SHR)和DOCA-盐高血压大鼠，分别根据例如Bazil等人，J.Cardiovasc.Pharmacol.，第22卷，897-905页(1993)和Trapani等人，J.Cardiovasc.Pharmacol.，第14卷，第419-424页(1989)的方法来测定抗高血压活性。
例如，在一天一次以11.8mg/kg的剂量口服给药时，实施例1(a)的化合物降低了清醒SHR的平均动脉压。
可以如下所述的用醋酸去氧皮质酮(DOCA)-盐高血压大鼠来测定抗高血压作用。
DOCA-盐高血压大鼠(280-380g)是通过标准方法进行制备的。对大鼠进行单侧肾切除术，在一星期后植入包含100mg/kg DOCA的硅橡胶小球。在三至五个星期的时间内给大鼠持续使用1％NaCl/0.2％KCl饮水直至建立了持续的高血压。在这时对抗高血压活性进行评估。
在实验前两天，将大鼠用甲氧氟烷进行麻醉并在其股动脉中安装导管以对动脉血压进行测定。四十八小时后，在一小时的时间内对基础动脉压和心率进行记录。然后将试验化合物或赋形剂给药，再过5小时后对相同的心血管参数进行监测。
可以用标准的利尿筛选或通过测量ANF在大鼠体内诱导的大鼠尿钠排泄和利尿作用的增强来对利尿(促尿钠排泄)活性进行测定，其中所述的标准的利尿筛选如在“新的抗高血压药物(New Anti-hypertensive Drugs)”，Spectrum出版，307-321页(1976)所描述的。
可以按照如下描述来测定ANF尿钠排泄作用的增强将雄性Sprague-Dawley大鼠(280-360g)用仲丁硫巴比妥进行麻醉(100mg/kg，腹膜内)并在股动脉、股静脉和膀胱中安放导管以分别对动脉压进行测量、将ANF进行给药并收集尿。在实验期间连续持续输入生理盐水(33μL/分钟)以促进利尿和钠排泄。该实验方案由最初15分钟的收集期(被称为预控制)以及随后的三个另外的收集期所组成。在完成预控制期后立即将试验化合物或赋形剂进行给药；在接下来的45分钟内什么也不做。然后在第二个收集期(被称为对照，15分钟)期间获得血压和肾测量数据。在这一时期结束时，将ANF对所有的动物进行给药(1μg/kg静脉内推注)，并在两个连续的15分钟收集期内测定动脉压和肾参数。在所有的收集期内都测定平均动脉压、尿流量和尿钠排泄。用Gould p50压力传感器对血压进行测定，通过重量分析来测定尿流量，通过火焰光谱法测定钠浓度，并以尿流量和尿钠浓度的乘积来计算尿钠排泄。
可以用如下所述的方法来进行ECE体外抑制作用的测定通过DE52阴离子交换柱色谱对得自猪大主动脉内皮细胞的ECE进行部分纯化，然后通过如Anal.Biochem.，第212卷，434-436页(1993)所述的放射免疫测定(RIA)来对其活性进行定量。或者，可以如例如在Cell，第78卷，473-485(1995)中所述，用ECE的重组形式来替代该天然酶。一些团体(Schmidt等人，FEBS Letters，第356卷，第238-243页(1994)；Kaw等人，第4届国际内皮素会议；4月23-25日，伦敦(UK)(1995)C6；Valdenaire等人，J.Biol.Chem.，第270卷，29794-29798页(1995)；Shimada等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，第207卷，807-812页(1995))已经对人ECE-1进行了描述。可以如Biochem.Mol.Biol.Int.，第31卷，第5期，861-867页(1993)所述的那样通过RIA测定由大ET-1所形成的ET-1来测定ECE的抑制作用。
或者，可以如下所述使用重组的人ECE-1(rhECE-1)将表达rhECE-1的中国仓鼠卵巢细胞(Kaw等人，第4届国际内皮素会议；4月23-25日，伦敦(UK)，(1995)C6)在包含10％胎牛血清和1x抗生素-抗真菌剂的DMEM/F12培养基中进行培养。通过刮除术来收集细胞，通过离心使其成团，将其在4℃下在包含5mM MgCl2，1μM胃蛋白酶抑制剂A，100μM亮抑蛋白酶肽，1mM PMSF和20mM Tris，pH 7.0的缓冲液中以2mL缓冲液/mL细胞的比例进行匀化。通过简短的离心来除去细胞碎片，然后将上清液在100,000×g下再离心30分钟。将所得沉积物以约15mg/mL的蛋白浓度重新悬浮于包含200mM NaCl和50mM Tes，pH7.0的缓冲液中并将其以等分试样的形式在-80℃下进行保存。
为了评估抑制剂对ECE-1活性的作用，将10μg蛋白与所需浓度的化合物一起在室温下在体积为10μL的50mM TES(pH7.0)和0.005％TritonX-100中预培养20分钟。然后加入人的大ET-1(5μL)至最终浓度为0.2μM。然后将该反应混合物在37℃下继续培养2小时。通过加入500μL包含0.1％Triton X-100、0.2％牛血清白蛋白和0.02％在磷酸盐缓冲盐水中的NaN3的RIA缓冲液来停止反应。
将得自上述酶试验的稀释样品(200μL)与[125I]ET-1(10,000cpm/管)和可特异性识别ET-A的羧基末端的色氨酸的1∶20,000-倍稀释的兔抗体各25μL一起在4℃培养过夜。然后向各管中加入偶联在磁性小球上的山羊抗兔抗体(70μg)，然后将该反应混合物在室温下继续培养30分钟。用一种磁性支架使该小球聚集成团。将上清液轻轻倒出，然后用γ计数器对该团的放射活性进行测定。分别在不存在非放射性ET-1和抗-ET抗体的情况下测定总的和非特异性的结合。在这些条件下，ET-1和大ET-1置换与抗体结合的[125I]ET-1的IC50值分别为21±2和260,000±66,000fmol(均值±SEM，n＝3-5)。
为了测定抑制剂的IC50值，测定各抑制剂的浓度-响应曲线。用ALLFIT程序的IBM-兼容版本来将数据拟合成一种单部位模型。
还可以如下所述通过测量对大ET-1-诱导的麻醉或清醒大鼠血压升高响应的抑制来测定体内的ECE抑制。如Biochem.Mol.Biol.Int.，第31卷，第5期，861-867页(1993)所述测定抑制剂对由大ET-1刺激所引起的血压升高响应的影响。将结果表示为与赋形剂相比大ET-1诱导的血压升高响应的抑制百分比。
将雄性Sprague-Dawley大鼠用仲丁硫巴比妥(100mg/kg，腹膜内)进行麻醉，并在其股动脉和静脉中放置导管以分别记录平均动脉压(MAP)和将化合物进行给药。进行气管切开术并将一根导管插入到气管中以确保气管开放。通过加热毯将动物的体温维持在37±1℃。在手术后，使MAP稳定化，然后用氯异吲哚胺(3mg/kg，静脉内)阻断自主的神经传递。然后，将大鼠用10mg/kg静脉内给药的化合物或赋形剂进行处理并在15和90分钟后用大ET-1(1nmol/kg，静脉内)进行攻击。一般将数据报告成大ET-1在用试验化合物或赋形剂进行处理的动物体内诱导的MAP的最大增加。
将雄性Sprague-Dawley大鼠用美索比妥钠(75mg/kg，腹膜内)进行麻醉并在其股动脉和静脉中放置导管以分别测定MAP和将药物进行给药。通过一种在大鼠恢复清醒后可自由活动的旋转系统将导管用线进行固定。在开始研究前使大鼠从该手术中恢复24小时。第二天，经由股动脉导管记录MAP并通过股静脉将试验化合物或赋形剂进行给药。在给药后的不同时间用大ET-1以1nmol/kg静脉内的剂量对动物进行攻击。根据剂量和方案，在足够的洗除期后，将动物用另一剂量的试验化合物或赋形剂重新进行试验。一般将数据报告为与用赋形剂进行处理的动物相比，在用试验化合物进行处理的动物中由大ET-1以2分钟的间隔所产生的MAP的变化。
还可以通过测定对大ET-1在清醒SHR体内诱导的血压升高响应的抑制作用来测定ECE的体内抑制，例如可以如Biochem.Biophys.Res.Commun.，第204卷，407-412页(1994)所述来进行测定。
通过皮下植入的微型渗透泵将试验化合物或赋形剂(1M NaHCO3)给雄性SHR(16-18周)进行给药。在第5天，将骨动脉和静脉导管放置在麻醉大鼠体内以分别测量MAP和将试验化合物进行给药。在48小时的恢复期后，通过与压力传感器相连的动脉导管对MAP进行记录(第7天)。在用氯异吲哚胺(10mg/kg，静脉内)进行神经节阻断前使血压和心率稳定30分钟。约15分钟后，将推注剂量的大ET-1(0.25nmol/kg，静脉内)给药于用赋形剂和试验化合物处理的大鼠。然后比较两组大鼠之间因对ET-1产生响应的血压变化。
通过测定对实验诱导的兔基底脑动脉收缩的抑制作用来证实对血管痉挛的抑制作用(Caner等人，J.Neurosurg.，第85卷，917-922页(1996)。
可以用Toxicology Letters，第112/113卷，453-459页(2000)所描述的鼠科动物腿窝淋巴结试验来测定本发明化合物可能有、也可能没有的不希望的免疫刺激的程度。
本发明的化合物例如可以用如下的步骤来进行制备a)将式II化合物
其中的符号alk、X、R、R1、R6和R7具有上面所定义的含义并且COOR2表示酯化的羧基，与式III的羧酸或其反应性的官能团衍生物进行缩合， 其中R4和R5具有上面所定义的含义；R3’表示氢或易于除去的S-保护基团，例如，酰基、叔丁基或取代或未取代的苄基；或b)将式IV的化合物或其反应性的官能团衍生物 其中符号R3’、R4-R5和R6-R7具有上面所定义的含义，与式V的氨基酸酯进行缩合 其中alk、X、R和R1具有上面所定义的含义并且COOR2表示酯化的羧基；或c)在碱性条件下将式VI的化合物 其中符号R、R1、COOR2、R4-R7、alk和X具有上面所定义的含义并且Y表示作为离去基团的反应性的酯化羟基(例如，氯或溴)，与式VII的化合物或其盐进行缩合R3′SH (VII)其中R3’表示一个易于除去的S-保护基团，例如酰基、叔丁基或取代或未取代的苄基；然后将所得的产物转换成其中R3是氢的式I的化合物；并且在上面所述的方法中，如果将任何干扰性的活泼基团临时保护起来，则除去所述的保护基团，然后将所得的本发明化合物分离出来；并且，如果需要的话，将所得的任何本发明的化合物转换成另一种本发明的化合物；和/或，如果需要的话，将游离的羧酸官能团转换成可药用的酯衍生物，或将所得的酯转换成游离的酸或另一种酯衍生物；和/或，如果需要的话，将所得的游离化合物转化成盐或将所得的盐转换成游离化合物或转化成另一种盐，和/或，如果需要的话，分离出异构体或外消旋体的混合物，和/或，如果需要的话，将得到的外消旋体拆分成光学对映体。
在可以通过本文所述的方法转化成本发明化合物的起始化合物和中间体中，所存在的官能团，如巯基、羧基、氨基和羟基基团可以任选地用制备有机化学中常用的常规保护基团进行保护。被保护的巯基、羧基、氨基和羟基可以在温和条件下被转化成游离的巯基、羧基、氨基和羟基而不会发生其它不需要的副反应。
引入保护基团的目的是要在用于进行所需化学转化的条件下保护该官能团不与反应组分发生不希望的反应。对于特定反应而言需不需要保护基团以及该保护基团的选择对于本领域技术人员而言是公知的并且取决于被保护官能团(巯基、羧基、氨基等等)的性质、取代基是其一部分的分子的结构和稳定性以及反应条件。
在例如J.F.W.McOmie，“有机化学中的保护基(Protecting Groups inOrganic Chemistry)”，Plenum Press，London，N.Y.(1973)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“有机合成中的保护基(Portecting Groups in OrganicSynthesis)”，Wiley，N.Y.第3版(1999)；和“肽(The Peptides)”，第I卷，Schroeder和Luebke，Academic Press，伦敦，N.Y.(1965)中对符合这些条件的众所周知的保护基团以及其引入和除去进行了描述。
根据方法(a)进行的涉及式II的胺与式III的酸或其官能团反应性衍生物的缩合的制备本发明化合物的方法是通过公知的肽合成方法来进行的。
根据方法(a)的式II的氨基酯与式III的游离羧酸的缩合有利地是在存在缩合剂如二环己基碳二亚胺或N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺和羟基苯并三唑、1-羟基-7-氮杂苯并三唑、氯代二甲氧基三嗪、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP试剂)或O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)和三乙胺或N-甲基吗啉的条件下，在惰性的极性溶剂如二甲基甲酰胺或二氯甲烷中进行的，优选在室温下进行。
式II的氨基酯与酰卤形式、有利地为酰氯或混合酸酐形式的式III的酸的反应性官能团衍生物的缩合在惰性溶剂如甲苯或二氯甲烷中，有利地在存在碱例如无机碱如碳酸钾或有机碱如三乙胺、N-甲基吗啉或吡啶的条件下进行，优选在室温下进行。
式III的反应性官能团衍生物优选地是酰卤(例如，酰氯)和混合酸酐，如新戊酰基或异丁氧基羰基酸酐，或活泼的酯如苯并三唑、7-氮杂苯并三唑或六氟苯基酯。
式II的原料可以根据本文所描述的方法和实施例中的描述来进行制备。
式II的原料的制备包括将式VIII的酯 其中alk、X、R和R1具有上面所定义的含义并且COOR2表示酯化的羧基(例如，其中R2是低级烷基或苄基)，用适宜的式IX的N-保护的氨基酸(或反应性官能团衍生物)进行酰化， 其中R6和R7具有上面所定义的含义并且R8是一种易于除去的氨基保护基，例如叔丁氧基羰基，从而获得相应的N-保护的式II化合物。
式VIII化合物与式IX化合物的缩合通过公知的肽合成方法来进行，例如如上所述的用于式II化合物与式III化合物进行缩合的方法。N-保护基根据现有技术中众所周知的方法进行除去，例如叔丁氧基羰基用无水的酸如三氟乙酸或HCl来除去。
始的式VIII和IX化合物氨基酯和酸在现有技术中是公知的或者如果是新的话可以根据现有技术中众所周知的方法例如本文中所阐述的方法来进行制备。式VIII的氨基酸酯优选是S-对映异构体。
式III的起始物质是公知的，或者如果是新的话可以根据常规方法来进行制备。该原料可以按照例如1993年1月27日公布的欧洲专利申请号524,553中的描述，从例如相应的外消旋或光学活性的α-氨基酸，通过将其转化成α-溴衍生物，然后的用式VII的适宜的硫醇衍生物在碱性条件下对其进行置换并发生构型反转来制备。所得最终产物的S-脱苄基作用通过还原性裂解来进行，例如，用阮内镍在乙醇中进行。S-脱酰基作用通过例如，用稀的氢氧化钠水溶液进行碱催化的水解来进行。式III的环状原料可以通过将环状羧酸(例如环戊烷甲酸)在存在强碱如二乙基氨基锂的情况下用硫处理来进行制备。
根据方法(b)进行的涉及式IV的酸与式V的氨基酸酯的缩合的本发明化合物的制备通过与方法(a)的方法相似的方法来进行。同样，式IV的原料是通过将式III的酸与相当于式IX的偕-二取代的氨基酸(其中R8现在是氢)的酯在与上述方法相似的条件下进行缩合，然后除去羧基保护基来进行制备的。
根据方法(c)进行的涉及用其盐形式的硫醇衍生物R3’-SH对式VI化合物中的离去基团Y进行置换的本发明化合物的制备是根据现有技术中众所周知的方法来进行的。
由Y表示的反应性的酯化羟基是被强的无机酸或有机酸酯化的羟基。相应的Y基团具体是卤素，例如氯、溴或碘，还可以是磺酰氧基，如低级烷基-或芳基磺酰氧基，例如，(甲烷-、乙烷-、苯-或甲苯-)磺酰氧基，还可以是三氟甲基磺酰氧基。
置换是在惰性溶剂，如二甲基甲酰胺或二氯甲烷中，在存在碱如碳酸钾、三乙胺、二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉等的情况下，在室温或升高的温度下进行的。当使用R3’SH的盐(例如，硫代乙酸钾)时，该反应是在不存在碱的情况下，在惰性溶剂如四氢呋喃或二甲基甲酰胺中进行的。
同样，式VI的原料可以通过将式II的二肽衍生物与式(X)的酸在方法(a)所描述的条件下进行反应来制备 其中R4、R5和Y具有上面所定义的含义。
其中Y是卤素的式X的化合物，如α-溴代羧酸是公知的，并且可以例如按照1999年11月4日公布的国际专利申请WO 99/55726中的描述进行制备。
具有侧链alk-X-R1的本发明化合物和中间体，例如，式II、V和VI的化合物，是用具有alk-X’侧链(其中X’表示氨基、羟基、巯基或适宜的离去基团)的相应化合物根据现有技术中公知的方法或本文中所列举的方法进行制备的。例如，式V的酸和酯可以由丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸等作为原料制得，优选为光学活性形式。
本发明的某些化合物和中间体可以根据现有技术中公知的一般反应相互转换。
可以通过与羧酸的反应性衍生物(相当于式I中的R3是酰基)，如酸酐或所述的氯化物进行反应而将游离的硫醇转化成S-酰基衍生物，该反应优选在存在碱如三乙胺的情况下在惰性溶剂如乙腈或二氯甲烷中进行。
可以将游离的醇和苯酚类化合物转化成相应的酰基衍生物，例如通过在存在碱如三乙胺的情况下将其与相应的酰氯进行反应来制备。
可以将其中R3表示氢的游离的硫醇类化合物氧化成相应的二硫化物，例如，通过空气氧化或用温和的氧化剂如在醇溶液中的碘来进行氧化。反过来，可以将二硫化物还原成相应的硫醇，例如用还原剂如硼氢化钠、锌和醋酸或三丁基膦来进行还原。
羧酸酯可以根据现有技术中众所周知的方法通过将羧酸与例如对应于R2-OH的卤化物在存在碱的情况下进行缩合来制备，或通过与过量的醇在存在酸催化剂的情况下进行反应来制备。
羧酸酯和S-酰基衍生物可以被水解，例如，用碱如碱金属碳酸盐或氢氧化物的水溶液来进行水解。可以按照本文中的描述选择性地除去S-酰基和酯基。
优选地，并且在任何可能的情况中，式Ia的本发明优选的异构体是用纯的对映异构体制备的。
在获得的是立体异构体(例如，非对映异构体)的混合物的情况中，可以用公知的方法将其进行分离，例如分级结晶和色谱法(例如，薄层色谱、柱色谱、快速色谱)。可以通过d-或l-(α-甲基苄基胺、辛可尼丁、辛可宁、奎宁、奎尼丁、脱氢松香胺、马钱子碱或士的宁)盐等的分级结晶来将外消旋的游离酸拆分成光学对映体。如果不是非对映异构体，则可以首先将外消旋产品用光学活性试剂转化成非对映异构体(如用光学活性的醇形成酯)，然后可以如上所述对其进行分离，并例如水解成各对映异构体。还可以通过手性色谱，例如使用手性吸附剂的高压液相色谱将外消旋产品进行拆分；还可以通过酶拆分来进行，例如用碱酶(alkalase)进行酯的拆分。
上述反应可以根据标准方法，在存在或不存在稀释剂，优选对反应物为惰性并且是该反应物的溶剂的稀释剂的情况下，在存在或不存在催化剂、碱性或酸性缩合剂或所述的其它物质的情况下和/或在惰性气氛下进行，该反应可以在低温、室温或升高的温度下进行，优选在接近于所用溶剂沸点的温度下进行，可以在大气压力或高于大气压的压力下进行。
本发明进一步包括所述方法的任何改变形式，其中，在该方法的任何步骤所获得的中间体产品均可以被用作原料并进行任何剩余步骤，或者可以在其任何阶段终止该方法，或者其中所述的原料可以在反应条件下形成，或者其中的反应组分可以以其盐或光学纯对映体的形式被使用。在所述反应中优选使用那些能够形成以上指定为优选化合物的原料。
本发明还涉及本发明化合物及其可药用的盐、无毒的酸加成盐或其药物组合物作为药物用于在哺乳动物中抑制ACE和NEP的应用，例如，用于预防或治疗心血管病症如高血压、水肿、盐潴留和充血性心衰，其可以单独使用或者可以与一种或多种可用于治疗该类病症的其它物质联用。所述的物质可以是抗高血压药、抗动脉粥样硬化药、心脏药、利尿药、抗糖尿病药、降胆固醇药等。当与其它治疗剂联用时，该类物质可以被单独给药或以固定的组合来进行给药。
可联用的治疗剂的实例有血管紧张素II受体拮抗剂，如缬沙坦、氯沙坦、坎地沙坦(candesartan)、依普沙坦(eprosartan)、伊贝沙坦(irbesartan)和替米沙坦；β-阻滞剂，如比索洛尔、普萘洛尔、阿替洛尔、索他洛尔和美托洛尔；肾素抑制剂；钙通道阻滞剂，如氨氯地平、维拉帕米、地尔硫、苄普地尔、非洛地平、伊拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼莫地平和尼索地平；醛固酮合酶抑制剂/醛固酮拮抗剂，如依普利酮、(+)-法倔唑(WO 01/76574)、螺内酯和坎利酮；利尿药，如呋塞米、氢氯噻嗪、吲达帕胺、metazolone、阿米洛利和氨苯蝶啶；加压素受体拮抗剂，如OPC21268、SR49059、SR121463A、SR49059、VPA985、OPC31260和YM087；强心剂，如依诺昔酮和左西孟旦；内皮缩血管肽拮抗剂和ECE抑制剂，如波生坦、BMS193884、TBC3711和在WO 99/55726中所公开的化合物；抗动脉粥样硬化药，特别是降胆固醇药，如胆酸螯合剂(例如，考来烯胺和考来替泊)；胆固醇吸收抑制剂，如ezetimibe；氯贝特类，如非诺贝特和吉非贝齐；抑制素HMG CoA还原酶抑制剂，如阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀和匹伐他汀；和烟酸衍生物；拟甲状腺素药，如US 5,569,674和WO 00/58279中所公开的物质；以及抗糖尿病药，如瑞格列奈、那格列奈(nateglinide)、甲福明、罗格列酮(rosiglitazone)、吡格列酮、格列本脲、格列吡嗪、格列美脲、DPP728、LAF237、NH622和DRF4158。
本发明还涉及本发明的化合物用于制备药物组合物的应用，尤其是具有ACE和NEP抑制活性的药物组合物和例如是具有抗高血压活性的药物组合物。
本发明的药物组合物是那些适于对哺乳动物、包括人进行肠内如口服或直肠给药、经皮和胃肠外给药、用于治疗心血管病症如高血压的组合物，其包含有效量的本发明的药理活性化合物或其可药用盐本身或还含有一种或多种可药用的载体，以及也可用于治疗心血管病症的如上所述的其它治疗剂。
本发明药理学活性的化合物可用于制备包含有效量的该化合物和赋形剂或载体的用于肠内或胃肠外应用的药物组合物。优选的是包含活性成分以及如下物质的片剂和明胶胶囊a)稀释剂，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如，硅石、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙和/或聚乙二醇；对于片剂而言还可以包含c)粘合剂，例如，硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要的话，还可含有d)崩解剂，例如，淀粉、琼脂、藻酸或藻酸钠或泡腾混合物；和，如果需要的话，吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。可注射的组合物优选是等渗的水性溶液或混悬液，栓剂有利地是用脂肪乳液或混悬液制得的。所述的组合物可以是无菌的和/或包含助剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，该组合物还可以包含其它有治疗价值的物质。所述组合物可以分别根据常规的混合、制粒或包衣方法来进行制备，并包含约0.1-75％、优选约1-50％的活性成分。
用于经皮应用的适宜制剂包含有效量的本发明化合物和载体。适宜的载体包括可吸收的生理可接受的溶剂以助于透过主体的皮肤。典型的经皮装置为包含衬垫部分、含有该化合物的储库，其中任选地含有载体、任选的用于以受控和预定的速率在延长的时期内向主体的皮肤上传递该化合物的速率控制屏障和确保该装置保留在皮肤上的工具的绷带形式。
用于约50-70kg的哺乳动物的单位剂量可以包含约10至200mg的活性成分。活性化合物的剂量取决于温血动物(哺乳动物)的种类、体重、年龄和个体情况以及给药形式。
用下面的实施例来对本发明进行说明，这些实施例并不对本发明构成限制。所给出的温度以摄氏度为单位。如果没有说明，所有的蒸发都是在减压条件下进行的，优选在约15至100mmHg下进行。旋光度(以“度”表示)是在室温下在589nm(钠的D线)或实施例所指定的其它波长下测量的。化合物的结构是用标准的分析方法如质谱、元素分析、NMR、IR光谱等确定的。
用前缀R和S表示各不对称中心的绝对构型。
实施例1(a) N-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯 将N-[2-[-[(R)-3-溴-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基-O-苄基-L-丝氨酸乙酯(4.96g，10.5mmol)溶解于四氢呋喃(100mL)中并向其中加入硫代乙酸钾(6.00g，52.5mmol)。将该混合物在室温下搅拌4小时，然后用乙酸乙酯(500mL)进行稀释，用水(100mL)、碳酸氢钠溶液(2×100mL)、水(2×100mL)洗涤，然后用盐水(50mL)洗涤。将该溶液用硫酸钠干燥并在真空下进行浓缩。将粗品材料通过快速色谱(硅胶，3∶2己烷/乙酸乙酯)进行纯化，得到标题化合物；m.p.55-57℃；[α]20D-63.5°(c＝0.99，CH3OH)；MS(M+H)467。
原料的制备如下将O-苄基-L-丝氨酸(9.75g，50mmol)在乙醇(200mL)中的溶液用HCl气体饱和8分钟。将该混合物在室温下搅拌过夜，然后在真空下进行浓缩。将固体用二乙醚洗涤并通过过滤进行收集，得到白色固体状O-苄基-L-丝氨酸乙酯盐酸盐。
向BOC-α-甲基丙氨酸(3.05g，15mmol)、O-苄基-L-丝氨酸乙酯盐酸盐(3.89g，15mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI，2.88g，15mmol)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAT，2.04g，15mmol)在二氯甲烷(150mL)中的溶液中加入三乙胺(1.52g，15mmol)。将该混合物搅拌过夜，然后在真空下进行浓缩。将残余物重新溶解于乙酸乙酯中并用水、1N HCl、水和盐水洗涤。将该溶液用硫酸钠干燥并进行浓缩，得到如下式所示的N-[2-(BOC-氨基)-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯 将上述氨基甲酸酯(6.12g，15mmol)溶解于二氯甲烷(200mL)中并将其在冰浴上进行冷却。将该溶液用HCl气体饱和10分钟，然后将其在室温下搅拌过夜。将残余物进行浓缩。向其中加入二氯甲烷并将残余物再次进行浓缩，得到泡沫状的N-(2-氨基-2-甲基丙酰基)-O-苄基-L-丝氨酸乙酯盐酸盐；MS(M+H)309。
向上述胺盐酸盐(4.90g，14mmol)在二氯甲烷(150mL)中的溶液中加入(R)-2-溴-3-甲基丁酸二异丙基胺盐(4.03g，14mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI，2.70g，14mmol)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAT，1.90g，14mmol)。将该混合物在室温下搅拌过夜，然后在真空下进行浓缩。将残余物溶解于乙酸乙酯中并用水、稀碳酸氢钠溶液、水、1N HCl洗涤，然后用盐水洗涤。将该溶液用硫酸钠干燥并进行浓缩得到固体。通过快速色谱(硅胶，2∶1己烷/乙酸乙酯)对该固体进行纯化，得到如下式所示的N-[2-(R)-2-溴-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯
按照类似方法制备如下化合物(b)N-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3，3-二甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯 (c)N-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-苏氨酸乙酯；m.p.121-122℃。
(d)N-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲氧基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯；[α]D20+14.9°(c＝1.04，DMSO)
(e)N-[2-[(S)]-2-乙酰硫基-3-甲基戊酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯；[α]D20-6.93°(c＝1.09，CH3OH) (f)N-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-(3-三氟甲基苄基)-L-丝氨酸乙酯 原料O-(3-三氟甲基苄基)-L-丝氨酸乙酯盐酸盐的制备如下在0℃下向氢化钠(60％的油分散液，3.04g，76mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(60mL)中的混悬液中加入BOC-L-丝氨酸(7.80g，38mmol)。将该混合物搅拌1小时，然后向其中加入间-三氟甲基苄基氯(7.39g，38mmol)。将该混合物升温至室温，然后将其搅拌过夜。将该混合物用水终止反应。向其中加入乙酸乙酯并将该混合物用盐水洗涤，用MgSO4干燥并将其进行浓缩，得到一种黄色油状物，将其通过快速色谱法(SiO2；己烷/乙酸乙酯)进行纯化，得到一种澄清的油。将残余物溶解于乙醇(120mL)中，将该溶液冷却至0℃并将其用HCl气体饱和5分钟。使该混合物升温至室温，然后将其搅拌过夜。将该混合物进行浓缩，得到O-(4-三氟甲基苄基)-L-丝氨酸乙酯盐酸盐。
(g)油状物形式的N-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-(4-氟苄基)-L-丝氨酸乙酯。
(h)油状物形式的N-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-(4-氟苯基)-L-高丝氨酸乙酯。
原料O-(4-氟苯基)-L-高丝氨酸乙酯盐酸盐的制备如下向BOC-L-高丝氨酸叔丁酯(3.2g，11.6mmol)在四氢呋喃中的溶液中加入三苯基膦(7.59g，29mmol)、对-氟苯酚(2.08g，18.6mmol)和1，1’-偶氮二(N，N-二甲基甲酰胺)(3.2g，18.6mmol)。将该混合物搅拌过夜，用洗涤，用MgSO4干燥，然后除去溶剂得到橙色的油。将该油通过快速色谱法(SiO2，85％己烷/15％乙酸乙酯)进行纯化，得到澄清的油，将其溶解于乙醇(100mL)中并将该溶液用HCl气体饱和，然后将其搅拌过夜。将该混合物进行浓缩，得到白色固体状O-(4-氟苯基)-L-高丝氨酸乙酯盐酸盐。
(i)N-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基-丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-(3-氟苯基)-L-高丝氨酸乙酯 (j)白色固体状N-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸4-吗啉基羰基甲酯，通过硅胶色谱进行纯化，用己烷、乙酸乙酯、甲醇(20∶70∶10)进行洗脱。
原料的制备如下将O-苄基-L-丝氨酸(10.0g，51.3mmol)、二碳酸二叔丁酯(11.2g，51.4mmol)和1N氢氧化钠(103mL，103mmol)一起在100mL二噁烷中在室温下搅拌16小时。将该混合物在真空下进行浓缩，用水进行吸收，用6NHCl将其酸化至pH为1，然后用乙酸乙酯进行萃取。将有机层用水洗涤，然后用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥。将该混合物进行过滤并在真空下进行浓缩，得到油状的BOC-O-苄基-L-丝氨酸。向BOC-O-苄基-L-丝氨酸(2.20g，7.46mmol)、三乙胺(0.75g，7.43mmol)和碘化钠(0.11g，0.73mmol)在5mL N，N-二甲基甲酰胺中的溶液中加入4-(2-氯乙酰基)吗啉(1.22g，7.48mmol)并将该混合物在室温下搅拌2小时。将该混合物用乙酸乙酯稀释，用水洗涤，然后用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥。将该混合物过滤并在真空下进行浓缩得到黄色的油。将该油状物通过硅胶色谱进行纯化，用己烷∶乙酸乙酯∶甲醇(35∶60∶5)进行洗脱，得到无色油状的BOC-O-苄基-L-丝氨酸4-吗啉基羰基甲酯。向氨基甲酸酯(1.72g，4.08mmol)在二氯甲烷(50mL)中溶液中鼓入HCl气泡5分钟，然后将该混合物在室温下搅拌3小时。将所得混合物在真空下进行浓缩，得到泡沫状的O-苄基-L-丝氨酸4-吗啉基羰基甲酯。
(k)N-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸二甲基氨基羰基甲酯，其制备和纯化如实施例1(j)的化合物所述 (l)N-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸二乙基氨基羰基甲酯，其制备如实施例1(j)的化合物所述并通过硅胶色谱纯化，用己烷、乙酸乙酯、甲醇(35∶60∶5)进行洗脱。
(m)N-[2-[(S)-2-[(甲氧基乙酰基)硫基]-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯；[α]D-55.27°；(c＝1.084，CH3OH) (n)N-[2-[(S)-2-[(4-吗啉基乙酰基)硫基]-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯；[α]D-48.61°(c＝1.098，CH3OH) (o)N-[2-[(S)-2-乙酰硫基-2-(4-四氢吡喃基)乙酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯；[α]D20-55.4°(c＝0.83，DMSO)
原料(D)-α-溴-α-(4-四氢吡喃基)-乙酸可以用如下所述的方法进行制备将亚硝酸钠(4.71g，68.3mmol)在35mL水中的溶液滴加到(D)-α-溴-α-(4-四氢吡喃基)-甘氨酸(J.Am.Chem.Soc.，第117卷，9375-9376页(1995))(7.05g，44.3mmol)和48％HBr(水溶液)(70mL)在35mL水中的冷(0℃)溶液中。一旦完全加入，将该混合物升温至室温并将其在室温下搅拌3小时。将该混合物用乙酸乙酯进行萃取，将有机层相继用水、5％硫代硫酸钠水溶液和盐水进行洗涤，然后将其用无水硫酸镁干燥。将该混合物过滤并在真空下进行浓缩，得到固体状(D)-α-溴-α-(4-四氢吡喃基)-乙酸。
(p)N-[2-[(S)-2-[(1-(1，2，4)-三唑基)乙酰硫基]-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯；m.p.106-107℃；[α]D-61.46°(c＝1.09，CH3OH) (q)N-[2-[(S)-2-[(4-甲基哌嗪-1-基)乙酰硫基]-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯；m.p.95-96℃；[α]D-48.5°(c＝0.935，CH3OH)
(r)N-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-2-乙基丁酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯；[α]D-83.6°(c＝1.07，CH3OH)。
(s)N-[2-[(S)-2-(4-吗啉基乙酰硫基)-3，3-二甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯；[α]D-55.5°(c＝1.008，DMSO) (t)N-[2-[(S)-2-[(甲氧基乙酰基)硫基]-3，3-二甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯；[α]D-61.67°(c＝1.024，DMSO)
(u)N-[2-[(S)-2-(乙酰硫基)戊酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯 (v)N-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-(4-联苯基甲基)-L-丝氨酸乙酯 实施例2N-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-S-苄基-L-半胱氨酸乙酯
标题化合物按照与实施例1相似的方法进行制备，并用甲基叔丁基醚/己烷进行重结晶，m.p.69-71℃。
原料的制备如下将HCl(g)向BOC-S-苄基-L-半胱氨酸(9.33g，30mmol)在乙醇(200mL)中的溶液中鼓泡15分钟。将该容器用塞子塞上并将其在室温下搅拌过夜。真空蒸除溶剂，将残余物在乙醚(150mL)中搅拌1.5小时，得到固体状S-苄基-L-半胱氨酸乙酯盐酸盐。
将S-苄基-L-半胱氨酸乙酯盐酸盐(7.98g，29mmol)、BOC-α-甲基丙氨酸(5.89g，29mmol)、三乙胺(2.93g，29mmol)、1-羟基苯并三唑(HOBT，3.92g，29mmol)和EDCI(5.57g，29mmol)在二氯甲烷(200mL)中的混合物在氩气氛下室温搅拌过夜。将该反应混合物蒸发至干，然后将残余物溶解于乙酸乙酯(200mL)中。将该溶液用水(50mL)、1N HCl(50mL)、水(50mL)、5％碳酸氢钠(50mL)、水(50mL)洗涤，最后用盐水(25mL)洗涤。然后将该溶液用硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干，得到N-[2-(BOC-氨基)-2-甲基丙酰基]-S-苄基-L-半胱氨酸乙酯。
实施例3N-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-(S)-2-氨基-3-(苄基磺酰基)-丙酸乙酯 上述化合物按照与实施例1相似的制备方法进行制备。
原料的制备如下
在氮气氛下向N-[2-(BOC-氨基)-2-甲基丙酰基]-S-苄基-L-半胱氨酸乙酯(7.21g，17mmol)在二氯甲烷(250mL)中的溶液中加入间-氯-过苯甲酸(8.77g，51mmol)并将该混合物在室温下搅拌过夜。将该混合物蒸发至干，然后将残余物溶解于乙酸乙酯(300mL)中。将该溶液用5％碳酸氢钠(3×50mL)、水(50mL)和盐水(25mL)洗涤。将该溶液用硫酸钠干燥，过滤并在真空下进行蒸发，得到N-[2-(BOC-氨基)-2-甲基丙酰基]-(S)-2-氨基-3-(苄基磺酰基)-丙酸乙酯。
实施例4(a)N2-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-(S)-2-氨基-3-(苯甲酰基氨基)-丙酸甲酯 将苯甲酰氯(0.085mL，0.73mmol)、N2-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-(S)-2，3-二氨基丙酸甲酯盐酸盐(0.29g，0.73mmol)和三乙胺(0.15mL，1.49mmol)在二氯甲烷(10mL)中的混合物在室温下搅拌16小时。将该反应混合物在室温下蒸发至干，将残余物溶解于乙酸乙酯中，然后将该溶液用水洗涤，然后用饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，用无水硫酸镁进行干燥，然后将其蒸发至干得到油状物。将该油状物进行硅胶色谱，用己烷、乙酸乙酯(50∶50)洗脱得到白色泡沫状标题化合物；m.p.48-54℃。
(b)按照类似方法制备N2-[2[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-(S)-2-氨基-3-(苯磺酰氨基)丙酸甲酯；m.p.47-51℃；[α]D20-41.72(c＝1.03，CH3OH)。
原料的制备如下将(S)-2-氨基-3-(BOC-氨基)-丙酸甲酯盐酸盐(4.6g，2.1mmol)、N-CBZ-α-甲基丙氨酸(5.0g，2.1mmol)、HOAT(2.87g，2.1mmol)、EDCI(4.02g，2.1mmol)和三乙胺(2.93g，2.1mmol)在二氯甲烷(50mL)中的混合物在室温下搅拌16小时。将该反应混合物用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥并在真空下进行浓缩。将所得的油状物进行硅胶色谱，用己烷和乙酸乙酯(1∶1)进行洗脱得到白色泡沫状的N2-[2-(CBZ-氨基)-2-甲基丙酰基]-(S)-2-氨基-3-(BOC-氨基)-丙酸甲酯；m.p.100-101℃。
将上述产物(2.14g，4.90mmol)和10％钯碳(0.27g)在乙醇(50mL)中的混合物在45pai的压力下在Parr瓶中氢化4小时。将该混合物通过硅藻土垫进行过滤并在真空下进行浓缩，得到油状的N2-[2-氨基-2-甲基丙酰基]-(S)-2-氨基-3-(BOC-氨基)-丙酸甲酯盐酸盐。
将上述产物(2.28g，8.09mmol)、(R)-2-溴-3-甲基丁酸二异丙基胺盐(2.16g，7.13mmol)、EDCI(1.43g，7.49mmol)和HOAT(1.15g，8.52mmol)在二氯甲烷(75mL)中的溶液在室温下搅拌16小时。将该反应混合物在真空下蒸发至干，然后将残余物用乙酸乙酯进行吸收。将该乙酸乙酯溶液用水、饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，然后用无水硫酸镁进行干燥，然后在真空下进行浓缩。将所得的油状物进行硅胶色谱，用己烷和乙酸乙酯(40∶60)进行洗脱，得到白色泡沫状的N2-[2-[(R)-2-溴-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-(S)-2-氨基-3-(BOC-氨基)-丙酸甲酯。
将上述产物(1.31g，2.82mmol)和硫代乙酸钾(1.28g，11.2mmol)在四氢呋喃(50mL)中的混合物在室温下搅拌4小时，然后用乙酸乙酯进行稀释。将该混合物用水、饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤，然后用硫酸镁进行干燥。将该反应混合物在真空下浓缩至干，然后将所得的油进行硅胶色谱，用己烷和乙酸乙酯(40∶60)进行洗脱，得到N-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-(S)-2-氨基-3-(BOC-氨基)-丙酸甲酯。
将氯化氢气体向上述化合物(1.01g，2.19mmol)在50mL二氯甲烷中的溶液中鼓泡约5分钟，将该混合物在室温下搅拌3小时，然后在真空下进行浓缩，得到N2-[2-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-(S)-2，3-二氨基丙酸甲酯盐酸盐。
实施例5向1-[(R)-2-溴-3-甲基丁酰基氨基]环戊烷甲酸(1g，3.42mmol)、O-苄基-L-丝氨酸乙酯盐酸盐(0.89g，3.42mmol)、二环己基碳二亚胺(0.7g，3.42mmol)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(0.47g，3.42mmol)的二氯甲烷溶液中加入三乙胺(0.48mL，3.42mmol)。将该混合物搅拌24小时，然后将其用盐水洗涤并在真空下进行浓缩，得到一种浅黄色的油状物。将残余物通过快速色谱(硅胶，己烷/乙酸乙酯)进行纯化，得到如下式所示的N-[1-(R)-2-溴-3-甲基丁酰基氨基]-环戊烷羰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯 将溴代化合物(0.7g，1.41mmol)溶解于四氢呋喃(50mL)中并向其中加入硫代乙酸钾(0.19g，1.69mmol)。将该混合物在室温下搅拌18小时，然后将其用乙酸乙酯进行稀释并用盐水洗涤，用硫酸镁干燥并在真空下进行浓缩，得到黄色油状物。将粗品材料通过快速色谱进行纯化(硅胶，己烷/乙酸乙酯)得到一种半固体，将其用己烷进行研制，得到如下式所示的N-[1-[(S)-2-乙酰硫基-3-甲基丁酰基氨基]-环戊烷羰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯
1-[(R)-2-溴-3-甲基丁酰基氨基]环戊烷甲酸原料基本按照WO99/55726中所描述的方法通过将(R)-2-溴-3-甲基丁酸二异丙基胺盐(由L-缬氨酸制得)和环亮氨酸甲酯盐酸盐缩合来进行制备的。
实施例6(a)N-[2-[(S)-2-巯基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸 向实施例1的S-乙酰基乙酯(0.47g，1mmol)在甲醇(10mL)中的溶液中加入1N氢氧化钠(5.0mL，5mmol)。将该混合物在室温下搅拌4小时，用1NHCl将其酸化为pH为1，然后在真空下进行浓缩。向残余物中加入乙酸乙酯。将该混合物用1N NaOH洗涤。然后将合并的水相酸化并用乙酸乙酯进行萃取。将有机相用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，然后在真空下进行浓缩。用己烷进行研制得到白色泡沫；m.p.57-70℃；[α]D20-16.8°(c＝1.032，DMSO)；MS(M+H)397。
按照类似方法制备如下化合物(b)N-[1-[(S)-2-巯基-3-甲基丁酰基氨基]-环戊烷羰基]-O-苄基-L-丝氨酸；m.p.132-136℃(用己烷/叔丁基甲基醚进行结晶)
(c)N-[2-[(S)-2-巯基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-S-苄基-L-半胱氨酸；m.p.81-87℃；[α]D20-37.87(c＝0.545，DMSO) (d)N-[2-[(S)-2-巯基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-苏氨酸；m.p.61-64℃ (e)N-[2-[(S)-2-巯基-3，3-二甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸；m.p.128-130℃；[α]D-2.46(c＝1.06，DMSO)
(f)N-[2-[(S)-2-巯基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-(4-氟苄基)-L-丝氨酸；m.p.50-54℃ (g)N-[2-[(S)-2-巯基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-(4-氟苯基)-L-高丝氨酸；m.p.127-128℃ (h)N-[2-[(S)-2-巯基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-(3-氟苯基)-L-高丝氨酸；m.p.50-56℃
(i)N-[2-[(S)-2-巯基-3-甲氧基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸；[α]D20+18.85(c＝0.997，DMSO) (j)N-[2-[(S)-2-巯基-2-(4-四氢吡喃基)乙酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸；m.p.184-189℃；[α]D20-24.94(c＝1.013，DMSO) 实施例7(a)N-[2-[(S)-2-巯基-3-甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-S-苄基-L-半胱氨酸乙酯
在氩气氛下，将实施例2的乙酰硫基化合物(0.48g，1.0mmol)溶解于无水EtOH(5mL)中并将其用1N NaOH(1.0mL，1.0mmol)进行处理。将该混合物在室温下搅拌4小时，然后将其用1N HCl处理至pH为3。将该混合物进行蒸发以除去大部分EtOH，然后将该含水残余物用EtOAc(2×10mL)进行萃取。将合并的萃取液用H2O(5mL)洗涤，然后用盐水(5mL)洗涤。将溶液用Na2SO4进行干燥，过滤并在真空下进行浓缩。将产物在叔丁基甲基醚/己烷中进行固化，得到产物；m.p.87-91℃。
(b)类似地制备N-[2-[(S)-2-巯基-2-(4-四氢吡喃基)乙酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯；m.p.85-93℃；[α]D-37.21°(c＝1.012，DMSO) (c)类似地制备N-[2-[(S)-2-巯基-3，3-二甲基丁酰基氨基]-2-甲基丙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯；油；[α]D-20.9°(c＝1.025，DMSO)
(d)类似地制备N-[2-[(S)-2-巯基-3-甲基丁酰基氨基]-2-乙基丁酰基]-O-苄基-L-丝氨酸乙酯；[α]D-31.48°(c＝0.955，CH3OH)
权利要求
1.式(I)的化合物 其中R表示氢、低级烷基、碳环或杂环芳基-低级烷基或环烷基-低级烷基；R1表示低级烷基、环烷基、碳环或杂环芳基、或联芳基；或R1表示(环烷基、碳环芳基、杂环芳基或联芳基)-低级烷基；alk表示低级亚烷基；R3表示氢或酰基；R4表示氢、取代或未取代的低级烷基、碳环或杂环芳基、(碳环或杂环芳基)-低级烷基、环烷基、环烷基-低级烷基、联芳基、联芳基-低级烷基；氧杂环烷基、硫杂环烷基、氮杂环烷基、或(氧杂环烷基、硫杂环烷基或氮杂环烷基)-低级烷基；R5表示氢或低级烷基；或R4和R5和与之相连的碳原子一起表示亚环烷基、苯并-稠合的亚环烷基；或5-或6-元(氧杂亚环烷基、硫杂亚环烷基或氮杂亚环烷基)，各基团都可以是未取代的或被低级烷基或芳基-低级烷基所取代；R6表示低级烷基、碳环或杂环芳基、(碳环或杂环芳基)-低级烷基、环烷基、环烷基-低级烷基、联芳基或联芳基-低级烷基；R7表示低级烷基、(碳环或杂环芳基)-低级烷基、环烷基-低级烷基或联芳基-低级烷基；或R6和R7和与之相连的碳原子一起表示3-至10-元亚环烷基，其可以被低级烷基或芳基-低级烷基所取代或者可以与一个饱和或不饱和的5-至7-元碳环稠合；或表示5-或6-元(氧杂亚环烷基、硫杂亚环烷基或氮杂亚环烷基)，其均可以是未取代的或被低级烷基或芳基-低级烷基所取代；或2，2-亚降冰片基；X表示-O-、-S(O)n-、-NHSO2-或-NHCO-；n是0、1或2；且COOR2表示羧基或以可药用酯的形式衍生化的羧基；或由其中R3是氢的所述化合物衍生的二硫化物衍生物；或其可药用的盐。
2.式(Ia)的如权利要求1所述的化合物 或由其中R3是氢的所述化合物衍生的二硫化物衍生物；或其可药用的盐。
3.如权利要求1所述的化合物，其中R和R5表示氢；R1表示低级烷基、C5-或C6-环烷基、碳环或杂环芳基、或(碳环或杂环芳基)-低级烷基；alk表示低级亚烷基；X表示-O-或-S(O)n，其中n表示0或2；R3表示氢或酰基；R4表示氢、取代或未取代的低级烷基、氧杂环烷基、氧杂环烷基-低级烷基或(碳环或杂环芳基)-低级烷基；R5表示氢；或R4和R5和与之相连的碳原子合在一起表示C5或C6-亚环烷基；R6和R7表示低级烷基；或R6和R7和与之相连的碳原子合在一起表示5-或6-元亚环烷基；COOR2表示羧基或以可药用酯的形式衍生化的羧基；或由其中R3是氢的所述化合物衍生的二硫化物衍生物；或其可药用的盐。
4.如权利要求2所述的化合物，其中R和R5表示氢；R1表示低级烷基、C5-或C6-环烷基、碳环或杂环芳基、或(碳环或杂环芳基)-低级烷基；alk表示低级亚烷基；X表示-O-或-S(O)n，其中n表示0或2；R3表示氢或酰基；R4表示氢、取代或未取代的低级烷基、氧杂环烷基、氧杂环烷基-低级烷基或(碳环或杂环芳基)-低级烷基；R5表示氢；或R4和R5和与之相连的碳原子合在一起表示C5或C6-亚环烷基；R6和R7表示低级烷基；或R6和R7和与之相连的碳原子合在一起表示5-或6-元亚环烷基；COOR2表示羧基或以可药用酯的形式衍生化的羧基；由其中R3是氢的所述化合物衍生的二硫化物衍生物；或其可药用的盐。
5.如权利要求1所述的化合物，其中R和R5表示氢；R1表示碳环或杂环芳基或(碳环或杂环芳基)-低级烷基；R3表示氢或取代或未取代的低级烷酰基；R4表示低级烷基、环烷基、四氢吡喃基或C1-C4-低级烷氧基-低级烷基；R6和R7都表示C1-C4-烷基并且是相同的；X表示-O-或-S-；alk表示亚甲基；COOR2表示羧基、低级烷氧基-羰基、(二-低级烷基氨基羰基)-低级烷氧基羰基或(4-吗啉基羰基、1-哌啶基羰基或1-吡咯烷基羰基)-低级烷氧基羰基；或其可药用的盐。
6.如权利要求2所述的化合物，其中R和R5表示氢；R1表示碳环或杂环芳基或(碳环或杂环芳基)-低级烷基；R3表示氢或取代或未取代的低级烷酰基；R4表示低级烷基、环烷基、四氢吡喃基或C1-C4-低级烷氧基-低级烷基；R6和R7都表示C1-C4-烷基并且是相同的；X表示-O-或-S-；alk表示亚甲基；COOR2表示羧基、低级烷氧基-羰基、(二-低级烷基氨基羰基)-低级烷氧基羰基或(4-吗啉基羰基、1-哌啶基羰基或1-吡咯烷基羰基)-低级烷氧基羰基；或其可药用的盐。
7.如权利要求1所述的化合物，其中R和R5表示氢；R1表示碳环芳基或碳环芳基-低级烷基，其中所述的碳环芳基表示苯基或被一个或两个羟基、低级烷酰氧基、低级烷基、低级烷氧基、三氟甲基、三氟甲氧基或卤素所取代的苯基；R3表示氢或低级烷酰基；R4表示低级烷基、4-四氢吡喃基或C1-C4-低级烷氧基-C1-C4-低级烷基；R6和R7表示甲基；X表示-O-；alk表示亚甲基或亚乙基；并且COOR2表示羧基或低级烷氧基羰基；或其可药用的盐。
8.如权利要求2所述的化合物，其中R和R5表示氢；R1表示碳环芳基或碳环芳基-低级烷基，其中所述的碳环芳基表示苯基或被一个或两个羟基、低级烷酰氧基、低级烷基、低级烷氧基、三氟甲基、三氟甲氧基或卤素所取代的苯基；R3表示氢或低级烷酰基；R4表示低级烷基、4-四氢吡喃基或C1-C4-低级烷氧基-C1-C4-低级烷基；R6和R7表示甲基；X表示-O-；alk表示亚甲基或亚乙基；并且COOR2表示羧基或低级烷氧基羰基；或其可药用的盐。
9.如权利要求1所述的化合物，其中R和R5表示氢；R1表示苯基、氟苯基、苄基或氟苄基；R3表示氢、低级烷酰基或被低级烷氧基取代的低级烷酰基；R4表示异丙基、叔丁基、1-甲氧基乙基或4-四氢吡喃基；R6和R7表示甲基；X表示-O-；alk表示亚甲基；并且COOR2表示羧基或低级烷氧基羰基；或其可药用的盐。
10.如权利要求2所述的化合物，其中R和R5表示氢；R1表示苯基、氟苯基、苄基或氟苄基；R3表示氢、低级烷酰基或被低级烷氧基取代的低级烷酰基；R4表示异丙基、叔丁基、1-甲氧基乙基或4-四氢吡喃基；R6和R7表示甲基；X表示-O-；alk表示亚甲基；并且COOR2表示羧基或低级烷氧基羰基；或其可药用的盐。
11.如权利要求10所述的化合物，其中R和R5表示氢；R1表示苄基；R3表示氢、乙酰基或甲氧基乙酰基；R4表示异丙基或叔丁基；R6和R7表示甲基；X表示-O-；alk表示亚甲基；并且COOR2表示羧基或乙氧基羰基；或其可药用的盐。
12.一种抑制哺乳动物血管紧张素转化酶和中性肽链内切酶的方法，其包括给需要进行该类抑制的哺乳动物施用有效量的如权利要求1所述的化合物。
13.一种预防或治疗哺乳动物心血管病症的方法，其包括给需要进行该类预防或治疗的哺乳动物施用有效量的如权利要求1所述的化合物。
14.如权利要求12所述的方法，其是用于治疗高血压、水肿、盐潴留或充血性心衰。
15.一种包含有效量的如权利要求1所述的化合物以及一种或多种可药用载体的药物组合物。
全文摘要
本发明公开了式(I)化合物，其中R、R
文档编号A61P9/12GK1649893SQ02811849
公开日2005年8月3日 申请日期2002年5月14日 优先权日2001年5月15日
发明者C·A·芬克 申请人:诺瓦提斯公司