专利名称：微粒体氨基肽酶同工酶诊断试剂盒的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微粒体氨基肽酶同工酶诊断试剂盒的制备，属于酶学领域。
近年来，酶学在临床诊断与治疗中的应用发展非常迅速，现已分别发展为医学中的两个新领域，即诊断酶学和治疗酶学。目前已有上百种酶试验可用于临床诊断。临床酶学的这一发展，部分是由于测定技术的发展，使许多酶的测定已日益精确和简便，可用于常规测定。部分是由于认识到某些疾病发展过程中酶活力必然发生改变这一客观事实，特别是在疾病的早期，用X光片、CT还未能发现病灶时，而体内的酶活性已开始发生变化。如果能定期查体，可做到对疾病的早期发现。值得一提的是，目前临床上诊断酶学的应用多数是对酶的总活性的测定，并且市场上已有相应试剂盒销售，其缺点是缺乏器官特异性，但由于许多酶在组织的含量远高于血清，即使少量组织坏死所释放的酶也足以引起血清中酶活性的变化，因而仍具有较高的灵敏性。目前有关酶活性测定的试剂盒约有20～30种，同工酶检测试剂盒约有3～5种，但多数用的是免疫化学法和化学抑制法。而同工酶是指酶蛋白结构不同具有相似的催化特性的一类酶，不同的同工酶来自不同的脏器。当某一组织或器官发生病变时，由于组织受损或细胞膜通透性的变化，引起细胞内酶大量释入血液而引起血清酶活性的改变。通过同工酶的检测可确定患病部位，从而提高酶学诊断的特异性和敏感性，还可判断预后。目前由于自行配制酶显示液，所用试剂品种繁多，规格不一，致使酶显示结果不稳定，结果判定不统一等等，特别是大型生化分析仪的应用，使临床生化检测的操作更简便，省时、省力，但其是对总酶活性测定缺乏组织特异性。而同工酶的检测使病变的定性和定位就精确多了。
本发明的目的在于提供一种质量优良、性能稳定、重复性能好，同时大大简化了检测的操作过程且使用该试剂盒可使同工酶的检测操作规范化，从而使酶活性的检测及质量控制达到统一标准的微粒体氨基肽酶同工酶诊断试剂盒的制备及检测方法。
本发明的目的由如下技术方案实施做醋纤膜电泳，其包括有(1)、配制浓度为0.03～0.1mol/L电极液，PH为7.5-9.0；(2)、配制浓度为0.05～0.2mol/L泡醋纤膜缓冲液，分装安瓿A；(3)、将冰乙酸做为固定液，分装安瓿F；(4)、配制显色液
(a)、将底物装入安瓿B，(b)、将浓度为0.05～0.5mol/L的缓冲液分装安瓿C，pH为6.2～7.5，(c)、内装重氮盐染料分装安瓿D，(d)、将浓度为0.05～0.2mol/L缓冲液分装安瓿E，按重量百分比，其中安瓿B中的底物与安瓿D中的重氮盐染料，其比例分别为9.1％～80％，20.0％～90.9％，用时将安瓿B中的底物和安瓿C中的1～3ml缓冲液混合；将安瓿D中的重氮盐染料和安瓿E中的0.5～2ml缓冲液混合溶解。
做琼脂糖凝胶电泳，其包括有(1)、配制浓度为0.03～0.1mol/L电极液，PH为7.5-9.0；(2)、以冰乙酸做为固定液分装安瓿F；(3)、配制琼脂糖凝胶将0.5～1.2g琼脂糖或琼脂加入浓度为0.05～0.2mol/L泡醋纤膜缓冲液80～120ml，加热溶解，趁热分装安瓿A；琼脂糖凝胶的配制也可以是将琼脂糖或琼脂、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮，浓度为0.05～0.2mol/L泡醋纤膜缓冲液80～120ml，加热溶解，趁热分装安瓿A，其中琼脂糖或琼脂、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮按重量百分比其分别为7.0％～36.4％，52.6％～91.0％，1.4％～19.4％。(4)、配制显色液(a)、将底物装入安瓿B，(b)、将浓度为0.05～0.3mol/L的缓冲液分装安瓿C，pH为6.2～8.0，(c)、内装重氮盐染料分装安瓿D，(d)、将浓度为0.05～0.2mol/L缓冲液分装安瓿E，按重量百分比，其中安瓿B中的底物与安瓿D中的重氮盐染料，其比例分别为9.1％～80％，20.0％～90.9％，用时将安瓿B中的底物和安瓿C中的1～3ml缓冲液混合；将安瓿D中的重氮盐染料和安瓿E中的0.5～2ml缓冲液混合溶解。
显色液也可以制备为冻干试剂，冻干试剂制备方法如下安瓿G将底物、浓度为0.05～0.5mol/L的缓冲液1～3ml分装于安瓿内，经冰冻干燥后，封口，为安瓿G，用时加水溶解即可使用；安瓿H将重氮盐染料与浓度为0.05～0.2mol/L缓冲液0.5～2ml分装于安瓿内，经冰冻干燥后封口，为安瓿H，用时加水溶解即可使用；按重量百分比，其中安瓿G中的底物与安瓿H中的重氮盐染料，比例分别为9.1％～80％，20.0％～90.9％。
所述安瓿B或安瓿G中的底物可以用下列化合物显示微粒体氨基肽酶，底物可以用L-丙氨酰-β-萘胺盐酸盐、L-亮氨酰-β-萘胺盐酸盐、L-亮氨酰-3-羧基苯胺、L-亮氨酰甘氨酸、亮氨酰对硝基苯胺、丙氨酰对硝基苯胺、蛋氨酰-β-萘胺盐酸盐、苯丙氨酰-β-萘胺盐酸盐等多种化合物。显示亮氨酸氨基肽酶(LAP EC3.4.11.1)底物可用亮氨酰胺、L-亮氨酰-对-氨基-二丙磺胺苯胺；显示胱氨酸氨基肽酶(CAP EC 3.4.11.3)；底物可用胱氨酰-β-萘胺、L-半胱氨酸-双-P-硝基苯胺、S-苄基-L-半胱氨酸-P-硝基苯胺硝基苯胺等。
所述安瓿C或安瓿G中的缓冲液可用磷酸盐类缓冲液，也可用Tris系列缓冲液。
所述安瓿D或安瓿H中的重氮盐染料可以有多种，如固蓝B或固蓝BB、固蓝R或固蓝RR、固紫B、柘石榴红GBC、固红RC、固红TR、六偶氮付品红等。
所述安瓿E中的缓冲液可以是磷酸缓冲液，醋酸缓冲液或可用Tris缓冲液；微粒体氨基肽酶同工酶(mAP EC 3.4.11.2)是水解一些氨基酸与芳香酰胺所形成的酰胺类化合物的酶。广布于肝、肾、胰、脑等组织及胃液等，可用于肝脏疾病及胰腺癌的诊断与鉴别诊断。检查胃液的mAP有助于胃癌的诊断和鉴别诊断。
本发明的优点是将试剂分装于安瓿内，便于保存，性能稳定，重复性好，减轻了劳动强度，改变了传统的人工配制试剂的繁琐。并由此而引起的操作过程中个体间存在的差异，从而使操作规范化，使酶的检测及质量控制达到统一的标准，同时使用试剂盒简化了操作过程，省时、快速、便于推广。尤其是当做大量样品检测时试剂盒更方便适用，为临床疾病的诊断和鉴别诊断提供依据。
实施例实施例1、做酸纤膜电泳(1)、配制浓度为0.1mol/L巴比妥缓冲液做为电极液，PH为8.0；(2)、配制浓度为0.05mol/L二氨基二甲基1.3丙二醇缓冲液做为泡醋纤膜缓冲液，分装安瓿A(3)、将冰乙酸做为固定液，取2ml分装安瓿F；(4)、配制显色液(a)、将底物L-亮氨酰-β-萘胺盐酸盐1mg，装入安瓿B，(b)、将1ml浓度为0.05mol/L的磷酸缓冲液分装安瓿C，pH为6.2，(c)、内装重氮盐染料固蓝BB7mg分装安瓿D，(d)、将0.5ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液分装安瓿E，用时将安瓿B中的底物和安瓿C中的缓冲液混合；将安瓿D中的重氮盐染料和安瓿E中的缓冲液混合溶解。
应用首先泡膜打开安瓿A加水至25ml，将醋纤膜泡在该液内20分钟。然后将醋纤膜取出，夹在滤纸中间吸去多余水份，膜条无光泽面朝上。用点样片醮血清点在距膜一端2cm处。将配制好的电极缓冲液倒入电泳槽内，使槽内电极缓冲液处于同一水平。在电泳槽的阴、阳极槽内分别用合适尺寸的滤纸折叠4层搭在槽的两侧，做为盐桥。将点样的膜条点样面朝下，点样处朝向阴极端搭在盐桥上，膜条需与盐桥贴紧，绷展。接通电源，调节电压100～260v，10～30分钟后，关闭电源。然后进行同工酶显色将安瓿C内液体加入安瓿B，加热溶解，取一个玻璃板上面放一张滤纸，将泡在安瓿A液内的醋纤膜取出，用滤纸吸去多余液体，放在玻璃板上面的滤纸上，将溶解好的安瓿C与安瓿B的混和液倒在醋纤膜上，即为染色膜。将电泳后的膜条贴在染色膜上，在37℃温育40分钟，然后将安瓿E内液体与安瓿D内容物混合溶解，将该液均匀倒在在37℃温育后的醋纤膜上，在室温下放置5～10分钟，即可见同工酶谱。
结果微粒体氨基肽酶同工酶(mAP)正常人微粒体氨基肽酶同工酶只显示1条酶活性适中的区带。肝癌和胰头癌病人中多数在与正常人同一电泳位置酶活性区带加宽、加深，并在向阳极方向多一条细带。实施例2、做酸纤膜电泳(1)、配制浓度为0.07mol/Ltris-HCL缓冲液做为电极液，PH为8.6；(2)、配制浓度为0.1mol/Ltris缓冲液做为泡醋纤膜缓冲液，分装安瓿A；(3)、将冰乙酸2ml做为固定液，分装安瓿F；(4)、配制显色液(a)、将底物L-丙氨酰-β-萘胺盐酸盐8mg，装入安瓿B，(b)、将2ml浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液分装安瓿C，pH为7.0，(c)、内装重氮盐染料固蓝RR3mg分装安瓿D，(d)、将1ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液分装安瓿E，用时将安瓿B中的底物和安瓿C中的缓冲液混合；将安瓿D中的重氮盐染料和安瓿E中的缓冲液混合溶解。
应用如实施例1所述，结果也相同。实施例3、做酸纤膜电泳(1)、配制浓度为0.04mol/Ltris-甘氨酸缓冲液做为电极液，PH为8.6；(2)、配制浓度为0.15mol/Ltris缓冲液做为泡醋纤膜缓冲液，分装安瓿A；(3)、将冰乙酸做为固定液，取2ml分装安瓿F；(4)、配制显色液显色液可以制备为冻干试剂，制备如下安瓿G将底物L-亮氨酰-β-萘胺盐酸盐5mg，加缓冲液1.5ml浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液，分装于安瓿内，经冰冻干燥后，封口，为安瓿G，用时加水溶解即可使用；安瓿H将重氮盐染料固蓝RR3mg与1ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液分装于安瓿，冰冻干燥后封口，为安瓿H，用时加水溶解即可使用。
应用首先泡膜打开安瓿A加水至25ml，将醋纤膜泡在该液内20分钟。然后将醋纤膜取出，夹在滤纸中间吸去多余水份，膜条无光泽面朝上。用点样片醮血清点在距膜一端2cm处。将配制好的电极缓冲液倒入电泳槽内，使槽内电极缓冲液处于同一水平。在电泳槽的阴、阳极槽内分别用合适尺寸的滤纸折叠4层搭在槽的两侧，做为盐桥。将点样的膜条点样面朝下，点样处朝向阴极端搭在盐桥上，膜条需与盐桥贴紧，绷展。接通电源，调节电压100～260v，10～30分钟后，关闭电源。然后进行同工酶显色打开安瓿G加1.5ml蒸馏水溶解，取一个玻璃板上面放一张滤纸，将泡在安瓿A液内的醋纤膜取出，用滤纸吸去多余液体，放在玻璃板上面的滤纸上，将溶解好的安瓿G内的液体倒在醋纤膜上，即为染色膜。将电泳后的膜条贴在染色膜上，在37℃温育40分钟，然后将安瓿H内加入1ml蒸馏水溶解，将该液均匀倒在在37℃温育后的醋纤膜上，在室温下放置5～10分钟，即可见同工酶谱。
结果微粒体氨基肽酶同工酶(mAP)正常人微粒体氨基肽酶同工酶只显示1条酶活性适中的区带。肝癌和胰头癌病人中多数在与正常人同一电泳位置酶活性区带加宽、加深，并在向阳极方向多一条细带。
实施例4、做琼脂糖凝胶电泳试剂的制备，其包括有(1)、配制浓度为0.07mol/L电极液，PH为8.4；(2)、以冰乙酸做为固定液，取2ml分装安瓿F；(3)、配制琼脂糖凝胶将琼脂糖0.6g加入浓度为0.05mol/L Tris缓冲液100ml，加热溶解，趁热分装安瓿A；(4)、配制显色液(a)、将底物L-丙氨酰-β-萘胺盐酸盐8mg，装入安瓿B，(b)、将浓度为0.2mol/L的缓冲液2ml分装安瓿C，pH为7.0，(c)、内装重氮盐染料固红TR6mg分装安瓿D，(d)、将浓度为0.1mol/L缓冲液1ml分装安瓿E，用时将安瓿B中的底物和安瓿C中的缓冲液混合；将安瓿D中的重氮盐染料和安瓿E中的缓冲液混合溶解。然后将安瓿B中的底物和安瓿C中的缓冲液的混合液与安瓿D中的重氮盐染料和安瓿E中的缓冲液的混合液混合，即为显色液。
应用将安瓿A隔水加热溶解，趁热浇在一玻璃板上，冷却后在距膜一端约2cm处放0.3×1cm的滤纸。约10分钟后取下滤纸，在该处加样8微升，放置5分钟。然后将凝胶板放在加好电极液的电泳槽架上，两端用4层纱布搭桥，电压100v，电泳30分钟，关闭电源。将胶板取出加入上述已混合好的显色液，放在37℃温箱里温育20-30分钟，即可见同工酶显色带。
结果如实施例1所述。
实施例5、做琼脂糖凝胶电泳试剂的制备，其包括有(1)、配制浓度为0.03mol/L电极液，PH为8.6；(2)、以冰乙酸做为固定液，取2ml分装安瓿F；(3)、配制琼脂糖凝胶将琼脂1g，蔗糖2g和聚乙烯吡咯烷酮0.3g，加入浓度为0.08mol/L泡醋纤膜缓冲液100ml，加热溶解，趁热分装安瓿A；(4)、配制显色液(a)、将底物L-胱氨酰-β-萘胺盐酸盐6mg，装入安瓿B，(b)、将浓度为0.1mol/L的缓冲液1.5ml分装安瓿C，pH为6.0，(c)、内装重氮盐染料固红RC7mg分装安瓿D，(d)、将浓度为0.2mol/L缓冲液1ml分装安瓿E，用时将安瓿B中的底物和安瓿C中的缓冲液混合；将安瓿D中的重氮盐染料和安瓿E中的缓冲液混合溶解。将安瓿B中的底物和安瓿C中的缓冲液的混合液与安瓿D中的重氮盐染料和安瓿E中的缓冲液的混合液混合，即为显色液。
应用如实施例4所述，结果显示胱氨酸氨基肽酶(CAP)，孕妇血清有二条酶活性带，正常人不含此酶，若孕妇此酶活性下降或消失，表明胎盘发育不良，此外肝癌患者血清中也可出现此酶活性。
权利要求
1.一种微粒体氨基肽酶同工酶诊断试剂盒的制备，做醋纤膜电脉，其包括有(1)、配制浓度为0.03～0.1mol/L电极液，PH为7.5-9.0；(2)、配制浓度为0.05～0.2mol/L泡醋纤膜缓冲液，分装安瓿A；(3)、将冰乙酸做为固定液，分装安瓿F；(4)、配制显色液(a)、将底物装入安瓿B，(b)、将浓度为0.05～0.5mol/L的缓冲液分装安瓿C，pH为6.2～7.5，(c)、将重氮盐染料分装安瓿D，(d)、将浓度为0.05～0.2mol/L缓冲液分装安瓿E，按重量百分比，其中安瓿B中的底物与安瓿D中的重氮盐染料，其比例分别为9.1％～80％，20.0％～90.9％，用时将安瓿B中的底物和安瓿C中的1～3ml缓冲液混合；将安瓿D中的重氮盐染料和安瓿E中的0.5～2ml缓冲液混合溶解。
2.一种微粒体氨基肽酶同工酶诊断试剂盒的制备，做琼脂糖凝胶电泳，其包括有(1)、配制浓度为0.03～0.1mol/L电极液，PH为7.5-9.0；(2)、以冰乙酸做为固定液分装安瓿F；(3)、配制琼脂糖凝胶将0.5～1.2g琼脂糖或琼脂加入浓度为0.05～0.2mol/L泡醋纤膜缓冲液80～120ml，加热溶解，趁热分装安瓿A；(4)、配制显色液(a)、将底物装入安瓿B，(b)、将浓度为0.05～0.5mol/L的缓冲液分装安瓿C，pH为6.2～7.5，(c)、内装重氮盐染料分装安瓿D，(d)、将浓度为0.05～0.2mol/L缓冲液分装安瓿E，按重量百分比，其中安瓿B中的底物与安瓿D中的重氮盐染料，其比例分别为9.1％～80％，20.0％～90.9％，用时将安瓿B中的底物和安瓿C中的1～3ml缓冲液混合；将安瓿D中的重氮盐染料和安瓿E中的0.5～2ml缓冲液混合溶解。
3.根据权利要求1、2所述的一种微粒体氨基肽酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于显色液也可以制备为冻干试剂，冻干试剂制备方法如下安瓿G将底物、浓度为0.05～0.5mol/L的缓冲液1～3ml分装于安瓿内，经冰冻干燥后，封口，为安瓿G，用时加水溶解即可使用；安瓿H将重氮盐染料与浓度为0.05～0.2mol/L缓冲液0.5～2ml分装于安瓿内，经冰冻干燥后封口，为安瓿H，用时加水溶解即可使用；按重量百分比，其中安瓿G中的底物与安瓿H中的重氮盐染料，比例分别为9.1％～80％，20.0％～90.9％。
4.根据权利要求1、2所述的一种微粒体氨基肽酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述安瓿B或安瓿G中的底物可以用下列化合物显示微粒体氨基肽酶，底物可以用L-丙氨酰-β-萘胺盐酸盐、L-亮氨酰-β-萘胺盐酸盐、L-亮氨酰-3-羧基苯胺、L-亮氨酰甘氨酸、亮氨酰对硝基苯胺、丙氨酰对硝基苯胺、蛋氨酰-β-萘胺盐酸盐、苯丙氨酰-β-萘胺盐酸盐等多种化合物。显示亮氨酸氨基肽酶(LAP EC3.4.11.1)底物可用亮氨酰胺、L-亮氨酰-对-氨基-二丙磺胺苯胺；显示胱氨酸氨基肽酶(CAPEC 3.4.11.3)；底物可用胱氨酰-β-萘胺、L-半胱氨酸-双-P-硝基苯胺、S-苄基-L-半胱氨酸-P-硝基苯胺硝基苯胺等。
5.根据权利要求1、2所述的一种微粒体氨基肽酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述安瓿C或安瓿G中的缓冲液可用磷酸盐类缓冲液，也可用Tris系列缓冲液。
6.根据权利要求1、2所述的一种微粒体氨基肽酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述安瓿D或安瓿H中的重氮盐染料可以有多种，如固蓝B或固蓝BB、固蓝R或固蓝RR、固紫B、柘石榴红GBC、固红RC、固红TR、六偶氮付品红等。
7.根据权利要求1所述的一种微粒体氨基肽酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述安瓿E中的缓冲液可以是磷酸缓冲液，醋酸缓冲液或可用Tris缓冲液。
8.根据权利要求2所述的一种微粒体氨基肽酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述琼脂糖凝胶的配制也可以是将琼脂糖或琼脂、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮，浓度为0.05～0.2mol/L泡醋纤膜缓冲液80～120ml，加热溶解，趁热分装安瓿A，其中琼脂糖或琼脂、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮按重量百分比其分别为7.0％～36.4％，52.6％～91.0％，1.4％～19.4％。
全文摘要
本发明公开了一种微粒体氨基肽酶同工酶诊断试剂盒的制备,属于酶学领域。其是将试剂分装于安瓿内,便于保存,性能稳定,重复性好,减轻了劳动强度,改变了传统的人工配制试剂的繁琐。并由此而引起的操作过程中个体间存在的差异,从而使操作规范化,使酶的检测及质量控制达到统一的标准,同时使用试剂盒简化了操作过程,省时、快速、便于推广。尤其是当做大量样品检测时试剂盒更方便适用,为临床疾病的诊断和鉴别诊断提供依据。
文档编号G01N33/531GK1381726SQ0111075
公开日2002年11月27日 申请日期2001年4月20日 优先权日2001年4月20日
发明者陈必珍, 舍英, 阎美容, 侯金凤 申请人:呼和浩特同日试剂有限公司