专利名称：治疗干燥综合征的诊断试剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医疗技术领域，具体地说是治疗干燥综合征的诊断试剂及其制备方法。
干燥综合征(又称舍格林氏综合征)是一种常见的自身免疫病。主要表现为唾液腺、泪腺、消化道腺体等外分泌腺的炎细胞浸润及破坏，导致进行性口干、眼干、血管炎、腮腺肿大及心肺受累、患者于唾液、泪腺分泌减少或停止，出现口干、眼干燥难忍，并可出现唾液腺肿大以及内脏病变。淋巴瘤、骨髓癌等恶性肿瘤有干燥综合征的发病率是正常人的40倍。流行病学调查发现，干燥综合征在我国的患病率有0.77％，而在老年人群上的患病率达4％。全国的患病者近千万。遗憾的是，本病在国内尚无特异诊断方法。除临床症状外，主要靠唇腺活检及腮腺造影等帮助诊断。但是，多数患者难以接受这些创伤性检查，致使延误诊断和丧失最好治疗时机。因此，寻找一种敏感性强，特异性高，且简便易行的诊断方法，对干燥综合征的断及研究具有重要意义。
本发明的目的是提供一种干燥综合征的诊断试剂及其制备方法，该诊断试剂能早日发现患者的病痛，及时诊断出病症，为减轻患者的痛苦、掌握最好的治疗时机、治疗患者的疾病提供了科学的依据。
经本发明的研究表明干燥综合征的发病机理至今不明，在干燥综合征患者的血清中可以检测到多种抗体，干燥综合征患者唇粘膜活检可见大量淋巴胞浸润，由此可见干燥综合征的发病与细胞及体液免疫反应密切相关。近年来，国外不少研究证明α-胞影蛋白与干燥综合征的发病有关，该蛋白是一种存在大多数具核细胞膜上与细胞内蛋白质分泌有关的跨膜蛋白，由α和β两个亚单位组成，研究证明，该蛋白的核心氨基酸序列与细胞内蛋白的分泌及干燥综合征的发病有关。抗体对于燥综合征的诊断的敏感性和特异性分别高达76％和95％，是干燥综合征的诊断中的标记性抗体。因此，研究α-胞影蛋白如何参与干燥综合征的发病、α-胞影蛋白与细胞及体液免疫反应的关系已成为探讨干燥综合征病因的关键。目前国内尚无关于α-胞影蛋白与干燥综合征关系的研究，国外有关这方面的研究也才刚刚起步，尚未应用于临床。在研制治疗干燥综合征的诊断试剂的过程中，要着重对α-胞影蛋白的研究，在研制工艺上首先是要克隆人的α-胞影蛋白的表达基因，构建重组人类-胞影蛋白的表达基因，建立表达α-胞影蛋白的细菌菌株，利用原核生物大规模生产α-胞影蛋白的工艺及方法，用α-胞影蛋白作为抗原建立灵敏度高及特异性强的干燥综合征的诊断试剂。
本发明的诊断试剂的技术方案如下本治疗干燥综合征的诊断试剂主要成份为α胞影蛋白，用作特异性抗原。
其制备方法按以下步聚制取1)手术取出人体涎腺的组织，置于液氮中冷冻保存；2)从冷冻保存的组织中提取总RNA，通过RT合成cDNA文库；3)设计α-胞影蛋白的特异性引物，通过PCR从cDAN库中扩增出α-胞影蛋白的表达基因，并经DNA测序确认；4)将α胞影蛋白的基因插入表达载体PGEX，并经原核表达系统进行表达，获得目的蛋白；5)经亲合层析法分离提纯表达的重组人类α-胞影蛋白的蛋白；6)用特异性抗α-胞影蛋白抗体做Western-Blot确认上述获得的α-胞影蛋白的蛋白；所设计的α-胞影蛋白的特异性引物为5CTTAAGCCCTTGCCACACCTCGCC和3’CTCTCGTGAAGGGCATTGCGGCGG。
诊断试剂的技术路线如下病人组织--》RNA提取--》cDNA库建立--》特异引物扩增获得α胞影蛋白基因--》接入载体--》转入E.coli--》分离、纯化重组的α-胞影蛋白蛋白--》病人血清试验--》评价敏感性与特异性临床采集健康人及干燥综合征病人的血清，用上述获得的重组α-胞影蛋白的蛋白与干燥综合征病人的血清进行抗原抗体免疫反应，通过此反应确定重组α-胞影蛋白抗原检测干燥综合征的灵敏度及特异性。
本发明的积极效果本发明具有敏感性强，特异性高，且简便易行的特点，能够填补国内尚无特异诊断方法治疗干燥综合征的空白，而且较现有的除临床症状外，主要靠唇腺活检及腮腺造影帮助诊断的治疗方法在临床上有效大水平的提高，用该诊断试剂治疗干燥综合征的患者，不但能够早日诊断出患者的病症，让患者早日接受治疗，而且能够防止患者因延误诊断或丧失最好的治疗时机而带来更大的病痛，为减轻在治疗干燥综合征的过程中所带来的痛苦，对推动人类医学史上干燥综合征的有效防治和治疗均具有积极意义。
实施例治疗干燥综合征的诊断试剂的制备方法按以下步聚制取1)手术取出人体涎腺的组织，置于液氮中冷冻保存；2)从冷冻保存的组织中提取总RNA，通过RT合成cDNA文库；3)设计α-胞影蛋白的特异性引物，引物为5’CTTAAGCCCTTGCCACACCTCGCC和3’CTCTCGTGAAGGGCATTGCGGCGG，通过PCR从cDAN库中扩增出α-胞影蛋白的表达基因，并经DNA测序确认；4)将α胞影蛋白的基因插入表达载体PGEX，并经原核表达系统进行表达，获得目的蛋白；5)经亲合层析法分离提纯表达的重组人类α-胞影蛋白的蛋白；6)用特异性抗α-胞影蛋白抗体做Western-Blot确认上述获得的α-胞影蛋白的蛋白。
权利要求
1.一种治疗干燥综合征的诊断试剂，其特征在于主要成份为重组的α胞影蛋白蛋白。
2.根据权利要求1所述的诊断试剂的制备方法，其特征在于按以下步聚制取1)手术取出人体涎腺的组织，置于液氮中冷冻保存；2)从冷冻保存的组织中提取总RNA，通过RT合成cDNA文库；3)设计α-胞影蛋白的特异性引物，通过PCR从cDAN库中扩增出α-胞影蛋白的表达基因，并经DNA测序确认；4)将α胞影蛋白的基因插入表达载体PGEX，并经原核表达系统进行表达，获得目的蛋白；5)经亲合层析法分离提纯表达的重组人类α-胞影蛋白的蛋白；6)用特异性抗α-胞影蛋白抗体做Western-Blot确认上述获得的α-胞影蛋白的蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于设计的α-胞影蛋白的特异性引物为5’CTTAAGCCCTTGCCACACCTCGCC和3’CTCTCGTGAAGGGCATTGCGGCGG。
全文摘要
本发明是一种治疗干燥综合征的诊断试剂及其制备方法。其特征在于主要成份为重组的α胞影蛋白蛋白。并通过手术取出人体涎腺的组织，置于液氮中冷冻保存；从组织中提取总RNA，通过RT合成cDNA文库；设计α－胞影蛋白的特异性引物，通过PCR从cDAN库中扩增出α－胞影蛋白的表达基因，并经DNA测序确认；将α胞影蛋白的基因插入表达载体PGEX，并经原核表达系统进行表达，获得目的蛋白等步骤获得。本发明具有敏感性强，特异性高，且简便易行的特点，它能够早日诊断出患者的病症，让患者早日接受治疗，而且能够防止患者因延误诊断或丧失最好的治疗时机而带来更大的病痛。
文档编号G01N33/68GK1393694SQ0110857
公开日2003年1月29日 申请日期2001年6月21日 优先权日2001年6月21日
发明者栗占国, 张 杰 申请人:昆明广博科技有限公司