专利名称：细胞学组合检测及操作方法
技术领域：
本发明属细胞学检测技术，具体地说是细胞学多项指标的组合检测技术及相应的操作方法。
在细胞免疫学、细胞遗传学、细胞增殖动力学的研究中，淋巴细胞转化率(LTR)、微核率(MNR)、姊妹染色单体互换频率(SCE)、有丝分裂指数(MI)、细胞周期比率(CCR)、增殖率指数(PRI)是常用和首选的指标。目前国内外多数实验室测定这6项指标，采用的是采一次血来培养72小时后，收集细胞制片，观测一项指标，要观测另一项指标得再采一次血来培养72小时后，收集细胞制片观测。这种单项实验单项测定方法，仪器复杂、操作繁琐、费时耗资，用单项实验单项测定6项指标要耗资一千多元，需连续工作35天才能获得全部结果。单项测定法，测定结果只能反映某一方面的问题，不利于综合分析评价。因此，国内外均有人试图探索简便易行的方法。1986年Kunihiko等在研究温度对化学物质诱发人体淋巴细胞SCE的影响时，把SCE和CCR组合观测，1988年顾祖维等在16种化学物体外微核检测中把SCE与MNR同时观测，提高了检测效率和可靠性，但未见三项以上指标组合检测的报道。经国际联机检索国内外科技文献和国内外专利文献均未见与本发明相同技术报道。
本发明的目的鉴于传统的细胞学检测方法存在仪器复杂、操作繁琐、费时耗资等缺点，建立快速、简便，省力节资的组合检测法就显得势在必行。为此，我们发明了细胞学组合检测及相应的操作方法。
主要技术内容一、细胞学组合检测随着当代生物科学的发展，细胞检测技术已成了推动细胞生物学、基础医学、临床医学、预防医学进步和发展的有力武器。细胞生物学和医药卫生科研及实际应用都离不开细胞学检测技术，例如我们可通过测定LTR来了解细胞的免疫功能；测定MNR和SCE来了解染色体和DNA的损伤程度；测定MI、CCR和PRI来判断细胞的分裂和增殖活力。科学技术的不断进步和边缘学科的兴起，使细胞学检测技术在医药卫生及有关部门的应用日益广泛，研究和应用好新方法是科技人员的当务之急。
为此，我们在细胞学单项实验单项检测法基础上，发明了细胞学组合检测法，它的特征是在观测姊妹染色单体互换频率(SCE)的玻片上同时观测淋巴细胞转化率(LTR)、微核率(MNR)、有丝分裂指数(MI)、细胞周期比率(CCR)和增殖率指数(PRI)6项指标的细胞学组合检测。
研究细胞学组合检测法要考虑的主要问题是试剂和操作方法对实验结果的影响，用组合方法与传统法检测LTR、MNR、MI的差别在于主要是前者在细胞培养液中加入了胸腺嘧啶核苷的类似物5-溴脱氧尿嘧碇核苷和纺锤体抑制剂秋水仙碱，其次是前者用UPG分化染色，这些因素对检测结果是否有影响？我们作了30例自身对比研究。用组合法测定的LTR为67.30±12.27％，MNR为1.07±0.77‰，MI为4.93±1.34％；用传统法测定的LTR为68.77±10.01％，MNR为1.20±0.65‰，MI为2.25±1.85％。经统计学处理，LTR和MNR均无显著性差异(P＞0.05)，MI有显著性差异(P＜0.001)，表明可用组合法代替传统法来测定LTR和MNR，而测定MI最好是用组合法。加之测定CCR和PRI一直是和SCE的方法相同。所以，组合法是测定LTR、MNR、SCE、MI、CCR、PRI的可靠方法。
根据优选组合细胞免疫学、细胞遗传学和细胞增殖动力学等边缘交叉学科里常用和首选的观测指标而建立的细胞学组合检测及操作方法，在同一张玻片上，同时观测人体淋巴细胞转化率(LTR)、微核率(MNR)、姊妹染色单体互换频率(SCE)，有丝分裂指数(MI)、细胞周期比率(CCR)、增殖率指数(PRI)6项指标，具有灵敏、简便、快速、经济、准确可靠，一次同时测试多个终点，各项指标之间优势互补，有利于综合评价的优点。6项检测指标，也可视使用目的单项或多项组合应用，在细胞生物学、基础医学、临床医学、预防医学等学科领域里应用。
二、操作方法在单项实验，单项检测的操作方法的基础上，我们发明了细胞学组合检测的操作方法，其特征是进行组合检测时在观测姊妹染色单体互换频率等操作中，配制培养液时加入了自制小牛血清和自制植物血凝集素，该自制小牛血清是抽取初生牛犊全血分离其血清而成，该自制植物血凝集素是从大白芸豆中提取而成。进行细胞培养时加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)25μg，收获前6小时加入秋水仙碱0.3μg。分化染色采用30W紫外灯距离8cm垂直照射25分钟，4％Giemsa37℃染色7分钟。
细胞学组合检测具体操作方法如下1、标本制作1.1配制培养液 在无菌室内配制，以5ml/份计算，其中含RPMI 1640培养液3.8ml、自制小牛血清1ml、自制植物血凝集素(PHA)0.2ml、双抗(青霉素500U和链霉素500μg)或卡那霉素250μg、肝素12.5μg，用5％NaHCO3调PH至7.2，可按此比例批量配制，用10ml灭菌培养瓶分装，放4℃备用。也可用市售成品细胞培养试剂盒。
1.2细胞培养 在无菌条件下，每份细胞培养液中加入新鲜全血0.3ml、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)25μg、受检物适量，摇勺，37℃避光培养72小时。收获前6小时加入秋水仙碱0.3μg。
1.3收集细胞 将细胞培养物吸入10ml离心管，以1000转/分离心10分钟，吸弃上清液；在沉淀物中加入37℃预温的0.075mol·L-1KCl低渗液5ml，用吸管吹打匀，放37℃水浴12分钟，最后2分钟加入3∶1(无水乙醇∶冰乙酸)固定液1ml预固定，以1000转/分离心10分钟，吸弃上清液；在沉淀物中加入3∶1固定液5ml，用吸管轻吹打散细胞团块，室温静置30分钟，以1000转/分离心10分钟，吸弃上清液；重复前述操作，即在沉淀物中加入3∶1固定液5ml，用吸管轻吹打散细胞团块，室温静置30分钟，以1000转/分离心10分钟，吸弃上清液；在白色沉淀物中加入0.5ml固定液，放4℃冰箱静置30分钟，滴冰片2-3张。
1.4分化染色 玻片编号，放37℃孵箱老化12-24小时后，在60℃恒温水浴箱上置一金属板，玻片置于其上，滴加预温50℃的2×SSC液，30W紫外灯距离8cm垂直照射25分钟。取出玻片在自来水中漂洗，即用4％Gimsa磷酸缓冲液(PH6.8)37℃染色7分钟，自来水冲片，凉干。
2.结果观测2.1 LTR 每例在高倍或油镜下计数200个淋巴细胞中所含的转化细胞和未转化细胞数。转化淋巴细胞体积大，核疏松，染色偏红；未转化淋巴细胞体积小，核致密，染色偏蓝；过渡型细胞体积大小、核致密度、着色度、介于转化和未转化细胞之间，其特征是在高倍镜下细胞膜呈戒指状环形亮圈，调动焦距，圈的亮度随细胞核清晰度的变化而变化；过渡型细胞记入转化细胞。
LTR(％)＝转化细胞数/观测细胞总数(转化细胞数+未转化细胞数)×100，样本间比较用卡方(X2)检验。我室观测60例正常值为74.67％。
2.2 MNR 每例在高倍镜或油镜下计数2000个转化淋巴细胞中的微核细胞和非微核细胞数。微核的特征是(1)在转化细胞的胞浆内，完全与主核分离；(2)染色与主核一致；(3)小于主核的1/3。
MNR(‰)＝微核细胞数/观测的转化细胞总数(微核细胞+非微核细胞)×1000，样本间比较用X2检验。我室观测60例正常值为1.19‰。
2.3 SCE 每例在油镜下计数25个分散良好，色差分明的第二中期分裂细胞的SCE数。染色单体未端发生的互换记为1次SCE；在染色单体中间发生的互换记为2次SCE；在着丝点处发生的交换，并判明不是染色单体扭转者也记为1次SCE。
SCE/细胞＝SCE总数/观测细胞数，用两样本均数t检验统计分析。我室观测60例正常值为5.07/细胞。
2.4 CCR 每例在油镜下计数200个中期分裂相中的第一周期(M1)细胞、第二周期(M2)细胞、第三周期(M3)细胞数。它们的特征是M1为不显色差的红色染色体；M2全部染色体均为一条单体显深色，一条显浅色；M3部分染色体为一条单体显深色，一条单体显浅色，另一部分染色体的两条单体均显浅色。
Mx(％)＝Mx/观测细胞总数(M1+M2+M3)×100，样本间比较用X2检验。我室观测60例正常值为M119.46％，M227.19％，M353.35％。
2.5 PRI 代入公式求出。PRI＝(1M1+2M2+3M3)/100，样本间比较用X2检验。我室观测60例正常值为2.34。
2.6 M1 每例在油镜下计数1000个细胞中所含的分裂细胞数。分裂细胞的特征是M1、M2、M3均为典型的分裂细胞；此外，细胞核呈丝网状或毛线团状的细胞也记为分裂细胞数。
MI(％)＝分裂细胞数/观测细胞总数(分裂细胞数+未分裂细胞数)×100，样本间比较用X2检验。我室观测60例正常值为4.69％。
仪器设备及试剂配制
1、实验室应具备细胞培养的基本条件主要仪器有电光源双目显微镜、电冰箱、电热干燥箱、电热恒温培养箱、电热恒温水浴箱、电炉、离心机、高压蒸汽消毒器、净化工作台、30W紫外光灯、无菌过滤器、蒸馏器、注射器、试剂瓶、细胞培养瓶、刻度吸管、毛细吸管、离心管、玻片、量筒、烧杯、容量瓶、分析天平等。
2、成品试剂配制2.1培养基配制 称取RPMI 1640培养基10.4g于容量瓶中，加入三蒸水溶解，加NaHCO32g，用力振摇，使其彻底溶解，加三蒸水定容至1000ml，调PH至7.0。用灭菌G6玻砂滤器过滤除菌，在无菌室内分装，贮4℃备用。
2.2 0.85％生理盐水 称取NaCl4.25g于输液瓶中，加三蒸水500ml溶解。
2.3 500μg/ml肝素液 称取肝素钠50mg于注射瓶内，用0.85％生理盐水溶解至100ml，瓶塞上扎一注射针头排气减压，0.069Mpa15min灭菌，4℃贮存备用。也可取注射用肝素(125万u/ml)2ml，加无菌生理盐水至25ml，贮4℃备用。
2.4 5％NaHCO3溶液 称取分析纯NaHCO35g于注射瓶中，加三蒸水100ml溶解，瓶塞上扎一注射针头排气减压，0.069Mpa15min灭菌，贮4℃备用。
2.5 250μg/ml Brdu液 称取5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)1mg于无菌小瓶中，加灭菌生理盐水4ml，摇勺，避光保存于4℃，最好是现配现用。
2.6 1μg/ml秋水仙碱液 称取秋水仙碱10mg于注射瓶中，用0.85％生理盐水溶解至100ml，取此液1ml加0.85％生理盐水99ml，瓶塞上扎一注射针头排气减压，0.069Mpa 15min灭菌，贮4℃备用。
2.7 0.075mol·L-1KCL低渗液 称取KCl2.79g于容量瓶中，加蒸馏水溶解，定容至500ml。
2.8 3∶1固定液配制 量取3份无水乙醇与1份冰乙酸混匀，须现配现用。
2.9 2×SSC液 称取NaCl 17.54g、柠檬酸三钠8.82g，溶于1000ml蒸馏水中。
2.10磷酸缓冲液(1)1/15mol·L-1Na2HPO4溶液 称取Na2HPO4.12H2O 23.87g，加蒸馏水溶解，定容至1000ml；(2)1/15mol.L-1KH2PO4溶液称取KH2PO49.08g，加蒸馏水溶解，定容至1000ml。
2.11 Giemsa原液配制 称量0.5g Giemsa粉，甘油33ml，在研钵内先用少量甘油和Giemsa粉混合，研磨直至无颗粒为止，再将剩余甘油倒入，56℃保温2h后，加入33ml纯甲醇，保存于棕色瓶内。
2.12 Giemsa应用液配制 量取磷酸缓冲液(1)和(2)各48ml，加Giemsa原液4ml，混匀，即为4％Giemsa染色液。
3.注意事项3.1配制试剂除特殊要求外，一律用灭菌三蒸水；
3.2细胞培养所用的一切器皿必须严格清洗和灭菌；3.3所用的试剂生产厂和批号不要随意变换；3.4化学污染、细菌污染、酸碱度和温度变化是影响细胞培养的致命因素，时刻都要高度重视。
优点和积极效果细胞学组合检测法丰富和发展了细胞学检测技术，其应用范围广，实用价值高，我们已将该方法用于细胞生物学、劳动卫生职业病损伤、卫生毒理学、中药和食品资源保健作用研究及慢性病防冶研究，取得了显著的社会效益和经济效益。细胞学组合检测法作为边缘交叉学科里的一项新技术，还可用于环保监测及传染病、地方病、遗传性疾病、免疫性疾病和肿瘤防治研究。为促进科学进步和学术交流，为保护人体健康和经济建设做出了重要贡献。经组合法与传统法直接经济效益比较，用组合法同时测定6项指标耗资为385元，只需连续工作9天就能获得全部结果，而单项实验单项测定6项指标，则要耗资1383.20元，需连续工作35天才能获得全部结果。
实施例用番石榴成熟果对人体细胞免疫遗传及增殖作用的组合检测番石榴(Psidium gurajava L.)分布于热带、亚热带国家和地区，攀西地区野生资源丰富。因富含多种营养成份及其独特的风味和药效作用，有较大的开发利用价值。鉴于以往研究结果提示，野生番石榴半成熟果有抑制淋巴细胞转化和增殖及诱发SCE和微核的作用，本文用细胞学组合检测法进一步探讨种植和野生番石榴成熟果对人体细胞免疫、遗传和增殖作用，为其开发利用提供依据。
1.材料和方法1.1样品制备 采摘市林科所种植和荒山野生番石榴成熟鲜果，加水捣碎，过滤取汁，灭菌备用，以固形物干重计算含量，种植果受试剂量为20μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、2500μg/ml，野生果受试剂量为15μg/ml、80μg/ml、400μg/ml、2000μg/ml。
1.2细胞培养及观测 按细胞学组合检测及操作方法配制细胞培养液，每份细胞培养液含RPMI 1640培养液3.8ml、自制小牛血清1ml、自制植物血凝集素(PHA)0.2ml、卡那霉素250μg、肝素12.5μg、用5％NaHCO3调PH至7.2，以5ml/瓶分装。每份标本中加入不同含量的番石榴溶液，新鲜全血0.3ml，Brdu终浓度5μg/ml。重蒸馏水为对照组。37℃避光培养72小时，收获细胞前6小时加入秋水仙碱0.3μg。按细胞学组合检测及操作方法收集细胞、制片、分化染色、观测计数和统计淋巴细胞转化率(LTR)、姊妹染色单体互换(SCE)、微核率(MNR)、有丝分裂指数(MI)、细胞周期比率(CCR)和增殖率指数(PRI)6项指标。
2.结果2.1对人体细胞免疫的影响 种植番石榴4个剂量组的LTR为76.4％、82.2％、77.0％、82.4％，与对照组80.0％比无显著差异(P＞0.05)。野生番石榴4个剂量组的LTR为78.0％、78.0％、76.0％、63.4％，最高剂量63.4％，显著低于对照组80.0％(P＜0.005)。
2.2对人体细胞遗传的影响 种植番石榴4个剂量组的SCE为6.0±2.3/细胞、5.2±1.9/细胞、5.6±1.8/细胞、5.3±1.9/细胞，与对照组4.5±2.1/细胞比较差异不显著(P＞0.05)；MNR为2.0‰、1.8‰、1.8‰、2.6‰，与对照组1.4‰比较无显著差异(P＞0.05)。野生番石榴4个剂量组的SCE为4.6±2.3/细胞、4.4±1.9/细胞、4.4±1.8/细胞、5.0±2.1/细胞，与对照组4.5±2.1/细胞比无显著性差异(P＞0.05)；MNR为0.6‰、0.6‰、0.6‰、0.4‰，与对照组1.4‰比差异不显著(P＞0.05)。
2.3对人体细胞增殖的影响 种植番石榴4个剂量组的MI为5.9％、5.8％、6.6％、5.3％，与对照组5.0％比较差异不显著(P＞0.05)；CCR为M17.4％、6.0％、12.6％、7.0％，M222.8％、12.4％、16.2％、20.4％，M369.8％、81.6％、71.2％、72.6％，与对照组(MI15.0％、M221.2％、M363.8％)比有显著差异(P＜0.05)；PRI 2.6、2.8、2.6、2.7与对照组2.5比有高度显著性差异(P＜0.005)。野生番石榴4个剂量组的MI为5.0％、6.0％、6.5％、6.0％，与对照组5.0％比较无显著性差异(P＞0.05)；CCR为M111.6％、7.6％、16.4％、25.8％，M218.8％、23.6％、26.2％、29.6％，M369.6％、68.8％、59.4％、44.60％，与对照组(M115.0％、M221.2％、M363.8％)比较，最高剂量组有显著差异(P＜0.05)；PRI 2.6、2.6、2.5、2.2与对照组2.5比较，最高剂量有高度显著性差异(P＜0.005)。
3.讨论番石榴已有数百年食用历史，在国外有果王，果后之称。中西医认为，番石榴性平无毒，有收敛、止泻、止血、止痒、消炎解毒和抗诱变作用，对糖尿病疗效明显。
本文用细胞学组合检测法探讨种植和野生番石榴成熟果对人体淋巴细胞免疫、遗传和增殖效应。野生番石榴最高剂量组LTR显著低于对照组(P＜0.005)，这与我们先前的研究结果一致，有轻微抑制淋巴细胞转化，降低细胞免疫力的作用。种植和野生番石榴诱发的SCE和MNR与对照组比无明显差异，未见致人体细胞DNA和染色体损伤作用；种植番石榴M3和PRI显著高于对照组(P＜0.05)和(P＜0.005)，有激活细胞增殖的作用；野生番石榴M3和PRI高剂量组显著低于对照组(P＜0.05)和(P＜0.005)，此与先前结果一致，有抑制细胞增殖的作用。
权利要求
1.一种细胞学组合检测法其特征是在观测姊妹染色单体互换频率(SCE)的玻片上，同时观测淋巴细胞转化率(LTR)、微核率(MNR)、有丝分裂指数(MI)、细胞周期比率(CCR)和增殖率指数(PRI)6项指标的细胞学组合检测方法。
2.一种细胞学组合检测的操作方法其特征是在进行细胞学组合检测时，在观测姊妹染色单体互换频率等操作中a配制培养液加入自制小牛血清和自制植物血凝集素(PHA)；b细胞培养加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)25μg，收获前6小时加入秋水仙碱0.3μg；c收集细胞加入无水乙醇∶冰乙酸(3∶1)为固定液；d分化染色用30W紫外灯距离8cm垂直照射25分钟，4％Giemsa37℃染色7分钟。
3.按权利要求2所说的操作方法其特征是自制小牛血清是抽取初生牛犊全血分离其血清而成。
4.按权利要求2所说的操作方法其特征是自制植物血凝集素(PHA)是从大白芸豆中提取而成。
全文摘要
本发明提供一种细胞学组合检测及操作方法,在同一玻片上,同时观测人体淋巴细胞转化率(LTR)、微核率(MNR)、姊妹染色单体互换频率(SCE)、有丝分裂指数(MI)、细胞周期比率(CCR)和增殖率指数(PRI)6项指标。具有灵敏、简便、快速、经济、准确可靠,各项指标之间优势互补,有利于综合评价的优点,可在细胞生物学、基础医学、临床医学、预防医学等学科领域里应用。同时,本发明还提出了相应和可靠的操作方法。
文档编号G01N33/50GK1375698SQ0110727
公开日2002年10月23日 申请日期2001年3月21日 优先权日2001年3月21日
发明者张家华 申请人:攀枝花市卫生防疫站