一种氨基末端b型利钠肽前体免疫层析半定量检测试纸的制作方法
【专利摘要】本实用新型提供了一种氨基末端B型利钠肽前体免疫层析半定量检测试纸，包括硝酸纤维素NC膜，胶体金垫、样品垫和吸水纸，所述胶体金垫上含有NT-proBNP标记抗体以及兔IgG标记抗体，所述硝酸纤维素NC膜在沿液体层析方向上依次包被有检测线、参比线以及质控线，本实用新型通过参比线的设置以及对划线抗体含量的精确控制，实现对NT-proBNP浓度在300ng/L～900ng/L这一区域的血清样品进行半定量检测。
【专利说明】一种氨基末端B型利钠肽前体免疫层析半定量检测试纸
【技术领域】
[0001]本发明创造属于人氨基末端B型利钠肽前体检测领域，特别涉及一种采用胶体金免疫层析法对人氨基末端B型利钠肽前体进行半定量检测的试纸。
【背景技术】
[0002]氨基末端B型利钠肽前体(ΝΤ-ρι.οΒΝΡ)是由心室分泌的一种激素类多肽。是由心肌细胞合成的具有生物学活性的天然激素，主要在心室表达，同时也存在于脑组织中。当心室功能不全时，由于心肌扩张而快速合成释放入血，有助于调节心脏功能。心肌细胞所分泌的BNP先以108个氨基酸组成的前体形式存在，当心肌细胞受到刺激时，在活化酶的作用下裂解为由76个氨基酸组成的无活性的直线多肽和32个氨基酸组成的活性环状多肽，释放入血循环，分别被称为NT-proBNP和BNP。
[0003]BNP和NT-proBNP检测在本世纪初先后进入我国，十年来已经为各级医院和医师广泛用于临床实践，成为心血管病尤其是心力衰竭诊断十分有用的生物标志物。我国2007年《慢性心力衰竭诊断治疗指南》和2010年《急性性心力衰竭诊断治疗指南》也推荐将NT-proBNP和BNP用于心衰的诊断和预后判断。
[0004]目前临床上用于NT-proBNP测定的方法有多种。其中，国内电化学发光法采用Roche公司的Elecsys2010电化学全自动免疫分析仪和相应试剂盒。与其它测定方法相比，其检测线性范围更宽，精密度更好，测定结果在各种不同的温度下都有良好的稳定性，可以适合临床不同的需求。缺点是试剂一般只能配合专门仪器来使用，费用较高，不利于基层医院开展此项检测。
[0005]免疫胶体金技术是20世纪70年代初期Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，现在已成功用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断制剂的制造等领域。目前金标记技术常与膜载体配合，形成特定的免疫检测方式，如免疫渗滤试验和免疫层析试验等。免疫层析试纸条就是此技术用于体外快速诊测方式的一个重要发展方向，是在现代单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的新型检测技术。近年来该技术发展迅速，已经在临床诊断特别是床边检测(POCT)中的到了广泛应用，如传染病、早孕、癌症等的检测。免疫胶体金技术与ELISA技术同属于免疫学诊断方法，均是依赖于抗原与抗体的特异性反应，但不需要专门的仪器设备，更适于现场及床旁快速检测。
[0006]由于床旁检测(Point of Care testing，P0CT)测定NT-proBNP可以方便快速地提供可靠的检验结果，帮助预测心衰，进而使医生更早制订治疗策略并节省治疗费用；将其作为中心实验室的扩展，也能够增加检测能力并减轻实验室检验人员的压力，管理人员也能更合理地使用资源。研宄表明就诊时测定NT-proBNP浓度低于300ng/L，则该患者急性心衰的可能性很小(“排除”截点)；患者年龄介于50?75岁时，测定ΝΤ-ρι.οΒΝΡ浓度高于900ng/L，则该患者急性心衰的可能很大(“诊断”截点)。如检测值介于上述两截点之间(“灰区”)，可能是程度较轻的急性心衰，或是非急性心衰原因所致的ΝΤ-ρι.οΒΝΡ轻增高，(如心肌缺血、房颤、肺部感染、肺癌、肺动脉高压或肺栓塞等)，此时应结合其它检查结果进行进一步的鉴别诊断。
[0007]目前虽然有一些试剂厂商开发出了检测下限为10pg/mL，但是都需要配合大型仪器才能进行检测，费时、费力且价格昂贵。且市场上专门针对300ng/L?900ng/L这一临界范围的快速检测产品尚属空白。因此急需一种能够对血清中ΝΤ-ρι.οΒΝΡ进行半定量检测的胶体金试纸，提供断病依据，以帮助医务工作人员及时准确的掌握患者病情，降低医疗风险和成本。
【发明内容】
[0008]本发明创造提供一种氨基末端B型利钠肽前体免疫层析半定量检测试纸，能够高效快速、并且准确半定量地对NT-proBNP进行实时检测，具有十分重要的经济和社会价值。
[0009]为解决上述技术问题，本发明创造采用的技术方案是，包括硝酸纤维素NC膜，在所述硝酸纤维素NC膜一端依次向上搭接有胶体金垫、样品垫，在所述硝酸纤维素NC膜另一端向上搭接有吸水纸，所述胶体金垫上含有NT-proBNP标记抗体以及兔IgG标记抗体，所述硝酸纤维素NC膜在沿液体层析方向上依次包被有检测线(T线)、参比线(R线)以及质控线(C线)，所述检测线为与所述NT-proBNP标记抗体配对的NT-proBNP抗体，所述参比线为羊抗兔二抗，所述质控线为羊抗鼠二抗。
[0010]其中，所述NT-proBNP标记抗体为胶体金标记的鼠抗人NT-proBNP单克隆抗体，检测线上与其配对的NT-proBNP抗体也为鼠抗人NT-proBNP单克隆抗体，二者分别识别NT-proBNP不同的表位，所述兔IgG标记抗体为胶体金标记的兔IgG抗体。
[0011]其中，所述胶体金的颗粒大小为15-25nm，优选为20_22nm。
[0012]其中，所述胶体金垫是将540nm处OD值为1.2-1.4的NT-proBNP标记抗体溶液以及540nm处OD值为0.8-1.0的兔IgG标记抗体溶液以体积比1: 1.2混合后，以2.5 μ I/mm的量点样而成。
[0013]其中，所述硝酸纤维素NC膜中，检测线由1.5mg/ml的NT-proBNP标记抗体以0.001ml/cm均勾划线而成；参比线由0.8mg/ml羊抗兔多克隆抗体以0.001ml/cm均勾划线而成；所述质控线由2.0mg/ml羊抗鼠多克隆抗体以0.001ml/cm均勾划线而成。
[0014]进一步，所述检测线(T线)、参比线(R线)以及质控线(C线)间的间隔为0.4cm;所述胶体金垫距T线间的间隔为0.2-1.0cm，优选为0.4-0.6cm。
[0015]其中，所述硝酸纤维素NC膜为孔径8-12 μ m的多孔样结构膜，所述样品垫为玻璃纤维膜或无纺布，所述胶体金垫采用玻璃纤维膜，所述吸水纸为吸水滤纸，以上材料均为常用材料，可市购。
[0016]本发明创造具有的优点和积极效果是:操作方便、反应灵敏、敏感性高，便于携带和保存，适用于医护人员进行实时检测。并且，本发明通过参比线的独立设置以及对各划线抗体种类和含量等的精确控制，实现对NT-proBNP浓度在300ng/L?900ng/L这一区域的血清样品进行半定量检测，为医护人员对心衰等相关疾病进行判断提供有力的参考依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是本发明创造结构示意图。
[0018]图2是本发明创造使用结果判定示意图。
[0019]其中:
[0020]1-样品垫；2_胶体金垫；3_硝酸纤维素NC膜；4-T线；5_R线；6_C线-J-吸水纸。
【具体实施方式】
[0021]下面通过具体实施例对本发明创造进行进一步说明，下述详细的实施方式和具体的操作过程仅为阐述本发明创造方案的目的，并非用于限定本发明创造。
[0022]下述实施例中，未特殊说明的材料或试剂，通常为商用可市购产品，或可经由相关医疗机构从公开的途径获得。下述实施例中未注明具体条件和参数的实验方法，通常按照常规条件和参数，或按照制造厂商所建议的条件和参数。
[0023]实施例1胶体金的制备
[0024]将0.02%氯金酸溶液加热煮沸，迅速加入2%的柠檬酸三钠2mL ;溶液颜色由浅蓝色变为深蓝，继续加入出现酒红色，继续煮沸1min ;出现透明的酒红色，停止加热，继续搅拌至室温，获得粒径在20nm左右的胶体金溶液。电镜镜检，确保制备的金颗粒尽量使其大小一致、均匀，颗粒直径在20nm左右，否则重新制作。
[0025]实施例2含标记抗体的胶体金垫的制备
[0026]取1.5mL试管，加入ImL胶体金溶液；向其中加入适量硼砂缓冲液把pH调整为7.4 ;加入15 μ g/mL NT-proBNP标记抗体，使其达到最小蛋白浓度，混匀，于振荡仪上快速振荡30min ;加入10 μ L的10% BSA，混勾，振荡20min ;于离心机中8000rpm，离心20min，轻轻吸除上清；用ImL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；用fix buffer配制在540nm处OD (光密度)值为1.2-1.4的胶体金免疫复合物；
[0027]另取1.5mL试管，加入ImL胶体金溶液；向其中加入适量硼砂缓冲液把pH调整为9.0 ;加入10 μ g/mL兔IgG标记抗体，使其达到最小蛋白浓度，混勾，于振荡仪上快速振荡20min ;加入10 μ L的10% BSA,混勾，振荡20min ;于离心机中8000rpm,离心20min，轻轻吸除上清；用ImL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；用fix buffer配制在540nm处OD (光密度)值为0.8-1.0的胶体金免疫复合物；
[0028]将上述两种胶体金免疫复合物按照体积比1: 1.2的比例混合，以2.5 μ 1/mm的量在玻璃纤维膜上点样，形成胶体金垫，并在适宜的条件下干燥，一般为37°C干燥12小时。
[0029]实施例3硝酸纤维素NC膜的包被
[0030]采用喷膜仪，将1.5mg/ml的NT-proBNP标记抗体以0.001ml/cm均勾划在硝酸纤维素NC膜上形成T线；将0.8mg/ml羊抗兔多克隆抗体以0.001ml/cm均勾划在硝酸纤维素NC膜上形成R线；将2.0mg/ml羊抗鼠多克隆抗体以0.001ml/cm均匀划在硝酸纤维素NC膜上形成C线，且三条线之间的间隔为0.4cm。然后放入干燥间在适宜的温度和湿度下干燥。
[0031]实施例4检测试纸的组装
[0032]在条件适宜的干燥室内，将实施例2获得的胶体金垫和实施例3获得的包被完成的硝酸纤维素NC膜以及样品垫和吸水纸裁剪成合适的大小，按照图1所示的结构进行粘接，控制胶体金垫距T线间的间隔为0.4-0.6cm，该间隔可以通过控制包被NC膜的划线位置、调整裁剪尺寸以及粘接部分大小来实现，胶体金垫与NC膜的粘接部分不小于胶体金垫的1/7，胶体金垫与样品垫的粘接部分为胶体金垫的1/7?1/2，吸水纸与NC膜的粘接部分不小于吸水纸的1/10。上述相互粘接的各部分可预先或粘接后固定于一个承载板上，所述承载板可以为塑料板。固定完成后将其裁剪至合适的大小即可。所述检测试纸还可以进而装入一塑盒中，并在塑料盒上对应样品垫和硝酸纤维素NC膜划线部分设置开口，方便携带和保存。
[0033]实施例5检测原理和方法
[0034]本发明创造中利用了免疫层析检测法中双抗体夹心显色的原理，当待测血清中含有一定浓度的NT-proBNP时，将其加入样品垫后，样品中的液体溶解胶体金垫中鼠源NT-proBNP单克隆抗体，并且NT-proBNP与该胶体金标记的鼠源NT-proBNP单克隆抗体发生特异性结合，形成抗原-抗体-胶体金复合物，并继续靠毛细作用向检测线移动。当样品到达检测线时，上述抗原-抗体-胶体金复合物与包被在检测线上的配对的NT-proBNP抗体进一步结合，形成抗体-抗原-抗体-胶体金双抗体夹心复合物，并在检测线上聚集显色。随着毛细作用的进一步向前，到达质控线时，由于胶体金垫中NT-proBNP单克隆抗体是鼠源性的，因此无论待测血清中是否含有ΝΤ-ρι.οΒΝΡ，均被固定于质控线的羊抗鼠二抗所捕获并显色，这种显色即保证了整个反应体系是正确的。同时，本发明创造为了半定量的目的，在胶体金垫中还加入了胶体金标记的兔源IgG抗体，并在检测线与质控线间设置能与其发生特异性反应的羊抗兔二抗参比线，无论待测血清中有无NT-proBNP，都会在经过胶体金垫时带动兔IgG标记抗体向前涌动，并在参比线位置发生显色反应，且其显色水平被设置为相当于NT-proBNP浓度在900ng/L时的显色水平，这样，就能很方便的通过直观的观察来获得待测血清中ΝΤ-ρι.οΒΝΡ的浓度信息。由于兔IgG抗体具有易获得、稳定期长、特异性好、敏感性高等优点，在发生特异性结合时能够稳定地发挥特定浓度下的显色水平，且不会对其他特异性反应产生干扰，因此成为本发明创造作为显色参比物的最佳选择。
[0035]检测时，将提取的血清样本平衡至室温，在样品垫上滴入被检样本，1min后观察T线、R线、C线的显色情况。C线显色，T线与R线出线颜色相同，表明样本中NT-proBNP等于900ng/L(见附图2a) ；C线显色，T线出线颜色弱于R线出线颜色，表明样本中的NT-proBNP水平在300-900ng/L之间(见附图2b) ;C线显色，T线出线颜色强于R线出线颜色，表明样本中的NT-proBNP大于900ng/L(见附图2c) ;C线、R线显色，T线不显色，表明样本中的NT-proBNP水平小于300ng/L(见附图2d) ;C线或R线不显色(见附图2e、2f、2g)，表明实验失败，需重新测试。
【权利要求】
1.一种氨基末端B型利钠肽前体免疫层析半定量检测试纸，包括硝酸纤维素NC膜，在所述硝酸纤维素NC膜一端依次向上搭接有胶体金垫、样品垫，在所述硝酸纤维素NC膜另一端向上搭接有吸水纸，所述胶体金垫上含有NT-proBNP标记抗体以及兔IgG标记抗体，所述硝酸纤维素NC膜在沿液体层析方向上依次包被有检测线、参比线以及质控线，所述检测线为与所述NT-proBNP标记抗体配对的NT-proBNP抗体，所述参比线为羊抗兔二抗，所述质控线为羊抗鼠二抗。
2.根据权利要求1所述的一种氨基末端B型利钠肽前体免疫层析半定量检测试纸，其特征在于:所述NT-proBNP标记抗体为胶体金标记的鼠抗人NT-proBNP单克隆抗体，检测线上与其配对的NT-proBNP抗体也为鼠抗人NT-proBNP单克隆抗体，二者分别识别NT-proBNP不同的表位，所述兔IgG标记抗体为胶体金标记的兔IgG抗体。
3.根据权利要求2所述的一种氨基末端B型利钠肽前体免疫层析半定量检测试纸，其特征在于:所述胶体金的颗粒大小为15-25nm。
4.根据权利要求1所述的一种氨基末端B型利钠肽前体免疫层析半定量检测试纸，其特征在于:所述胶体金垫是将540nm处OD值为1.2-1.4的NT-proBNP标记抗体溶液以及540nm处OD值为0.8-1.0的兔IgG标记抗体溶液以体积比1: 1.2混合后，以2.5 μ 1/mm的量点样而成。
5.根据权利要求1所述的一种氨基末端B型利钠肽前体免疫层析半定量检测试纸，其特征在于:所述硝酸纤维素NC膜中，检测线由1.5mg/ml的NT-pix)BNP标记抗体以0.0Olml/cm均勾划线而成；参比线由0.8mg/ml羊抗兔多克隆抗体以0.001ml/cm均勾划线而成；所述质控线由2.0mg/ml羊抗鼠多克隆抗体以0.001ml/cm均勾划线而成。
6.根据权利要求1所述的一种氨基末端B型利钠肽前体免疫层析半定量检测试纸，其特征在于:所述检测线、参比线以及质控线间的间隔为0.4cm ;所述胶体金垫距检测线间的间隔为 0.2-1.0cm0
【文档编号】G01N33/68GK204188623SQ201420672841
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月12日 优先权日:2014年11月12日
【发明者】岳晓燕, 魏金枝, 林涛 申请人:正元盛邦(天津)生物科技有限公司