专利名称：氨基末端脑钠肽的b细胞表位肽段及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医学领域，特别涉及心力衰竭的诊断技术。
背景技术：
心血管疾病是严重威胁人类生命和健康的重要疾病。其中，心力衰竭(HeartFailure, HF)作为严重危害人类健康的心血管疾病中的一种病理综合症，已不再被简单地看作是独立临床疾病，而是作为心血管疾病发展到后期的一个阶段，即从始发危险因子(高血压、高胆固醇血症、糖尿病)到左心室肥大、心肌细胞功能紊乱、冠心病、最后发展成为心力衰竭。有学者统计，心力衰竭患者一旦出现典型症状，5年存活率男性为25%，女性为38%，与恶性肿瘤病人相仿。2003年，中国心血管健康多中心合作研究组应用四阶段整群随机抽样方法，在中国10省市抽样调查，结果显示心衰患病率为O. 9%，随着年龄增高，心衰患病率显著上升。由于我国冠心病和高血压发病仍呈上升趋势，人口老龄化趋势明显， HF正成为我国心血管领域的重要公共卫生问题。在发达国家，约有7%的人群患有此病，目前也仅有2%的人被及时确诊。心力衰竭是大多数心血管疾病的最终归宿和最主要的死亡原因之一，呼吸困难是充血性心力衰竭(CHF)的主要症状，又是某些肺部疾病的主要临床表现，相互间鉴别比较困难，而在急诊工作中须在短时间内对呼吸困难做出正确诊断，因此，寻找一种敏感、快捷、准确的鉴别诊断方法对于急诊科医生来说是非常重要的，可以在很大程度上方便急诊科医生提高诊断的敏感性和特异性，并帮助判断病情的严重程度。或者在尚未出现明显“充血性”症状之前就着手干预治疗，从根本上防治HF，延缓HF发展进程，提高患者的远期存活率。从这个意义上来看，心力衰竭的早期诊断和治疗监测非常重要。然而，无论是在住院病人还是门诊病人，临床上用常规方法不但对HF的诊断方面存在困难，而且在分析治疗的结果时也不确定。如传统的心电图、超声心动图等检查方式，特异性和及时性都不够，而且传统的检查方式均不能对心肌损伤的长期影响进行评估，难以及时方便地指导患者的治疗。1988年日本学者Sudoh T等从猪脑内首次分离出一种与心房钠尿肽(Atrialnatriuretic peptide, ANP)功能相似的物质，即具有扩张血管、拮抗肾素-血管紧张素-醛固醇系统、抑制交感神经活性和促进尿钠排泄作用，虽然这一物质与ANP的分子结构相似，但其氨基酸组成和组织学分布存在差异，故将其命名为脑钠尿肽(Brain natriureticpeptide, BNP) 0目前，大量的研究已明确BNP是从其氨基酸前体蛋白(ρι·0-ΒΝΡ)中的羧基端裂解而来，是由心室细胞合成并分泌进入血液的32个氨基酸多肽，裂解同时产生76个氨基酸的无生物学活性的氨基末端脑钠肽(ΝΤ-ρι·οΒΝΡ)，二者来源相同并且等摩尔分泌。通过组织生理学研究发现，牵拉刺激、激素(如儿茶酚胺、血管紧张素、内皮素)分泌以及缺氧均能导致心肌细胞、心脏成纤维细胞分泌proBNP。从理论上讲，无论是检测BNP还是NT-proBNP,都可以反映体内心肌细胞受到的容量负荷和压力负荷的大小，均能够单独地预示左心室(LV)舒张末期压力增高的状况，能应用于充血性心力衰竭等相关疾病的鉴别诊断、疗效监测及预后评估。ΒΝΡ、ΝΤ-ρι·οΒΝΡ检测与肌钙蛋白、CK-MB和肌红蛋白不同，后三者是由于心脏损伤而释放的标志物，而血浆ΝΤ-ρι·οΒΝΡ水平在心脏功能代偿阶段即可明显升高，有利于更早发现心功能的异常。研究发现，BNP具有分子内的二硫键并且作为一种分析物不很稳定，其原因是由于BNP作为激素发挥生理功能，因而必须被迅速分解灭活。因此，它作为一种诊断标记的应用仅仅是有限的。而且BNP在血浆中含量较低，仅为7ng/L，而NT-pix)BNP的血浆含量平均值为41ng/L，后者对于区分健康个体和患有心力衰竭的患者，以及根据心力衰竭的严重程度对患者样本进行分级所需要的检测低限是足够的，可保证自动化实验室的样品常规测试得以实施。另外，NT-proBNP在血浆中的半衰期为120分钟，BNP的半衰期为22分钟，提示NT-proBNP更易进行免疫定量分析。目前认为，NT-proBNP成为检测HF的标准主要体现在以下几个方面①诊断症状性心力衰竭，用于急性呼吸困难的鉴别诊断；②诊断无症状性左室功能障碍，早期发现心衰病人判断心衰病人的危险分层，以判断是该入院还是出院检验心力衰竭的治疗·评估心力衰竭病人的预后评估急性冠脉综合征(ACS);⑦筛选慢性心衰高危人群；⑧作为猝死的标志物诊断舒张功能不全。罗氏诊断试剂公司(Roche Diagnostics, Inc)在美国和欧洲16个医学中心对2000多位健康和病患男女进行的临床研究，此项研究显示充血性心力衰竭症状的严重性与NT-proBNP的水平有关。2002年，国际上已经公认NT-proBNP是测定心衰的一个划时代的具有特异性的标志物。早期实验的研究对象多是急诊室呼吸困难、肺心病、心脏病患者，显示ΝΤ-ρι·οΒΝΡ与心衰具有很好的相关性，阳性预测值达到90% -95%，其阴性预测能力更具有价值。当急性心力衰竭出现左室充盈压增加的临床综合征以及如缺血、肺栓塞等任何导致肌细胞伸展的情形，检测ΝΤ-ρι·οΒΝΡ非常有益，同时对于鉴别呼吸困难是否为心源性原因具有重要意义，优于临床判断。另外，ΝΤ-ρι·οΒΝΡ还能辅助判断进展期心衰患者的预后，以及对左心室功能不全的治疗进行监测和指导。目前，基于NT-proBNP的心力衰竭试剂盒，仅有罗氏公司持有。灵敏度更高或成本更低的相关试剂盒急需开发。
发明内容
本发明的目的之一在于提供氨基末端脑钠肽B细胞表位肽段，其能作为氨基末端脑钠肽单克隆抗体的抗原。为实现上述技术目的，本发明的技术方案为氨基末端脑钠肽B细胞表位肽段，所述氨基末端脑钠肽B细胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示。上述氨基酸序列是通过如下手段获取的从NCBI Protein数据库中获取如SEQ ID NO :5所示的氨基末端脑钠肽蛋白序列；分别对氨基末端脑钠肽的蛋白的二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性、柔韧性以及可能的糖基化位点，对各区段进行分析评分，选取得分高的区域作为B细胞表位区域，其序列如SEQ ID NO4 或 SEQ ID N0:5 所示。所述的B细胞表位肽段化学合成中在其N端引入半胱氨酸，以提高其与BSA的交联能力，接着与BSA或KLH交联。将所述的B细胞表位肽段与载体蛋白BSA或KLH交联之后，不仅能增加抗原的大小，也能增强免疫性。本发明的目的之二在于提供一种杂交瘤细胞，其能特异性的分泌氨基末端脑钠肽的单克隆抗体。为实现上述目的，本发明的技术方案为所述的氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段制备的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞的制备是通过所述氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段与BSA或KLH交联后免疫Balb/c小鼠，取免疫后的小鼠脾细胞悬液并制备SP2/0细胞悬液(脾脏B淋巴细胞)，并与骨髓瘤细胞和融合，将融合细胞选择性培养，通过ELISA筛选后得到的杂交瘤细胞。将筛选出的最强阳性细胞进行克隆化培养，同时在克隆化培养的杂交瘤细胞中筛选出最强阳性化的杂交瘤细胞送于并送中国典型培养物保藏中心 (武汉大学保藏中心)保藏，保藏号为CCTCC NO C201288,其可稳定分泌所述单克隆抗体。本发明的目的之三在于提供所述一种特异性抗体，其可作为检测氨基末端脑钠肽抗原的试剂。同时，还提供含有上述抗体的试剂盒，该试剂盒可用于心力衰竭的诊断。所述的氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段制备的特异性抗体。所述特异性抗体为所述氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。作为优选的，所述杂交瘤细胞的生物保藏编号为CCTCC N0:C201288。基于诊断心力衰竭的双抗夹心ELISA试剂盒，由缓冲液、单克隆抗体、洗涤液、酶标抗体、TMB底物、终止液组成，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO C201288的杂交瘤分泌，所述酶标抗体为被辣根过氧化物酶标记的心力衰竭重组蛋白。本发明的目的之四在于提供三种新应用，该应用为心力衰竭的诊断提供了新的思路。为实现上述目的，本发明的技术方案为所述的氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段在制备心力衰竭的诊断试剂中的应用。所述的氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽为免疫原性多肽，其可被B细胞抗原受体(BCR)识别并结合，或与氨基末端脑钠肽抗原的抗体特异性识别并相互结合；所以，所述B细胞表位肽段可以制备成诊断试剂，用于检测标本中的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ抗原的特异性抗体含量，进一步判断是否为心力衰竭患者提供指标参数，同时对于鉴别呼吸困难是否为心源性原因具有重要意义，优于临床判断。另外，为辅助判断进展期心衰患者的预后，以及对左心室功能不全的治疗进行监测和指导提供检测基础。人氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段的特异性抗体在制备心力衰竭的诊断试剂中的应用。或人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ的B细胞表位肽段的特异性抗体的免疫复合物在制备心力衰竭的诊断试剂中的应用。所述氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段的特异性抗体或氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段的特异性抗体的免疫复合物，可用于免疫原及筛选原的检测，或建立氨基末端脑钠肽定量检测。当氨基末端脑钠肽的含量超过正常人的标准，氨基末端脑钠肽的含量可作为判定心力衰竭的判定辅助参数。本发明的有益效果在于本发明制备的氨基末端脑钠肽是高纯度的氨基末端脑钠肽单体重组蛋白，该蛋白可用于抗体制备的免疫原及筛选原，同时可以作为建立氨基末端脑钠肽定量检测时的校准品。通过氨基末端脑钠肽蛋白序列的B细胞表位肽段免疫小鼠制备的单克隆抗体具有纯度高(SDS-PAGE检测纯度> 96% )、效价高(ELISA效价达I 512000)、特异性好、可大批量制备等优点。氨基末端脑钠肽蛋白中B细胞表位肽段化学合成时在其N端引入半胱氨酸，提高了其与KLH或BSA交联率(> 50% )，可获得优质免疫原。通过本发明制备的单克隆抗体、多克隆抗体可用于患者血浆氨基末端脑钠肽含量的检测，如可采用“双抗体夹心”ELISA反应模式，即酶标记人抗氨基末端脑钠肽单抗、酶标板包被抗氨基末端脑钠肽多抗和被测样品氨基末端脑钠肽抗原形成“双抗体夹心”结构进行测定。
图I为I. 5%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，箭头显示为目的片段。图2为Western Blot鉴定NT-proBNP单克隆抗体的有效性，其中Control指对照蛋白；NT-proBNP (左)指上样量2. 5 μ g ；NT-proBNP (右)指上样量5 μ g。图3为Western Blot鉴定NT-proBNP多克隆抗体的有效性，其中NT-proBNP (左)为上样量10 μ g，NT-proBNP (右)为上样量5 μ g。
本发明中杂交瘤细胞株杂交瘤细胞株24-NT-proBNP送中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，保藏编号为CCTCC NO :C201288，地址位于中国武汉武汉大学，收到日期为2012年6月20日，存活检测日期为2012年6月27日，保藏的培养物名称为小鼠杂交瘤细胞。
具体实施例方式下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如分子克隆实验手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)和现代免疫学实验技术(沈关心周汝麟主编)中所述的条件或制造商建议的条件进行或配置，未注明来源的产品均可通过市场途径获得。实施例I重组NT-proBNP基因克隆从GenBank (登录号 NCBI Reference Sequence NM_002521. 2)获取人 NT-proBNP编码基因序列，将其提交于生物在线分析软件GCUA (Graphical codon usage analyzer,http://guca.schoedl.del)分析评价，并进行密码子偏嗜性改造优化。优化方式为把NT-proBNP蛋白在大肠杆菌中表达活性低于20 %的密码子同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子(在不进行密码子置换的情况下，也能实现相同功能)。SEQ ID No :I为从GenBank获取人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ编码基因核苷酸序列，下划线部分为GCUA分析结果显示在大肠杆菌中表达活性低于20%的密码子。cacccgctgggcagccccggttcagcctcggacttggaaacgtccgggttacaggagcagcgcaaccatttgcagggcaaactgtcggagctRcaRRtRRaRcaRacatccctRRaRcccctccaRRaRaRcccccRtcccacaRRtRtctRRaaRtcccgggag^tagccaccgagggcatccRtRRRcaccRcaaaatRRtcctctacaccctRCRRRcaccacRa经过密码子偏嗜性改造优化后的ΝΤ-ρι ΒΝΡ编码基因核苷酸序列，下划线部分为经过同义置换的密码子，SEQ ID No 2cacccgctgggcagcccgggtagcgccagcgacctggaaacgagcggcctgcaggagcagcgcaaccatctgcagggcaaactgagcgag
ctgcaggtggagcagaccagcctggagccgctgcaggagagcccgcgtccgaccggtgtctggaagagccgcgaggtggccaccgagggcatccgtggccaccgcaaaatggtcctgtacaccctgcgcgcaccgcgcNT-proBNP蛋白相应的氨基酸序列，SEQ ID No 3“His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly LeuGln Glu Gln ArgAsn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr SerLeu Glu Pro Leu Gln Glu SerPro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly lie Arg Gly His Arg Lys MetVal Leu Tyr Thr LeuArgAla Pro Arg，，(谷氨酰胺ginQ ;甘氨酸gly G ;丝氨酸ser S ;丙氨酸ala A ;苏氨酸thr T -M氨酸val V;异亮氨酸ile I ;亮氨酸leu L;酪氨酸tyr Y;苯丙氨酸phe F ;组氨酸his H；脯氨酸pro P ;天冬酰胺asn N ；甲硫氨酸met M ;谷氨酸glu E ;色氨酸trp W ;赖氨酸IysK;半胱氨酸cys C ;精氨酸arg R ;天冬氨酸Asp D)为进行有效表达及纯化，将序列SEQ ID NQ :2的5'-及3'-端分别添加限制性酶切位点Sal I>BamH I,其中BamH I酶切位点后加入-gatgatgatgataag-核苷酸序列，其编码的-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-氨基酸序列为肠激酶(EK酶)的识别位点。全序列委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行全基因合成。 实施例2重组pET42a-NT_proBNP质粒构建将pET42a载体与全基因合成序列亚克隆载体(详见实施例I)经Sal I、BamH
I酶切4小时，琼脂糖凝胶电泳回收，用T4DNA连接酶4°C过夜连接。将制备好的感受态DH5a菌200 μ L，冰浴，吸取I μ L连接产物加入管中，转化DH5a菌，轻拍混匀，冰浴30分钟，42°C水浴90秒，取出离心管再冰浴2分钟，加入800 μ L室温的2 X YT培养液混匀，37°C摇床220rpm振荡培养I小时，分别将50 μ L、200 μ L及剩下的全部转化菌涂于3个含卡那霉素抗性的2ΧΥΤ培养板上，37°C恒温培养箱过夜培养，次日挑去白素菌落接种于LB培养基扩大培养，用碱裂解法提取质粒，取质粒用Sal I、BamH I双酶切4小时，酶切体系为pET42a-NT-proBNP 质粒 DNA 10 μ 1，Sal I I μ I, BamH I I μ L, 10X 缓冲液 K 2 μ L，ddH206 μ L，并取酶切产物10 μ L行I. 5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见与设计值255bp —致的片段(图 I)。实施例3重组NT-proBNP蛋白诱导表达常规方法转化BL21 codon plus (DE3)工程菌，取重组pET42a_NT-proBNP质粒转化BL21 codon plus(DE3)菌，涂布于含氯霉素抗性与卡那霉素抗性的LB固体培养基，37°C培养箱过夜培养，次日挑取白色菌落接种于LB培养基扩大培养，培养温度30°C，测细菌OD值达0. 6 0. 8时加入终浓度为0. 6mmol/L的IPTG诱导表达4小时。培养后每克湿菌以10倍体积的PBS缓冲液(pH 7. 3)重悬，混匀后超声破菌，破菌完全后于4°C 10，OOOrpm离心15min，上清以0. 45 μ m微孔滤膜过滤。分别取上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白可溶性，未诱导的菌液和诱导3. 5小时的菌液分别做阴性和阳性对照，结果在上清中与阳性对照重组蛋白条带相对应的位置发现特异蛋白条带，目的蛋白分子量约为9kD，与预期pET42a-NT-proBNP的表达产物的分子量值相符,而沉淀无此蛋白条带,证实重组融合蛋白为可溶性表达，NT-proBNP表达产物约占细菌总蛋白质量的22%。实施例4重组NT-proBNP蛋白的纯化
转化pET42a-NT-proBNP重组质粒的工程细菌经O. 6mmol/L的IPTG诱导表达后使用 GSTrap F. F.初纯化，使用 GSTrap F. F.的结合缓冲液(20mmol/L sodium phosphate,O. 15M NaCl，pH7. 3)重悬后冰上超声破菌，4°C高速离心，留上清经过滤后用Amersham的AKTAprime上柱，平衡后用洗脱液(50mmol/L，Tris-HCl，10mmol/L还原型谷胱甘肽，pH8. O)洗脱，收集洗脱蛋白。将含目的蛋白的洗脱峰用His-结合缓冲液(20mmol/l, sodiumphosphate, O. 5M NaCl, pH7. 4)按I : 9的体积比稀释后上HisTrap HP再次纯化，His-结合缓冲液平衡后用His-洗脱缓冲液(20mmol/L sodium phosphate, O. 5M NaCl,0.5M咪唑，pH7. 4)，先体积分数为10%缓冲液洗脱去除非特异性结合的杂蛋白，平衡后用100%缓冲液将目的蛋白洗下。再用脱盐柱脱盐和去除咪唑，流动相缓冲为50Mm Tris-HCl，pH8.0。将获得的纯化重组蛋白用HiTrap Desalting置换缓冲体系为EK切割缓冲液(50mmol/LTris-HCl，pH8. 0)，按EK酶与蛋白I 1000的质量比加入带有His标签的EK酶，4°C低速摇床(60r/分钟)切割12小时左右。切割后用His-结合缓冲液稀释后HisTrap HP纯化，分别收集穿透峰、体积分数为10%缓冲液洗脱和100%缓冲液洗脱的蛋白，17. 5% SDS-PAGE电泳进行鉴定。pET42a-NT-proBNP表达的融合蛋白是以GST_NT-proBNP形式存在，经EK酶 切后得到ΝΤ-ρι·οΒΝΡ目的蛋白。实施例5重组NT-proBNP蛋白的浓度、纯度鉴定( 一 ) Lowry法(Folin-酹试剂法)测定NT-proBNP蛋白质含量Lowry法测定的试剂盒购于上海美季生物技术有限公司，试剂A : I) 10克Na2CO3, 2克NaOH和O. 25克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6 · 4H20)。溶解于500毫升蒸馏水中；2)0. 5克硫酸铜(CuSO4 · 5H20)溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份㈧与I份⑶混合，即为试剂甲。试剂B :在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠(Na2WO4 · 2H20)，25克钥酸钠(Na2MoO4 · 2H20)及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂(Li2SO4)，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至I升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水I倍，使最终的酸浓度为IN左右。标准蛋白质溶液精确称取结晶牛血清清蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/mL左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0. 9% NaCl溶液。详见下表
权利要求
1.氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段，其特征在于所述氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示。
2.根据权利要求I所述的氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段，其特征在于所述氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段偶联有载体蛋白BSA或KLH。
3.根据权利要求I所述的氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段，其特征在于所述氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段N末端引入半胱氨酸。
4.权利要求1-3任一项所述的氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段制备的杂交瘤细胞。
5.根据权利要求4所述的交瘤细胞，其特征在于所述杂交瘤细胞的生物保藏编号为CCTCC NO C201288o
6.权利要求I所述的氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段制备的特异性单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的特异性抗体，其特征在于所述特异性抗体为所述氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
8.权利要求I所述的氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段在制备心力衰竭的诊断试剂中的应用。
9.权利要求6所述的特异性抗体及特异性抗体的免疫复合物在制备心力衰竭的诊断试剂中的应用。
10.基于诊断心力衰竭的双抗夹心ELISA试剂盒，由缓冲液、单克隆抗体、洗涤液、酶标抗体、TMB底物、终止液组成，其特征在于所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO C201288的杂交瘤分泌，所述酶标抗体为被辣根过氧化物酶标记的氨基末端脑钠肽重组蛋白。
全文摘要
本发明属于医学领域，特别涉及心力衰竭的诊断技术，具体为氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段，氨基酸序列如SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示，其制备的特异性抗体可用于作为心力衰竭的诊断试剂；本发明制备的氨基末端脑钠肽是高纯度的氨基末端脑钠肽单体重组蛋白，该蛋白可用于抗体制备的免疫原及筛选原，同时可以作为建立氨基末端脑钠肽定量检测时的校准品。通过氨基末端脑钠肽蛋白序列的B细胞表位肽段免疫小鼠制备的单克隆抗体具有纯度高(SDS-PAGE检测纯度＞96％)、效价高(ELISA效价达1∶512000)、特异性好、可大批量制备等优点。
文档编号G01N33/577GK102887943SQ20121031512
公开日2013年1月23日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者黄洪涛, 石延宾, 姚静, 张宪, 胡伟, 魏勇 申请人:重庆业为基生物科技有限公司